宏基因組二代測序在疑難感染性疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值

韓思雨 綜述 劉建華 審校

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省兒童醫(yī)院呼吸二科，河北石家莊 050031）

感染性疾病是兒童常見疾病，病原診斷是其診治中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而常規(guī)病原檢測方法耗時(shí)長、陽性率低，難以滿足臨床需求。目前，宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在臨床病原診斷中應(yīng)用得越來越廣泛，尤其是疑難感染性疾病。此技術(shù)可適用于腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、痰、全血等標(biāo)本，其原理為采集樣本后，利用mNGS將樣本進(jìn)行測序前處理，并進(jìn)行核酸暴露，將病原體的核酸序列與指定的龐大生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，實(shí)現(xiàn)對病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲及非典型微生物等的全面檢測［1］。該文為mNGS在細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等感染中的診斷優(yōu)勢和臨床應(yīng)用價(jià)值的綜述，以便指導(dǎo)mNGS在臨床診斷中更好地應(yīng)用。

1 mNGS在細(xì)菌性感染中的應(yīng)用

細(xì)菌是感染性疾病中常見的病原體之一。當(dāng)感染嚴(yán)重時(shí)，細(xì)菌可播散入血引起膿毒癥。因此，早期明確感染病原體極為重要，常見的病原體檢測方法為涂片與細(xì)菌培養(yǎng)，此方法需要花費(fèi)較長的時(shí)間才可得出結(jié)果，并且，因培養(yǎng)需要一定的培養(yǎng)條件，所以，覆蓋病原體的范圍并不廣泛，對罕見細(xì)菌的檢測陽性率較低。

mNGS在細(xì)菌感染診斷中發(fā)揮重要作用。Zhang等［2］在細(xì)菌性腦膜炎患者中，以血液或BALF培養(yǎng)與肺炎鏈球菌抗體檢測結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)mNGS診斷細(xì)菌性腦膜炎的靈敏度、特異度分別為70.3%、93.9%，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值高達(dá)81.4%、91.3%。Huang等［3］研究顯示，在肺部感染性疾病中，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽性率為17.54%，而BALFmNGS陽性率為42.11%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者，其中最常見的病原體有結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）（n=19，26.39%）、銅綠假單胞菌（n=16，22.22%）、鮑曼不動桿菌（n=9，12.50%）和肺炎克雷伯菌（n=7，9.72%）。Xie等［4］研究發(fā)現(xiàn)在重癥肺炎患者中，mNGS組28 d（16.7%vs 37.7%，P=0.008）、90 d病死率（16.7%vs 42.3%，P=0.002）顯著低于未用mNGS組。Pan等［5］報(bào)道了1例誤診為結(jié)核性腦膜炎的病例，結(jié)核相關(guān)性檢查及CSF培養(yǎng)均陰性，臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎，并給予抗結(jié)核治療，患者并無好轉(zhuǎn)，最終行CSFmNGS發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌，根據(jù)結(jié)果更改治療后，患者恢復(fù)意識，病情好轉(zhuǎn)。以上研究［2-5］說明mNGS對細(xì)菌檢測的陽性率、準(zhǔn)確性較高。

MTB是一種特殊細(xì)菌，臨床上常見MTB檢測方法有：結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)、涂片抗酸染色、抗MTB抗體檢測、MTB聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)和MTB培養(yǎng)等方法。這些方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有局限性。結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)因受外界條件影響（如卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌感染）特異度較低；涂片抗酸染色因可使除MTB外的麻風(fēng)分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌等著色，肉眼很難分辨，具有一定的假陽性［6］；抗MTB抗體因所用的抗原為MTB，與非結(jié)核肺部疾病致病菌存在共有成分或有交叉的成分，其特異性及敏感性均較低；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)不能完全鑒別潛伏性結(jié)核感染及活動性結(jié)核感染［7］，且操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴［8］；MTB培養(yǎng)需要2～4周，時(shí)間較長［9］；MTBPCR的時(shí)效性優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)，但只能用于結(jié)核病的診斷和鑒別診斷，不能作為療效評估的指標(biāo)等。

