兒童急性淋巴細(xì)胞白血病化療前后腸道菌群變化特點(diǎn)

陳森敏 劉四喜 陳芬 王春艷 麥惠容 袁秀麗 文飛球

（深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科，廣東深圳 518038）

人體微生物群落主要分布于黏膜器官，包括腸道、口腔和陰道。腸道菌群在人體許多生理過程中發(fā)揮重要作用，包括協(xié)助宿主免疫功能的成熟及發(fā)育、抵抗病原微生物的過度生長、影響宿主細(xì)胞的增殖和新生血管形成等。因此，腸道菌群被認(rèn)為是早期生命發(fā)育和終生健康的關(guān)鍵因素。腸道菌群在多種疾病中可能起推動或阻礙的作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，影響免疫細(xì)胞的疾病，如急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）、炎癥性腸病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與腸道微生物組成的變化（生態(tài)失調(diào)）有關(guān)［2-4］。但腸道菌群在ALL發(fā)病時及化療前后的變化研究尚不充分，且存在不一致的研究結(jié)果［5-7］。因此，本研究采集ALL患兒糞便標(biāo)本檢測腸道菌群的微生物組成，探討化療對ALL患兒腸道菌群的影響，以期能在ALL及其化療相關(guān)并發(fā)癥的診治中發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組

前瞻性選取2018 年1～9 月在深圳市兒童醫(yī)院確診的ALL 患兒40 例納入ALL 組；另選取ALL 患兒的健康同胞10 例納入健康對照組。兩組研究對象的體重指數(shù)均在正常范圍內(nèi)，年齡1～10 歲，在取樣前2個月內(nèi)均未使用益生菌，且在取樣前1個月內(nèi)均無腹瀉。ALL 組患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：初次診斷ALL；入組前未化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)的ALL；合并有營養(yǎng)不良或肥胖等其他疾病的患兒。健康對照組兒童均無胃腸道疾病，采集樣本前1個月內(nèi)無抗生素接觸史。

收集ALL組患兒化療前、化療后2周、化療后1 個月及化療后2 個月4 個時間點(diǎn)的糞便；同期采集ALL患兒的健康同胞糞便1次。

本研究已獲得深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得所有參與實(shí)驗(yàn)研究的兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 ALL的診斷、化療方案及危險度分級

ALL的診斷基于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)［8］。根據(jù)廣東地區(qū)ALL-GD-2008方案（以BFM2002為基礎(chǔ)）［9］按序化療。以初診時年齡、白細(xì)胞總數(shù)、免疫分型、口服潑尼松第8天外周血幼稚細(xì)胞數(shù)及治療第15天、第33天骨髓象作為早期化療敏感性評估指標(biāo)，分為標(biāo)危、中危、高危3組。標(biāo)危及中危組化療階段分為VDLD誘導(dǎo)緩解、CAM 鞏固治療、MTX 鞏固治療、VALD 再誘導(dǎo)緩解及CAM鞏固治療。高危組將MTX鞏固治療換為Block1、Block2及Block3強(qiáng)化治療?；煹?5 天開始所有患者均予復(fù)方磺胺甲噁唑口服預(yù)防卡氏肺孢子蟲病。各階段化療藥物及時間見表1。

表1 化療方案、藥物及時間

表1 （續(xù)）

1.3 糞便DNA提取

采集ALL 患兒及健康對照組兒童的新鮮糞便至少2 g，放入滅菌的一次性大便常規(guī)管內(nèi)，置于冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室分裝后轉(zhuǎn)移入-80℃冰箱保存。用糞便DNA 提取試劑盒（Omega Bio-Tek，美國）從糞便樣本中分離提取DNA。

