探討青霉素類抗生素的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)

徐慧麗

（內(nèi)蒙古常盛制藥有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010200）

0.引言

抗生素在人類史上的使用十分廣泛，解決了各類感染問題，降低了人們的痛苦程度，尤其是青霉素類的抗生素，在醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用效果顯著，廣受醫(yī)患青睞。因此，加大對(duì)青霉素類抗生素技術(shù)研發(fā)，可帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，為臨床疾病治療提供新思路。通過優(yōu)化青霉素類抗生素的工業(yè)生產(chǎn)工藝，能夠?yàn)榍嗝顾仡惪股厣a(chǎn)和應(yīng)用提供保障，并進(jìn)一步豐富青霉素類生物制藥工藝?yán)碚搩?nèi)容。

1.青霉素和抗生素相關(guān)內(nèi)容分析

1.1 青霉素

青霉素屬于抗菌素，是重要的β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要來源于發(fā)酵液提取等發(fā)酵工藝生產(chǎn)，在不同菌種培養(yǎng)條件下得到的一種化學(xué)物質(zhì)，具有殺菌作用，尤其對(duì)革蘭氏陽性菌有效，就青霉素理化性質(zhì)看，具有穩(wěn)定性好、溶解度高、降解反應(yīng)快等特征，青霉素在醋酸乙酯、丙酮、等有機(jī)溶劑中的溶解度較小。在酸堿等物質(zhì)分解作用下，會(huì)降低活性，發(fā)生分子重排的現(xiàn)象，整個(gè)過程中發(fā)生了一定的降解反應(yīng)觀察青霉素在發(fā)酵環(huán)境中的成長(zhǎng)過程發(fā)現(xiàn)，分為多個(gè)成長(zhǎng)階段，各個(gè)階段也有一定的差異性。整個(gè)成長(zhǎng)過程需要經(jīng)歷7個(gè)階段，第一階段，主要是萌發(fā)孢子，生成芽管；第二階段，開始繁殖菌絲；第三階段開始形成脂肪包涵體，具有較強(qiáng)的嗜堿性；第四階段，脂肪包涵體開始變小，進(jìn)入抗生素生產(chǎn)階段；第五階段，脂肪包涵體消失，也是青霉素生產(chǎn)產(chǎn)量最高的階段，在此階段，應(yīng)用科學(xué)合理的工業(yè)技術(shù)，可進(jìn)一步提高青霉素的產(chǎn)量；第六階段，出現(xiàn)個(gè)別的自溶細(xì)胞，開始釋放游離氨第七階段，菌絲全部自溶[1]。就青霉素的應(yīng)用情況看，大量臨床研究表明，青霉素可用于溶血性鏈球菌感染、炭疽、破傷風(fēng)、放線菌、流行性腦脊髓膜炎等感染治療中。

1.2 抗生素

抗生素是次級(jí)代謝的產(chǎn)物，在低濃度下可殺滅腫瘤細(xì)胞，藥理作用顯著，具有抗細(xì)菌感染、抗病原蟲、刺激植物生產(chǎn)等重要作用，現(xiàn)階段，臨床上廣發(fā)應(yīng)用抗生素用于疾病治療中，抗生素生產(chǎn)來源主要是依托微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)生物合成，從分類上看依次為青霉素、頭孢菌素類、碳霉素類、萬古霉素等。按照抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理分類看，可分為（1）β-內(nèi)酰胺類：如青霉素類、頭孢菌素；（2）四環(huán)素類：小諾霉素、土霉素、力霉素類等；（3）氯霉素類：甲砜霉素、氯霉素等；（4）大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、磷霉素、利福平等。

研究青霉素抗生素生產(chǎn)背景發(fā)現(xiàn)，青霉素在全球范圍內(nèi)的銷量較大，此類抗生素具有高效、低毒等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，在臨床上的應(yīng)用價(jià)值較高，青霉素類抗生素的研制，大大提高了抵抗細(xì)菌性感染的能力，為青霉素類抗生素的研發(fā)夯實(shí)了基礎(chǔ)。青霉素最早是由英國(guó)一位學(xué)家發(fā)現(xiàn)的，在培養(yǎng)葡萄球菌的雙蝶上發(fā)現(xiàn)了青霉，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定和試驗(yàn)分析，最終將青霉定義為青霉素，為青霉素研究進(jìn)展提供了先決條件。之后，由英國(guó)Florey對(duì)青霉菌展開了進(jìn)一步的研究，利用培養(yǎng)液對(duì)青霉菌進(jìn)行培養(yǎng)，并用于臨床中進(jìn)行試用，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用效果顯著、毒性較小，對(duì)革蘭氏陽性菌產(chǎn)生了抑制作用，相關(guān)研究學(xué)者在此基礎(chǔ)上，對(duì)青霉素類抗生素展開了進(jìn)一步的研究，并致力于研發(fā)提取青霉素的生產(chǎn)工藝，保證青霉素的產(chǎn)量，更好滿足臨床應(yīng)用需求。