而mNGS檢測的是病原體核酸序列，雖MTB是一種胞內(nèi)致病菌，細(xì)胞外游離DNA少，核酸序列提取困難［8，10］，但有研究顯示，mNGS在排除標(biāo)本污染的前提后，若檢測出至少1條屬水平的病原體序列，那就具有臨床意義［11］。有學(xué)者認(rèn)為，盡管mNGS所檢測出的MTB核酸序列少，但靈敏度較高。林愛清等［12］將疑似結(jié)核性腦膜炎患者的CSF進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及涂片，同時(shí)行mNGS檢測，發(fā)現(xiàn)mNGS靈敏度（58.8%）高于涂片及培養(yǎng)（29.4%），其特異度高達(dá)100%。Wang等［9］同樣采集結(jié)核性腦膜炎患者的CSF，進(jìn)行mNGS及傳統(tǒng)方法檢測（即培養(yǎng)、PCR、抗酸染色及Xpert MTB/RIF），同樣也發(fā)現(xiàn)mNGS靈敏度（66.67%）高于培養(yǎng)（8.33%），若mNGS與其他4種傳統(tǒng)方法相結(jié)合，檢測陽性率將提高到95.65%。mNGS不僅對CSF的MTB檢測靈敏度高，還對痰、BALF等標(biāo)本的MTB檢測具有重要意義。Jin等［8］發(fā)現(xiàn)mNGS（49.6%）與培養(yǎng)法（包括痰、BALF、肺組織及血液等）（35.2%）相比，前者對MTB檢測的靈敏度更高，也具有高特異性（98.3%），mNGS與培養(yǎng)檢測的一致性為56.8%，且mNGS在一些培養(yǎng)結(jié)果為陰性的樣本中也檢測到MTB序列，并且mNGS檢測靈敏度不低于Xpert MTB/RIF檢測法，可說明mNGS對于除CSF外的其他標(biāo)本檢測MTB的靈敏度仍較高。

當(dāng)臨床診斷為細(xì)菌感染病例，尤其為非胞內(nèi)致病菌感染［13］且病情危重患者，適用于mNGS檢測，應(yīng)早期積極采集標(biāo)本，行mNGS加以鑒別。在mNGS靈敏度較低的胞內(nèi)致病菌中，MTB具有相對較高的靈敏度及特異度，因此，若有疑似診斷中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)MTB感染時(shí)，有必要行mNGS輔助診斷。

2 mNGS在真菌性感染中的應(yīng)用

真菌感染具有危害性強(qiáng)、無典型臨床表現(xiàn)的特點(diǎn)，早期識別及診治仍主要依靠實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)的檢查。

2.1 曲霉菌感染

曲霉菌常見的檢測方法有：顯微鏡檢查、真菌培養(yǎng)、(1,3)-β-D-葡聚糖檢測試驗(yàn)（簡稱G試驗(yàn)）、血清半乳甘露聚糖抗原檢測（簡稱GM試驗(yàn)）及PCR檢測等，以上方法均有局限性。顯微鏡檢查缺乏特異性，不能準(zhǔn)確區(qū)分真菌的種類；真菌培養(yǎng)的敏感性較低，培養(yǎng)時(shí)間較長；G試驗(yàn)對于念珠菌等多種真菌感染均可表現(xiàn)為陽性，特異性差；GM試驗(yàn)因與其他真菌及β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物所殘留的青霉出現(xiàn)交叉反應(yīng)可導(dǎo)致假陽性［14］。賈建超等［15］研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)法檢測出的曲霉菌感染病例中，利用mNGS均能夠檢出曲霉菌；而在培養(yǎng)法未能檢測出曲霉菌感染病例中mNGS仍可檢測出曲霉菌，說明mNGS對真菌尤其曲霉菌的靈敏度較高；He等［16］報(bào)道了3例重癥肺炎患者，經(jīng)驗(yàn)性給予抗菌藥物治療效果欠佳，mNGS提示曲霉菌感染，調(diào)整抗感染治療后，患者病情明顯好轉(zhuǎn)，體現(xiàn)了mNGS對曲霉菌檢測的準(zhǔn)確性。

mNGS檢測曲霉菌靈敏度較高、檢測時(shí)間相對較短，當(dāng)感染病例中臨床表現(xiàn)符合真菌感染時(shí)，若其他常規(guī)真菌檢測結(jié)果陰性，而mNGS檢測結(jié)果提示曲霉菌感染，我們不妨試著按mNGS的結(jié)果選擇覆蓋曲霉菌感染的抗真菌藥物治療。

2.2 隱球菌感染

有研究認(rèn)為，mNGS檢測對隱球菌感染的確診具有一定臨床意義，無論是在CSF還是BALF中，均能夠早期識別隱球菌感染，并識別其種屬分型［17-18］。而費(fèi)笑非等［19］將檢測隱球菌感染的4種方法學(xué)（墨汁染色、培養(yǎng)、膠體金免疫層析法及mNGS）進(jìn)行對比，前3種方法的靈敏度依次為51.06%、79.31%、89.36%，mNGS的靈敏度（74.47%）相對不高，其中，未用抗真菌藥物治療的病例檢出隱球菌的靈敏度較高（86.2%），而已用抗真菌藥物治療后測得的靈敏度較低（50.0%）。因此，mNGS對隱球菌的檢出率較低，其原因可能為：（1）mNGS檢測閾值方面：目前仍未有一個(gè)mNGS閾值陽性的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，來確定隱球菌感染，即可能感染本身就是隱球菌感染，mNGS也檢測出了隱球菌，但因其檢測序列不高，則以污染的背景菌為由將其排除；（2）標(biāo)本方面：隱球菌本身細(xì)胞壁較厚，難以破壁，并且自取出標(biāo)本后，需要經(jīng)過較長時(shí)間才進(jìn)行檢測，此過程中還要經(jīng)過多次凍融，對標(biāo)本形成損害，再加上宿主細(xì)胞的干擾，可降低檢出率。Ji等［20］發(fā)現(xiàn)，利用0.025%的皂苷來選擇性地消耗人DNA，可提高隱球菌感染的檢出率；（3）mNGS檢測前應(yīng)用抗真菌藥物：有部分病例同上述研究［19］，取標(biāo)本前已長期應(yīng)用抗真菌藥物治療。