1.4 16S rDNA基因的擴(kuò)增及測序

采用熒光定量PCR 擴(kuò)增16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)，選擇特異性引物（前端引物為：338F-5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3'；后端引物為：806R-5'-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。 反 應(yīng) 體 系（25 μL）： Pusion Hot Start Flex 2×Master Mix（NEB，美國）12.5 μL、Forward Primer（1 μmol/L）2.5 μL、 Reverse Primer （1 μmol/L） 2.5 μL、Template DNA 50 ng，加入ddH2O 至總體積為25 μL。反 應(yīng) 條 件：98℃30 s；98℃10 s，54℃30 s，72℃45 s，35 個循環(huán)；72℃10 min。隨后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收后使用AMPure XP beads 回收試劑盒（Beckman，美國）進(jìn)行純化。使用MiSeq 測序儀（Illumina，美國） 進(jìn)行2×300 bp 的雙端測序，相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3（Illumina，美國），獲得各模板DNA 片段的測序序列，即讀數(shù)。

1.5 生物信息分析

去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的Reads，通過97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。然后使用Mothur 軟件，構(gòu)建稀釋性曲線。分別從每個聚類單元挑選1條代表性序列，以Greengene13.8的數(shù)據(jù)庫為模板注釋物種名稱組成OTUs。歸類后根據(jù)每個OTU 中序列的條數(shù)計算OTU豐度表，根據(jù)該物種豐度表進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析及物種分類與豐度分析。根據(jù)分類學(xué)組成對樣本按照不同的分組條件用LEfSe軟件進(jìn)行線型判別分析，找出有顯著性差異的類群。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；ALL患兒化療前后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)，ALL患兒化療前后比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

40 例ALL 患兒，男25 例，女15 例，男∶女1.7∶1；T系4例（10%），B系36例（90%）；標(biāo)危8 例（20%），中危21 例（52%），高 危11 例（28%）；初診時平均年齡（5.2±2.4）歲。對照組中，男6例，女4例，平均年齡（5.8±2.1）歲。兩組之間男女比例及年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 糞便樣本菌群測序結(jié)果分析

本研究總共收集了122個糞便樣本，總共獲得3907880個讀數(shù)，平均每個樣品為32032個讀數(shù)，最小值和最大值分別為13531和57106，中位讀數(shù)為33092。化療后2 周組30 個樣品共1048652 個讀數(shù)，化療后1 個月組35 個樣品共1046014 個讀數(shù)，化療后2 個月組15 個樣品共405956 個讀數(shù)，化療前組32 個樣品共1134937 個讀數(shù)，健康對照組10個樣品中共272321個讀數(shù)。

2.3 ALL 患兒不同時期腸道菌群的豐度及多樣性分析

基于高通量測序數(shù)據(jù)，對每組樣本的菌群豐度和多樣性進(jìn)行進(jìn)一步檢測。其中，豐度由OTU數(shù)目和Chao1值體現(xiàn)，多樣性由PD值、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)體現(xiàn)，覆蓋率指數(shù)由Good's coverage值體現(xiàn)。

各樣本Good's coverage 值均在0.98 以上，覆蓋率較好，測序結(jié)果可代表各樣本腸道菌群實(shí)際組成。與健康對照組相比，ALL 組化療前腸道菌群OTUs、Chao1及PD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；ALL 組化療后1 個月及2 個月的腸道菌群OTUs、Chao1及PD值顯著下降（P＜0.05），在化療后2 周、1 個月、2 個月Shannon 指數(shù)及Simpson指數(shù)仍明顯低于健康對照組（P＜0.05）。見表2～5。

表2 化療前ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

表2 化療前ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

組別健康對照組化療前ALL組t值P值n 1032 OTUs 754±418723±5040.1770.860 Good's coverage 0.986±0.0040.990±0.005-1.9850.054 Chao11183±5671122±7020.2460.806 PD 46±1744±220.1880.852 Shannon 5.0±1.04.0±1.82.2660.032 Simpson 0.90±0.070.75±0.243.1300.003

表3 化療后2周ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

表3 化療后2周ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

組別健康對照組化療后2周ALL組t值P值n 1030 OTUs 754±418586±3431.2740.210 Good's coverage 0.986±0.0040.991±0.004-3.2960.002 Chao11183±567918±5311.3420.187 PD 46±1737±171.3990.169 Shannon 5.0±1.03.8±1.52.3350.025 Simpson 0.90±0.070.77±0.212.8360.007

