基于TLR9/MyD88信號通路探討針刺干預(yù)運動損傷炎癥反應(yīng)的研究進展*

周榮杰，高 明，王強梅，李 慧，李少雄

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

骨骼肌在長時間、超負荷的運動刺激下會不斷產(chǎn)生新的生物適應(yīng)性,從而使得力量性、協(xié)調(diào)性不斷提高。正常、適度的運動一般不會對骨骼肌產(chǎn)生負面作用，但在競技體育運動中，運動員為了提高個人競技水平，不得不長期進行重復(fù)性、高強度訓(xùn)練，以保持良好的競技狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)長時間、大強度或非習慣性離心運動會造成骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷（Exercise-induced muscle dam‐age,EIMD），出現(xiàn)不同程度的延遲性肌肉酸痛（Delayed onset muscle soreness,DOMS）[1,2]。雖然運動損傷可以通過及時的休息得以緩解，但如果組織休息不充分，或已超過了肌肉本身的代償應(yīng)激能力，則可能導(dǎo)致?lián)p傷不斷疊加，深層發(fā)展，形成不同程度的炎性粘連、炎性纖維組織增生等病理性改變，最終引起不可逆的組織變性[3,4]。這也是目前很多運動員傷病反復(fù)發(fā)作一個重要因素，因此早期必要的干預(yù)和糾正就顯得十分重要。運動損傷后首先會在局部觸發(fā)炎性細胞和促炎因子浸潤。炎癥反應(yīng)與骨骼肌修復(fù)重塑、DOMS、線粒體自噬凋亡等均關(guān)系密切，但持續(xù)、過度的炎癥反應(yīng)也會加劇組織損傷。目前對于運動損傷后促炎因子發(fā)生機制仍缺乏全面認識。TLR9/MyD88 作為介導(dǎo)機體各類細胞損傷后炎癥反應(yīng)的一個重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與很多炎性因子表達都有直接和間接關(guān)系,且通常都以mtDNA 作為配體激活[5]。骨骼肌在損傷過程中，泄露的線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）可能會被TLR9 捕獲，通過髓樣分化因子88(myeloid differ‐entiation factor 88,MyD88)激活下游信號途徑，增加白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎細胞因子的表達[6]。

針灸作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)一種操作簡便的外治法，臨床上展現(xiàn)出良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，在干預(yù)運動損傷的療效明顯優(yōu)于其他療法。但針刺究竟如何抑制運動損傷后一系列炎癥反應(yīng)，能否將TLR9/MyD88信號通路作為針刺干預(yù)和糾正骨骼肌損傷后過度炎癥反應(yīng)的新靶點，仍需要進一步研究。本文就綜合目前國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究成果，探究針刺對TLR9/MyD88 信號通路的影響，以期針刺在治療運動損傷炎癥反應(yīng)的臨床應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 炎癥反應(yīng)對運動性損傷的影響

運動性損傷后，炎癥反應(yīng)是必然發(fā)生的過程，參與骨骼肌損傷修復(fù)的病理進程。甚至在運動結(jié)束后即刻便檢測到骨骼肌中TNF-α 和IL-6表達明顯上升，并且能夠維持較長時間[7]。但炎癥反應(yīng)也是一把“雙刃劍”。從傳統(tǒng)意義上講，骨骼肌損傷后早期出現(xiàn)的炎性因子具有吞噬、清除作用，為組織修復(fù)、再生創(chuàng)造適宜環(huán)境；但通常炎癥反應(yīng)期較長，機體可能通過增加局部bFGF 蛋白濃度來促進成纖維細胞增殖，使結(jié)締組織增生形成細小疤痕組織來修補損傷區(qū)域，則會導(dǎo)致肌肉收縮性下降，增加運動再損概率[8,9]。因此對于輕、中度骨骼肌損傷，持續(xù)過度的炎癥反應(yīng)缺乏必要性。

1.1 炎癥反應(yīng)的正性作用

炎性細胞因子被認為在肌肉修復(fù)再生中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[10]。急性高強度運動后，局部出現(xiàn)腫脹、充血，甚至肌組織壞死、降解，隨后中性粒細胞、巨噬細胞及大量炎性因子的浸潤。骨骼肌具備強大的再生能力，輕、中度損傷經(jīng)過一系列清除、修復(fù)、重塑等過程，能夠最大程度恢復(fù)到其本身的結(jié)構(gòu)功能。在這個過程中，損傷局部浸潤的炎癥細胞和促炎因子便發(fā)揮著極其重要的作用：一方面炎性細胞能夠吞噬壞死的肌肉組織和損傷的細胞碎片，為組織再生創(chuàng)造良好的環(huán)境；另一方面炎癥反應(yīng)過程中所分泌生長因子通過激活靜息狀態(tài)下的肌衛(wèi)星細胞，使其增殖形成新的肌管細胞，進而發(fā)育成肌纖維修復(fù)損傷的肌纖維，完成肌肉的再生過程[11,12]。