在臨床中，若患者有發(fā)熱、嘔吐、頭痛、腦膜刺激征等臨床表現(xiàn)或有慢性咳嗽、咳痰及胸部影像學(xué)表現(xiàn)為真菌感染時(shí)，并且有家禽、鳥類接觸史，疑似隱球菌感染者，可以使用mNGS鑒別，但鑒于mNGS對隱球菌檢測的低靈敏度，故不應(yīng)完全依賴于此。

3 mNGS在病毒性感染中的應(yīng)用

病毒感染的臨床表現(xiàn)形式各異，并且癥狀、體征較為典型。然而，病毒種類多，易變異，mNGS檢測可無偏倚性，可檢測出較多的病毒類型。Jerome等［21］在11例病毒感染患者中，利用血清抗體、鼻咽拭子等常規(guī)病毒相關(guān)檢測，檢測出5例病毒感染，然而，利用血mNGS檢測出8例陽性，其中有常規(guī)檢測未檢測到的病毒。Carpenter等［22］在明確含有至少1種病毒的50例血漿中，利用定量PCR核酸檢測與血mNGS檢測，一致率為89.2%，而mNGS檢測出而定量PCR未檢測出的病毒有24種。劉龍群等［23］報(bào)道了1例血流感染登革病毒的病例，有皮疹、黏膜出血等表現(xiàn)，個(gè)人史及輔助檢查均未見特殊表現(xiàn)，給予抗細(xì)菌和抗病毒藥物治療后效果欠佳，予血mNGS檢測，顯示登革熱病毒陽性，與疾病預(yù)防控制中心檢測結(jié)果一致。mNGS對病毒甚至罕見病毒，能夠?qū)崿F(xiàn)早期及時(shí)地辨別，有利于更早地切斷傳播途徑，以及對患者進(jìn)行更精準(zhǔn)的治療。

因此，mNGS對病毒的檢測具有較高的靈敏度，可作為常見病毒檢測的有效補(bǔ)充。然而，RNA病毒基因不穩(wěn)定，更容易變異，種類更多，不易創(chuàng)建RNA基因文庫。因此，臨床中若有疑似RNA病毒感染病例時(shí)，如甲型流感病毒、乙型流感病毒等，不可依賴mNGS進(jìn)行診斷。

對于mNGS的檢測，仍有一些病毒是特別的，即無明顯核酸的病毒，如西尼羅河病毒、水痘-帶狀皰疹病毒和神經(jīng)梅毒等，mNGS檢測效果不佳，原因在于以上病毒為小序列核酸病毒，而核酸序列小的病毒mNGS難以檢測［24］。因此，有些病原體雖然核酸序列小，但仍存在，這就提示我們對于核酸序列小的致病原是否可以考慮降低mNGS陽性檢測報(bào)告的門檻。

4 mNGS在罕見病原體感染中的應(yīng)用

某些罕見病原體具有傳染性強(qiáng)、毒力作用大的特性，需早期識別并及時(shí)治療、阻斷傳播，否則將造成極大危害。然而，這些病原體利用臨床上常用的檢測方法并不能早期、有效地識別，mNGS在此起著巨大作用。

4.1 耶氏肺孢子菌感染

耶氏肺孢子菌在臨床診斷中極其缺乏病原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。G試驗(yàn)、血清乳酸脫氫酶升高雖然無明顯特異性，但通常當(dāng)此2項(xiàng)檢測為陰性時(shí)，可作為肺孢子菌的排除依據(jù)。最近的研究［25］發(fā)現(xiàn)，血mNGS肺孢子菌的靈敏度（94.59%）及特異度（100%）均比G試驗(yàn)聯(lián)合血清乳酸脫氫酶（靈敏度89.19%，特異度56.0%）高，尤其是特異度。Wu等［26］通過mNGS檢測出29例耶氏肺孢子菌感染的患者，其中僅有8例通過Wright-Giemesa染色涂片檢測到。Xiao等［27］報(bào)道1例急性造血功能衰竭患者肺部感染耶氏肺孢子菌，在mNGS檢測之前利用傳統(tǒng)病原學(xué)方法未檢測出任何重要的病原，利用mNGS提供了有力的感染依據(jù)。