表4 化療后1個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

表4 化療后1個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

組別健康對照組化療后1個月ALL組t值P值n 1035 OTUs 754±418407±1983.7220.001 Good's coverage 0.986±0.0040.993±0.003-6.080＜0.001 Chao11183±567625±2974.201＜0.001 PD 46±1730±103.691＜0.001 Shannon 5.0±1.03.5±1.23.5420.001 Simpson 0.90±0.070.77±0.182.1670.036

表5 化療后2個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

表5 化療后2個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 （±s）

組別健康對照組化療后2個月ALL組t值P值n 1015 OTUs 754±418401±3192.3940.025 Good's coverage 0.986±0.0040.993±0.005-3.7820.001 Chao11183±567627±4822.6300.015 PD 46±1729±152.6090.016 Shannon 5.0±1.03.4±1.43.0900.005 Simpson 0.90±0.070.75±0.182.8240.010

和化療前相比，ALL 組化療后1 個月及2 個月的腸道菌群Chao1 及PD 值顯著下降（P＜0.05），盡管化療后2 個月OTUs 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.066），但仍有下降趨勢；總體趨勢來看，ALL患兒腸道菌群物種豐度在化療后2個月最低，其次是化療后1個月和2周。見表6～8。

表6 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

表6 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

組別化療前化療后2周t值P值n 2525 OTUs 677±508622±3430.5370.597 Good's coverage 0.989±0.0060.991±0.005-1.4520.159 Chao11166±749959±5081.3570.187 PD 45±2339±161.1990.242 Shannon 4.0±1.83.9±1.40.2670.792 Simpson 0.76±0.220.78±0.21-0.3790.708

表7 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

表7 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

組別化療前化療后1個月t值P值n 2929 OTUs 668±485386±1863.1500.004 Good's coverage 0.990±0.0060.993±0.003-3.1290.004 Chao11122±715632±3053.942＜0.001 PD 44±2230±103.6800.001 Shannon 4.0±1.83.5±1.31.3550.186 Simpson 0.74±0.250.76±0.20-0.3480.731

表8 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

表8 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

組別化療前化療后2個月t值P值n 1212 OTUs 609±467374±246-2.0340.066 Good's coverage 0.991±0.0050.993±0.004-1.5330.154 Chao1976±689578±3492.2060.050 PD 40±2228±132.2800.044 Shannon 3.4±1.73.4±1.3-0.0950.926 Simpson 0.66±0.260.75±0.19-1.1410.278

基于weighted unifrac距離算法對所有樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA分析）。盡管化療前及化療后2周、1個月、2個月ALL 組與健康對照組的樣本差異有統(tǒng)計學(xué)意義（R=0.035，P=0.041），但各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)總體分離不明顯。如圖1所示。

2.4 ALL患兒腸道菌群組成分析及比較

在門水平上，處于前5位的腸道菌群分別為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門（圖2）。分析ALL 組與健康對照組及ALL 患兒化療前后腸道菌群相對豐度的統(tǒng)計學(xué)差異。與健康對照組相比，ALL患兒化療前變形菌門的相對豐度有升高趨勢，并在化療后1個月及2個月顯著升高（P＜0.05）；ALL 患兒化療前放線菌門的相對豐度有降低趨勢，并在化療后2 周、1 個月及2 個月顯著降低（P＜0.05）；ALL 患兒僅在化療后1 個月擬桿菌門的相對豐度明顯降低（P=0.009）（表9～12）。與化療前相比，ALL 患兒化療后放線菌門的相對豐度有降低趨勢，變形菌門的相對豐度有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；疣微菌門的相對豐度在化療后1 個月顯著降低（P=0.001）（表13～15）。

表9 化療前ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表10 化療后2周ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表11 化療后1個月ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表12 化療后2個月ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表13 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群前5門相對豐度比較 ［M（P25，P75）］