大部分炎性細胞因子存在網(wǎng)絡(luò)型的結(jié)構(gòu)作用機制，但彼此在功能也能單獨發(fā)揮效應(yīng)。比如IL-6 具有強烈促炎作用，在運動后EIMD 損傷修復(fù)、DOMS 等許多方面均發(fā)揮重要作用[13]；TNF-α作為損傷早期表達的促炎細胞因子，在啟動抗炎反應(yīng)過程發(fā)揮至關(guān)重要的作用，通過刺激血管內(nèi)皮細胞表達粘附因子，刺激單核吞噬細胞和嗜中性粒細胞趨化作用，引起白細胞在炎癥部位聚集，是目前炎癥反應(yīng)最重要的指標之一[14]；L-1β作為IL-1 的一種存在形式，又稱淋巴細胞刺激因子，可以促進炎癥、對抗入侵的病菌等，具有免疫調(diào)節(jié)功能[15]。

1.2 炎癥反應(yīng)的負性作用

DOMS 一直是影響運動員訓(xùn)練和比賽的重要因素之一。近年來對DOMS 形成機制一直存有爭議，目前普遍認為DOMS 形成與離心收縮誘導(dǎo)的肌肉損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)[16]。研究者通過讓受試者作肘曲離心收縮運動,發(fā)現(xiàn)口服非固醇類抗炎性藥物的受試者運動后的肌肉酸痛感較對照組輕的多，提示急性運動損傷炎癥反應(yīng)與DOMS的發(fā)生存在關(guān)系[17]。另一組人體實驗也證實，在對參與離心運動的志愿者服用堅果混合飲料后，檢測體內(nèi)炎癥因子表達明顯降低，與對照組相比炎癥水平高低與DOMS 癥狀輕重存在正相關(guān)[18]。

此外，部分炎癥反應(yīng)分泌物可以引起局部毛細血管擴張，血管通透性增強，加速炎性物質(zhì)滲出[19]。由于血管擴張、組織液滲出使得肌肉充血水腫，進一步會加劇組織損傷程度。研究還發(fā)現(xiàn)部分炎性因子，如IL-1β 能夠與游離感覺神經(jīng)元響應(yīng)受體結(jié)合，引發(fā)痛覺過敏，產(chǎn)生痛感[20]。在一項通過高強度運動來造成小鼠運動損傷模型的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)毛細血管生成素發(fā)揮其抗炎和抗氧化作用能明顯減輕運動誘導(dǎo)的肌肉損傷[21]，并且之后研究還發(fā)現(xiàn)毛細血管生成素還是通過抑制上游MyD88 及下游N F-κB 信號級聯(lián)發(fā)揮其抗炎、抗痛覺過敏作用[22]。這說明可以通過減輕炎癥反應(yīng)來達到保護肌肉組織的目的，也反過來證實炎癥反應(yīng)可以引起肌肉組織損傷加劇。

2 TLR9/MyD88信號通路

Toll 樣受體（Toll-like receptors,TLR）家族屬于一類表面模式識別受體，在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，以抵抗外來病原微生物的入侵，維持機體自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。TLR9 屬于Toll 家族目前已發(fā)現(xiàn)的10位成員之一，其表達于胞內(nèi)細胞器，如內(nèi)體和吞噬溶酶體。TLR9 是第一個被證明能夠感知核酸的TLR 受體，它可以識別內(nèi)溶酶體室DNA 中低甲基化的CpG 基序，進而觸發(fā)MyD88依賴或非依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，釋放促炎癥細胞因子和誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素活化[23]。

MyD88 依賴性信號通路存在多條轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MyD88 作為TLR 家族介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性接頭蛋白，當機體遭遇細菌、病毒、真菌感染等外源性侵害時，損傷的線粒體會泄露mtDNA，通過TLR9 激活巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞，并招募MyD88，促進這些免疫細胞的p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）磷酸化，使機體產(chǎn)生特異性抗體，來抵御病原微生物的入侵[24]。同時機體一些自身應(yīng)激損傷也會導(dǎo)致線粒體釋放出mtDNA 與TLR9 結(jié)合，TLR9 會迅速募集MyD88，激活下游核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號途徑，誘導(dǎo)TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎性細胞因子的表達。如在急性心肌梗死導(dǎo)致的無菌性炎癥中，mtDNA 通過TLR9 激活和NF-κB 觸發(fā)固有免疫反應(yīng)，加重了心肌組織的損傷[25]。此外，mtD‐NA 還以可通過激活TLR9 招募MyD88 誘發(fā)干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulation factor 7,IRF7）釋放。研究表明IRF7 可以誘導(dǎo)使樹突狀細胞和其它免疫細胞產(chǎn)生I 型干擾素（type I interferon,IFN-I）介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[26]。