4.2 軍團(tuán)菌感染

尿抗原檢測和血清抗體檢測對于軍團(tuán)菌來說，特異性較高，但前者無法精確檢測出軍團(tuán)菌的分型，后者卻需要數(shù)周時(shí)間進(jìn)行血清抗體轉(zhuǎn)化。而杜秀芳等［28］、Huang等［29］報(bào)道了利用mNGS檢測出軍團(tuán)菌的病例，分別在BALF、關(guān)節(jié)液中檢測出不同分型的軍團(tuán)菌，前者為嗜肺軍團(tuán)菌，后者為米克戴德軍團(tuán)菌。因此，mNGS不僅能夠短時(shí)間內(nèi)檢測到軍團(tuán)菌的存在，而且也可檢測出其感染病原體的分型。

4.3 鸚鵡熱衣原體感染

Gu等［30］、Chen等［31］均報(bào)道了在鸚鵡熱衣原體肺炎的病例中，常規(guī)病原體檢測方法難以檢出，而利用BALFmNGS檢出鸚鵡熱衣原體，從而減少診斷的延誤，及早采用精準(zhǔn)的抗感染治療。

4.4 鉤端螺旋體感染

Wilson等［32］報(bào)道了1例患有嚴(yán)重免疫缺陷的14歲患兒，在4個(gè)月內(nèi)反復(fù)發(fā)熱、頭痛、抽搐，而常規(guī)的檢測甚至包括腦活檢等檢查均未查出感染病原體，利用mNGS在CSF中檢測到鉤端螺旋體之后，根據(jù)mNGS結(jié)果采取治療1月余后基本痊愈。

mNGS檢測時(shí)間短，能夠迅速精準(zhǔn)地檢測出某種罕見病原體的感染，為明確感染病原體提供一個(gè)較為準(zhǔn)確的方向，盡早采取正確的診療措施，減少病情遷延及治療拖延帶來的不必要的傷害，甚至可能省去包括活檢在內(nèi)的有創(chuàng)檢查。

5 mNGS的應(yīng)用價(jià)值

（1）在混合感染方面，因其無偏倚性，多種病原體的檢出率高于常規(guī)培養(yǎng)及涂片、PCR等檢測，可檢測出常規(guī)無法測得的其他病原體甚至罕見病原體［15，25，33］；（2）特異度普遍較高，準(zhǔn)確性也相對較高；（3）mNGS在檢測細(xì)菌、病毒、真菌及其他病原體時(shí)，相對于傳統(tǒng)方法而言，可檢測出病原體的分型；（4）mNGS檢測時(shí)間短于傳統(tǒng)培養(yǎng)。

6 mNGS的局限性

（1）在mNGS中，檢測病原體并沒有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的閾值，易導(dǎo)致不同人做出的試驗(yàn)，其陽性率不同［15］；（2）mNGS既可檢測病原體的DNA序列，也可檢測RNA序列，只有二者同時(shí)檢測，方可全面檢測出患者所感染的病原體。然而，因mNGS檢測價(jià)格昂貴，臨床醫(yī)師會根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、影像學(xué)診斷及經(jīng)驗(yàn)性治療，來決定是否應(yīng)用mNGSDNA檢測、RNA檢測。因此，在臨床上可能會出現(xiàn)僅僅行mNGSDNA檢測，而未作mNGSRNA的檢測，從而漏檢了某些感染病毒，此將會影響該技術(shù)的檢出率［33］；（3）mNGS仍存在一定的假陽性、假陰性；（4）mNGS并不是測序數(shù)量越大，其為致病病原體的可能性越大，也要與臨床表現(xiàn)、經(jīng)驗(yàn)性治療及常規(guī)病原學(xué)檢測相結(jié)合，來決定所得出的病原體是否具有真正的致病性［27］。

7 展望

對于各個(gè)系統(tǒng)感染性疾病的診斷，mNGS技術(shù)仍是一個(gè)未來發(fā)展的方向。目前，mNGS在感染性疾病診斷中已經(jīng)起著相當(dāng)重要的作用，尤其對于罕見病原體感染，但mNGS仍有很多方面需要進(jìn)一步完善與提高，如對不同感染病原體的序列診斷閾值標(biāo)準(zhǔn)的確定、耐藥菌基因的檢測及背景菌與致病菌的鑒別等。相信隨著mNGS技術(shù)的提高，這一系列問題將被慢慢地攻克，使得此技術(shù)更準(zhǔn)確、更廣泛地應(yīng)用于臨床感染性疾病中，以幫助臨床醫(yī)師采取更精準(zhǔn)的治療，縮短病程，減少患者痛苦。