表14 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群前5門相對豐度比較 ［M（P25，P75）］

表15 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群前5門相對豐度比較 ［M（P25，P75）］

在屬水平上，處于前7位的腸道菌群分別為雙歧桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬、活潑瘤胃球菌屬、克雷伯菌屬和Faecalibacterium（圖3）。分析ALL組與健康對照組及ALL 患兒化療前后腸道菌群相對豐度的統(tǒng)計學(xué)差異。與健康對照組和ALL患兒化療前相比，ALL患兒化療后2 周、1 個月和2 個月腸球菌屬、鏈球菌屬和克雷伯菌屬的相對豐度有增加趨勢，雙歧桿菌屬、Faecalibacterium相對豐度有降低趨勢。雙歧桿菌屬相對豐度在ALL 患兒化療后2 周、1 個月及2 個月均較健康對照組顯著降低（P＜0.05）?？死撞鷮傧鄬ωS度在ALL患兒化療后1個月及2個月均較健康對照組顯著升高，并且在化療后1個月時較化療前顯著升高（P＜0.05）；盡管在化療后2個月與化療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.069），但仍有升高趨勢。 與健康對照組比較，F(xiàn)aecalibacterium相對豐度在ALL患兒化療前后均顯著降低，并且在化療后2周及1個月時相對豐度顯著低于化療前（P＜0.05）。腸球菌屬相對豐度在ALL 患兒化療后1 個月及2 個月較健康對照組及化療前均明顯升高（P＜0.05）。鏈球菌屬僅在化療后2周時較化療前明顯升高（P=0.021）。見表16～22。

表16 化療前ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表17 化療后2周ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表18 化療后1個月ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表19 化療后2個月ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 ［M（P25，P75）］

表20 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群前7屬相對豐度比較 ［M（P25，P75）］

表21 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群前7屬相對豐度比較 ［M（P25，P75）］

表22 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群前7屬相對豐度比較 ［M（P25，P75）］

2.5 ALL 患兒化療前后不同時間點(diǎn)糞便中特異性差異腸道菌群

LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)在ALL 患兒化療不同時間點(diǎn)的部分腸道菌群在相對豐度上存在一定差異（圖4）。化療前、化療后2 周、1 個月和2 個月從門到種水平上的特異性腸道菌群分別有37、22、11 和20個?；熐跋鄬ωS度較高的腸道菌群分布在放線菌門、放線菌綱、雙歧桿菌屬等。化療后2周時相對豐度較高的腸道菌群分布在有乳桿菌目、極小韋永氏球菌種、瘤胃球菌屬等。化療后1個月時相對豐度較高的腸道菌群分布在s_Streptococcus_sanguinis_SK36、g_Fusicatenibacter 等?；熀? 個月時相對豐度較高的腸道菌群分布在丹毒絲菌目、丹毒絲菌科、葡萄球菌屬等。

3 討論

近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能與菌群的多樣性和穩(wěn)定性失調(diào)有關(guān)。影響免疫細(xì)胞的疾病，如ALL、炎癥性腸病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與腸道微生物組成的變化有關(guān)，其發(fā)生的原因是微生物多樣性的減少［2-4］。本研究發(fā)現(xiàn)，和健康對照組比較，ALL 患兒化療前、化療后1 個月及2 個月腸道菌群alpha 多樣性均低于健康對照組，與先前的研究結(jié)果一致［6-7］。已發(fā)表的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ALL患兒的糞便菌群中富含擬桿菌門、腸球菌科和卟啉單胞菌科等細(xì)菌，而缺乏厚壁菌門、毛螺菌科和梭菌門等細(xì)菌［2］。本研究對ALL 患兒化療前糞便樣本的腸道菌群分析結(jié)果與上述報道不完全一致，可能與人種、地域、飲食結(jié)構(gòu)等因素不同有關(guān)。