3 針刺干預(yù)TR9/MyD88 信號通路對運動損傷炎癥反應(yīng)的影響

骨骼肌屬于一種張力復(fù)合體，通過以肌束膜為中心的橫縱向機械通路進行傳導(dǎo)。反復(fù)、超載的離心運動會對骨骼肌橫向張力傳遞產(chǎn)生不利影響，誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)，引起骨骼肌纖維化，破壞肌組織本身的生物力學(xué)穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)TR9/MyD88信號通路通路的異常激活，會進一步導(dǎo)致骨骼肌纖維化[27]，而骨骼肌纖維化則是肌肉質(zhì)量和力量降低的重要因素。針刺是在特定穴位操作，可以將局部刺激信號通過組織間機械力的傳導(dǎo)傳遞給肌膜、肌細胞，引發(fā)胞內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)功能的改變[28]。目前來看針刺通過抑制TLR9 相關(guān)信號通路來干預(yù)骨骼肌運動損傷仍需進一步探究。

3.1 針刺對骨骼肌mtDNA泄露的影響

線粒體是細胞能量代謝的場所，是調(diào)控機體的生命活動所必要細胞器。長時間、超負荷的運動刺激下，無論是機械應(yīng)力還是氧化應(yīng)激，均會對骨骼肌線粒體造成不同程度程度的損傷，在電鏡下會觀察到大量的線粒體積聚到肌膜下，同時伴有腫脹、空泡化，膜結(jié)構(gòu)模糊、不完整甚至消失等超微結(jié)構(gòu)異常變化[29,30]，這種損傷必然會對mtDNA 產(chǎn)生不利影響。有文獻報道急性長時間運動或重復(fù)高強間歇運動后可以檢測到骨骼肌細胞mtDNA 降低[31]。李省天等[32]發(fā)現(xiàn)急性高強度運動小鼠血清游離的mtDNA 顯著升高，但對于血清中游離mtDNA 是否全全部來源于骨骼肌尚需考證。

以上研究表明高強度運動造成的骨骼肌線粒體損傷，會引起部分mtDNA 泄露。mtDNA 泄露途徑目前認為mtDNA 片段能通過位于線粒體內(nèi)外膜上的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondri‐al permeability transition pore,mPTP）進入胞漿[33]。目前通過激光共聚焦顯微鏡來觀察mPTP，發(fā)現(xiàn)針刺預(yù)處理對mPTP 開放程度具有顯著抑制效應(yīng)[34]。力竭運動會引起mPTP 通透性高度開放，膜電位降低，增加線粒體損傷[35]，是因為線粒體本身既是氧化劑的主要來源，也是氧化劑破壞作用的靶點，運動狀態(tài)下活性氧類（reactive oxygen species,ROS）產(chǎn)生增加，造成線粒體膜電位降低，mtDNA 產(chǎn)生增加，被泄露到胞質(zhì)及細胞外[36]。電針預(yù)處理可以明顯減少ROS 的產(chǎn)生，同時提高線粒體膜電位水平，降低氧化應(yīng)激對膜電位的耗損[37,38]，從而維持線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，可能在一定程度抑制了mtDNA的泄露。

3.2 針刺對mtDNA 介導(dǎo)的TLR9/MyD88 信號通路的影響

mtDNA 與細菌DNA 的CpG 同源，其甲基化修飾程度普遍較低[39]，結(jié)構(gòu)的相似使其更容易被TLR9 受體所捕獲。有文獻報道大強度運動導(dǎo)致的肌肉損傷，mtDNA 可以通過TLR4/TLR9 信號通路來激活機體的炎癥反應(yīng)[40]。這種炎癥反應(yīng)既可以是局部的，也可以是整體的。比如在急性心梗導(dǎo)致的無菌性炎癥中，進入循環(huán)中的mtDNA增加，通過結(jié)合TLR9 受體，激活NF-κB，誘導(dǎo)了心肌細胞損傷[41]。同理在運動損傷引起的mtD‐NA 泄露，一旦被TLR9 識別后，就通過MyD88 依賴型轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活下游NF-κB 信號通路，調(diào)節(jié)促炎性細胞因子的表達。