2.探究青霉素類抗生素工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)

2.1 生產(chǎn)菌種

發(fā)酵生產(chǎn)過程中，將產(chǎn)黃青霉菌作為生產(chǎn)菌種，主要借助誘變育種的方法進(jìn)行生產(chǎn)，確保最終獲取到高產(chǎn)量的菌株，為保證生產(chǎn)產(chǎn)量，需要優(yōu)選產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)的生產(chǎn)菌種。同時(shí)，避免出現(xiàn)菌種衰退的情況，前期準(zhǔn)備過程中，為生產(chǎn)菌種提供了冷凍干燥環(huán)境，一般會(huì)將生產(chǎn)菌種放置于0℃～4℃的恒溫環(huán)境中，或保證生產(chǎn)菌種是處于休眠狀態(tài)下的，使用時(shí)將其取出，使用后，繼續(xù)放回上述環(huán)境條件中。在生產(chǎn)過程中，操作人員需要嚴(yán)格按照生產(chǎn)菌種的使用年限等相關(guān)要求對(duì)其進(jìn)行純化處理，密切關(guān)注是否出現(xiàn)變異菌落，并及時(shí)將變異的菌落淘汰掉，從而控制生產(chǎn)菌種的衰退。

2.2 制備孢子

制備孢子是青霉素類抗生素發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵，相關(guān)操作人員必須提升對(duì)此道工序的重視程度，在具體操作中，將預(yù)先保存的孢子取出，放置于培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有葡萄糖、甘油等成分，進(jìn)而促使孢子活化。同時(shí)，為保證孢子制備符合青霉素類抗生素發(fā)酵工藝標(biāo)準(zhǔn)，必須為孢子制備創(chuàng)造良好的制備環(huán)境，試驗(yàn)中，將制備穩(wěn)定控制在25℃左右，連續(xù)培養(yǎng)1周左右，待到培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束，觀察是否得到單菌落，并繼續(xù)進(jìn)行斜面培養(yǎng)，為保證培養(yǎng)效率和質(zhì)量，需在上述環(huán)境條件下，再培養(yǎng)6d～8d，待培養(yǎng)結(jié)束后，可得到斜面孢子[2]。完成上述操作后，將制備得到的孢子轉(zhuǎn)移至含有大米的培養(yǎng)基上，孢子提供優(yōu)質(zhì)的生長(zhǎng)條件，為滿足孢子生長(zhǎng)需要，科學(xué)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)溫度，將溫度控制在25℃，待生長(zhǎng)1周后，可獲得大米孢子。為更好獲得大米孢子具體情況，對(duì)制備出的大米孢子進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，重點(diǎn)檢測(cè)其雜菌指標(biāo)，并得出相關(guān)的數(shù)據(jù)，便于為后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

2.3 制備種子

種子的制備主要目的是為了加快孢子發(fā)芽和繁殖速度，進(jìn)而在發(fā)酵成長(zhǎng)期間，得到大量的菌絲。在實(shí)際培養(yǎng)種子過程中，提供了優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)基環(huán)境，培養(yǎng)基中含有碳源、有機(jī)氮源等，從而滿足種子制備需要，盡可能產(chǎn)出大量?jī)?yōu)質(zhì)的菌絲體。整個(gè)操作過程中，采用的青霉素三階段發(fā)酵辦法，一階段主要是將上述制備好的大米孢子裝入發(fā)芽罐中，促使孢子萌發(fā)，為產(chǎn)出健壯的菌絲提供基礎(chǔ)條件。為孢子提供含有玉米漿、玉米油等物質(zhì)的培養(yǎng)基，保證培養(yǎng)成分內(nèi)容豐富，更好滿足大米孢子培養(yǎng)需要。為充分發(fā)揮培養(yǎng)基的作用，會(huì)將培養(yǎng)基成分充分的攪拌，將攪拌的時(shí)間控制在1h內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速在320～340轉(zhuǎn)每分鐘，將溫度控制在27℃～28℃。完成一階段的培養(yǎng)后，順利進(jìn)入第二階段的培養(yǎng)，主要使用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，目的在于大量繁殖菌絲，提供了含有葡萄糖和玉米漿的發(fā)酵罐，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在240～260轉(zhuǎn)每分鐘，將溫度控制在25℃，持續(xù)發(fā)酵時(shí)間在12h～15h左右。完成第二階段的發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)入到第三階段的培養(yǎng)，同樣使用發(fā)酵罐進(jìn)行繁殖，提供含有尿素、苯乙酰胺、硫酸銨等物質(zhì)成分的發(fā)酵罐，由于青霉素發(fā)酵受溶氧影響較大。因此，為保發(fā)酵效果，操作人員對(duì)通氣比（0.8～1.5）進(jìn)行控制，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在140～180轉(zhuǎn)每分鐘，切實(shí)為第三階段青霉素類抗生素發(fā)酵生產(chǎn)提供適宜的溫度條件，以及優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵環(huán)境[3]?？股厣锖铣蛇^程復(fù)雜，容易受到多種因素的影響，基于此，在具體的實(shí)驗(yàn)操作中，操作人員對(duì)整個(gè)發(fā)酵工藝過程中進(jìn)行管控，嚴(yán)格按照工藝工序步驟進(jìn)行操作，避免出現(xiàn)人為操作失誤的情況，保證青霉素類抗生素發(fā)酵整個(gè)生產(chǎn)過程客觀可行。