Zwielehner 等［10］發(fā)現(xiàn)化療后腸道菌群組成發(fā)生了改變。一項(xiàng)小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺后腸道細(xì)菌多樣性減少，并誘導(dǎo)了腸桿菌科、假單胞菌科（變形菌門）和腸球菌科（厚壁菌門）等潛在致病菌群優(yōu)勢生長［11］。有研究發(fā)現(xiàn)兒童ALL 患者在強(qiáng)化誘導(dǎo)和再誘導(dǎo)化療后腸道菌群多樣性顯著下降［12］。在本研究中，ALL 患兒糞便微生物在化療后物種豐富度降低，但化療前和化療后的alpha 多樣性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與上述報道不一致，可能與樣本量小有關(guān)。但我們觀察到化療后不同時間點(diǎn)腸道菌群的微生物組成與化療前存在不同，與以往研究結(jié)果一致［2］。

通過分析ALL 患兒化療后與化療前的腸道菌群相對豐度差異，我們發(fā)現(xiàn)變形菌門的相對豐度有升高趨勢，放線菌門的相對豐度有降低趨勢。屬水平上，雙歧桿菌和Faecalibacterium相對豐度在ALL 患兒化療后顯著降低，克雷伯菌相對豐度升高。Faecalibacterium prausnitzii可發(fā)酵膳食纖維，是有益的短鏈脂肪酸丁酸鹽的主要來源，并具有改善結(jié)腸炎的抗炎特性，因此是一種保護(hù)性細(xì)菌，對腸道健康不可或缺［13］。Faecalibacterium的相對豐度在兒童ALL 患者成年后仍降低，并與炎癥標(biāo)志物IL-6 和C 反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)［10］。雙歧桿菌對人體健康的有益作用主要是防治腸道疾病和免疫紊亂［14］。而克雷伯菌為公認(rèn)的人類病原體。因此，本研究結(jié)果提示，化療部分降低了患者腸道有益菌的豐度，引起了ALL 患兒腸道有益菌和有害菌的失衡。

對ALL 化療前后腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析表明，來源于同一個病人的腸道菌群在化療前后各時間點(diǎn)的分布較分散（存在明顯的差異）。雖然化療前后各組樣本分布總體上分離不明顯，但腸道菌群結(jié)構(gòu)差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。屬水平上，ALL患兒化療前相對豐度較高的差異物種為雙歧桿菌，化療后2 周、1 個月和2 個月相對豐度較高的差異物種分別為瘤胃球菌、g_Fusicatenibacter 和葡萄球菌屬。

本研究中ALL 患兒化療后樣本采集時間均在化療后2個月以內(nèi)，對應(yīng)的化療階段是在VDLD誘導(dǎo)緩解與鞏固治療之間，均處于較強(qiáng)的化療期?；熀?周均在VDLD期間，化療后1個月均在第1個CAM 期間，多數(shù)患者的化療后2 個月在第2 個CAM方案后。本研究對象大部分在化療后2周進(jìn)入骨髓抑制期，故化療后1個月和2個月的時間點(diǎn)基本可以代表化療后骨髓抑制的狀態(tài)，在化療后2個月時都有抗生素治療史。故本研究中ALL 患兒化療后腸道菌群的變化除與化療有關(guān)外，還可能受到宿主免疫狀態(tài)及抗生素的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALL患兒腸道菌群多樣性明顯低于健康兒童，化療后腸道菌群豐度顯著降低，部分有益菌豐度下降、病原菌豐度增加。但腸道菌群作為一個動態(tài)整體，受各種因素的影響，如年齡、壓力、飲食、健康狀態(tài)等［15］。對于ALL 患者的腸道菌群及其調(diào)節(jié)因素及對化療效果的影響，我們的認(rèn)識依然有限。本研究分析了10 例健康兒童樣本和40 例ALL 患兒在化療前后不同時間點(diǎn)的糞便樣本，未來尚需增加樣本并按疾病危險度、免疫分型等因素繼續(xù)分層對腸道菌群進(jìn)行分析研究并構(gòu)建動物模型驗(yàn)證。