目前針對mtDNA 介導(dǎo)的TLR9/MyD88 炎癥信號通路在運動損傷的臨床和實驗研究中較少，但通過增加mtDNA 的清除或?qū)LR9 通路進行靶向拮抗，來阻斷下游的炎癥因子效應(yīng)在其他炎癥相關(guān)疾病已有較多研究。針刺并不具有藥物靶向性作用，而是通過整體性調(diào)節(jié)來下調(diào)炎性反應(yīng)中病變部位的TLR 受體的表達，對TLR9、TLR2、TLR4等基因均抑制作用，來達到減輕炎癥反應(yīng)的目的[42]。楊長江[43]在研究脊髓TLR9 在大鼠脛骨癌痛中的作用中發(fā)現(xiàn):電針能顯著性降低脛骨炎癥痛大鼠脊髓內(nèi)TLR9的表達,提高其機械性痛閾,而對其非炎癥型疼痛無此作用。提示針刺對TLR9 通路的有效抑制是干預(yù)運動損傷炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。

3.3 針刺對運動性損傷炎癥因子的作用

炎性因子在運動性骨骼肌損傷過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。骨骼肌損傷后可以檢測到多種炎性因子表達，如IL-1β、IL-10、IL-6、TNFα 等。即使在骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)無明顯破壞，也無顯著炎性細胞浸潤得情況下，也可以檢測到TNFα、IL-6 和IL-1β 顯著升高[44]。這也說明炎癥因子并非全部來自炎性細胞分泌，也可以產(chǎn)自其他途徑。TLR9/MyD88信號通路本身是可以通過多途徑對TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子表達進行調(diào)節(jié)，進一步佐證TLR9/MyD88 也可能是介導(dǎo)骨骼肌損傷后的炎癥反應(yīng)的信號通路之一。

針刺可以抑制運動后促炎因子釋放，改善炎癥反應(yīng)。在運動后同時進行針刺干預(yù)能夠降低促炎因子的峰值量，而且這種抑制作用是局部的，并不會對非針刺部位或血液產(chǎn)生影響[45]。但也有研究認為離心運動后進行針刺干預(yù)可以增加針刺部位骨骼肌促炎因子表達量，但會促使其到達峰值之后快速消退[46]。這可能與所選擇炎性因子指標差異或穴位配伍不同有關(guān)。但總體而言，針刺對運動損傷后炎癥反應(yīng)都有明顯緩解作用，在臨床上往往都能獲取一個較為滿意療效。

4 小結(jié)與展望

內(nèi)源性mtDNA 配體誘導(dǎo)的TLR9/MyD88 信號通路，不僅可以引起組織炎癥，甚至還能夠直接導(dǎo)致細胞損傷。運動損傷在競技體育中日益頻發(fā)，目前研究也已證實持續(xù)炎癥反應(yīng)是引起組織損傷加劇的一個重要因素，但炎性細胞因子在骨骼肌損傷的各階段也發(fā)揮不同作用。線粒體損傷作為骨骼肌損傷一個重要方面，尤其是大負荷運動對骨骼肌線粒體在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上均會造成不同程度的損傷。線粒體損傷會導(dǎo)致部分mtDNA 通過各種途徑被泄露到胞質(zhì)或細胞間質(zhì)中。低甲基化修飾的mtDNA 又很容易被TLR9所識別，從而通過下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α、和IL-1β 等促炎因子釋放。此外，TLR9/MyD88炎癥信號通路，還可以促進中性粒細胞聚集和巨噬細胞的活化，擴大炎癥反應(yīng)。這些促炎因子和炎性細胞在骨骼肌損傷炎癥反應(yīng)過程中均參與其中。

一直以來，針刺在治療運動損傷應(yīng)用較為廣泛，但對其抗炎機制始終難以用現(xiàn)代生物學(xué)理論加以全面闡釋。有學(xué)者提出針灸是否是通過迷走神經(jīng)、乙酰膽堿及受體所構(gòu)成的膽堿能抗炎通路來發(fā)揮其抗炎調(diào)節(jié)作用[47]。實際上針刺調(diào)理機制較為復(fù)雜，并非單一通路可以解釋清楚。此外，骨骼肌損傷炎癥因子調(diào)控機制也極其復(fù)雜，除了炎性細胞通路，骨骼肌本身也可以分較多炎性因子。針刺對TLR9/MyD88 信號通路干預(yù)也只能闡述其部分機理，想要進一步揭示針刺對運動損傷炎癥效應(yīng)機制的作用還需要更多的研究。