2.4 提煉青霉素工藝

青霉素提煉工序環(huán)節(jié)主要是采取化學(xué)提煉方式，目的在于提高青霉素的提取精度和純度，保證青霉素成品質(zhì)量。因此，在制備青霉素類抗生素發(fā)酵液過程中，要充分保證發(fā)酵液的純潔度，及時(shí)清除發(fā)酵液中的雜質(zhì)和以及產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物。提煉人員在具體提煉過程中，始終秉持快速、低溫、pH適中、勤清洗和消毒原則，并嚴(yán)格按照青霉素的提純工藝步驟進(jìn)行操作。在青霉素提煉環(huán)節(jié)主要應(yīng)用到溶媒萃取法、沉淀法等工藝方法，均取得了一定的提煉成效，發(fā)揮了不同工藝方法的優(yōu)勢(shì)作用，順利完成青霉素提取作業(yè)。就青霉素提煉具體工藝過程進(jìn)行分析如下：

2.4.1 預(yù)處理

整個(gè)發(fā)酵生產(chǎn)過程中密切關(guān)注每一階段的發(fā)酵情況，待青霉素發(fā)酵結(jié)束后，為保證提取純度和精度，相關(guān)人員對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，主要是將發(fā)酵液中的雜質(zhì)去除干凈，進(jìn)而達(dá)到濃縮產(chǎn)物的目的。通過去除發(fā)酵液的雜質(zhì)，可改變發(fā)酵液的流變學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)分離純化提供基礎(chǔ)條件，便于順利進(jìn)入下一個(gè)工序中。

2.4.2 過濾

過濾工序主要是對(duì)預(yù)處理得到的發(fā)酵液進(jìn)行再次優(yōu)化，具體操作中，在發(fā)酵液中加入一定量的絮凝劑沉淀蛋白，利用真空轉(zhuǎn)鼓進(jìn)行過濾，主要是將菌絲體和部分的蛋白過濾干凈。由于青霉素具有易降解的特征，因此，為保證過濾收率，將發(fā)酵液溫度冷凝到零下10℃以下，此溫度條件下的過濾收率能夠達(dá)到90%。在具體的過濾工序中，對(duì)于長(zhǎng)度在10m左右的菌絲體，主要使用鼓式真空過濾機(jī)進(jìn)行過濾操作，將得到的餅狀濾渣刮下來，保證濾液的pH值在6.25～7.2左右，若蛋白質(zhì)含量過高，超出0.05%～0.2%范圍，必須再次過濾蛋白質(zhì)，直至滿足過濾標(biāo)準(zhǔn)[4]。為充分改善預(yù)處理后的發(fā)酵液屬性，操作人員將硫酸pH調(diào)節(jié)到4.4～5.1，并加入適量的溴代十五烷吡啶，并摻入適量的硅藻土，有效改善了過濾效果，保證了蛋白質(zhì)的去除效果。完成上述所有操作后，借助板框式的過濾機(jī)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行再次過濾，并進(jìn)入萃取工序。

2.4.3 萃取和脫色

萃取青霉素工藝環(huán)節(jié)，使用的是溶媒萃取技術(shù)，主要是根據(jù)青霉素溶于有機(jī)溶劑且青霉素易溶于水這一性質(zhì)，為青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中提供了酸性條件，通過調(diào)節(jié)pH，再將青霉素轉(zhuǎn)入pH適中的水相中，經(jīng)過反復(fù)多次萃取操作，萃取到高純濃縮的青霉素。完成萃取工序后，使用活性碳物質(zhì)，將萃取得到的青霉素進(jìn)行過濾，去除色素。

2.4.4 結(jié)晶

為保證抗生素的結(jié)晶效果，操作人員通過改變溫度的方式進(jìn)行操作，主要是根據(jù)青霉素類抗生素隨溶解度溫度變化而變化的屬性完成結(jié)晶的。同時(shí)，應(yīng)用到等電點(diǎn)結(jié)晶的工藝方式，將青霉素溶液pH調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)后，此時(shí)，青霉素在水溶液中的溶解度是最小的，經(jīng)過沉淀后，可析出結(jié)晶。

2.5 檢驗(yàn)成品

在青霉素類抗生素生產(chǎn)過程中，廣泛使用生物合成法，實(shí)踐應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，此種方法難以滿足提取純度要求，尤其在生物合成過程中，會(huì)產(chǎn)生藥效差異物質(zhì)，不利于成品加工制作，在存儲(chǔ)或運(yùn)輸過程中，會(huì)引起抗生素編制。基于此，為保證青霉素類抗生素藥品質(zhì)量及用藥安全，加強(qiáng)對(duì)青霉素類抗生素成品檢驗(yàn)，顯得尤為重要。在具體檢驗(yàn)中，主要對(duì)青霉素類抗生素形狀進(jìn)行試驗(yàn)，檢驗(yàn)藥品是否達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)，做好效價(jià)測(cè)定和水分測(cè)定，切實(shí)保證青霉素類抗生素藥品質(zhì)量，確保安全進(jìn)入藥品市場(chǎng)中。

3.優(yōu)化青霉素類抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝路徑

3.1 做好發(fā)酵過程中的滅菌工作

由于青霉素類抗生素本身具有β-內(nèi)酰胺性質(zhì)，若β-內(nèi)酰胺被破壞，將影響發(fā)酵效果，甚至造成β-內(nèi)酰胺失效?；诖?，必須做好青霉素類抗生素發(fā)酵滅菌工作，避免實(shí)施高壓滅菌手段，盡可能在無菌模式下完成操作，可應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，確保青霉素在真空條件下有效將水分去除，進(jìn)而保證青霉素制備質(zhì)量。就冷凍干燥技術(shù)原理看，主要是將含有水分的物料進(jìn)行降溫，促使物料達(dá)到冰點(diǎn)，并將直接升華，將水蒸氣去除掉，進(jìn)而得到干燥的產(chǎn)物，技術(shù)性能顯著，主要是在升華作用下去除水分，有效保證了產(chǎn)品的干燥程度。就冷凍干燥技術(shù)在青霉素?zé)o菌操作中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)看，由于青霉素是在低溫真空狀態(tài)下進(jìn)行干燥的，因此，有效控制了分解率，保證了青霉素的純度，在凍結(jié)青霉素過程中，可保持青霉素原體積，并在遇水后快速溶解，可還原藥物原有性質(zhì)。整個(gè)操作過程中，滿足無菌操作標(biāo)準(zhǔn)，減少對(duì)青霉素的污染，有效控制了青霉素發(fā)酵產(chǎn)生的異物，顯著改善了藥溶解性能，提高了青霉素提取純度[5]。另外，將冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用在青霉素干燥中，解決了藥物制劑不穩(wěn)定性問題，避免制劑粒子發(fā)生沉降絮凝現(xiàn)象，可保持青霉素類抗生素制劑在分散的狀態(tài)下，減少藥物粒度同時(shí)，改善藥物的溶解性能，最大程度上保證青霉素發(fā)酵滅菌效果，制備效果顯著。

3.2 加強(qiáng)對(duì)發(fā)酵工藝的控制

青霉素類抗生素在發(fā)酵過程中，存在基質(zhì)量濃度過高的情況，對(duì)葡萄糖、苯乙酸生長(zhǎng)進(jìn)行抑制，但在基質(zhì)濃度下降后，限制了菌絲的生長(zhǎng)，尤其在分批發(fā)酵過程中，此種現(xiàn)象尤為顯著。因此，必須加強(qiáng)對(duì)發(fā)酵工藝的控制，可采取分批補(bǔ)料操作的方法解決上述問題，將基質(zhì)量濃度控制到標(biāo)準(zhǔn)濃度。

4.結(jié)語

為提高青霉素類抗生素產(chǎn)量，必須加強(qiáng)工業(yè)技術(shù)研發(fā)，加大對(duì)生產(chǎn)工藝的研發(fā)力度和創(chuàng)新力度，切實(shí)優(yōu)化青霉素類抗生素工業(yè)技術(shù)水平，更好地優(yōu)化青霉素類抗生素制備、提取等工藝環(huán)節(jié)，切實(shí)保證成品的制備質(zhì)量，持續(xù)推進(jìn)青霉素類抗生素的技術(shù)研究進(jìn)程。