新改良白膜法制備濃縮血小板的應(yīng)用效果探討

熊志高，劉昕晨，楊小羅，王海燕，袁麒輝

血小板輸注是治療血小板減少和出血性疾病的有效手段。隨著臨床輸血技術(shù)水平的不斷提高，血小板輸注用量逐年遞增。我國大部分地區(qū)血小板的應(yīng)用主要以單采血小板為主。雖然單采血小板具有純度高、臨床輸注效果好、白細(xì)胞污染少等優(yōu)點，但單采獻(xiàn)血者招募困難、采集成本高，導(dǎo)致供應(yīng)不足，難以滿足日益增長的臨床需求。濃縮血小板(platelet concentrates，PC)通過全血采集分離制備獲得，具有成本低、來源廣等優(yōu)點，被中小型血站廣泛采用。手工制備PC的影響因素較多，容易導(dǎo)致血小板回收率偏低，甚至可能達(dá)不到質(zhì)量要求，造成血液資源浪費。為保證PC的質(zhì)量，本站對PC的制備流程在改良白膜法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改良，增加原料全血在離心前的恒溫靜置步驟，并將此方法命名為“新改良白膜法”，顯著提高了PC的質(zhì)量。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

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血液標(biāo)本 隨機(jī)抽選2019年5月至2020年3月株洲市中心血站采集的400 ml規(guī)格全血220袋、300 ml規(guī)格全血30袋，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。采集時間超過10 min的400 ml全血，以及采集時間超過7 min 30 s的300 ml全血不納入抽取范圍。全血采集的同時留取其同源標(biāo)本2 ml，(22±2)℃保存。6 h內(nèi)運送至株洲市中心血站完成PC的制備及血常規(guī)檢測。

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主要設(shè)備 大容量離心機(jī)(CRYOFUGE 16，德國Thermo公司)、全自動血液成分分離機(jī)(Compomat G5，德國Fresenius公司)、血小板恒溫保存箱(MDC-10PE，中科都菱)、全自動血細(xì)胞計數(shù)儀(XS-800i，日本Sysmex公司)、顯微鏡(CH20，日本Olympus公司)。

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主要耗材 PT-Q-400全血六聯(lián)血袋(山東威高)、PT-Q-300全血六聯(lián)血袋(山東威高)、一次性使用白細(xì)胞過濾輸血器材(南京雙威)、紅細(xì)胞稀釋液(貝真生物)、白細(xì)胞稀釋液(貝真生物)。

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制備方法 按不同離心方案、不同全血容量、不同制備方法將標(biāo)本隨機(jī)分組進(jìn)行PC制備。除驗證條件外，各組均采用相同的離心溫度、加速及減速程序。

1.4.1 不同離心方案 將180袋400 ml全血隨機(jī)分為9組，每組20袋。在傳統(tǒng)白膜法離心參數(shù)基礎(chǔ)上逐步調(diào)整相對離心力，采用9種不同的離心方案。見表1。新改良白膜法制備PC：將原料全血于(22±2)℃環(huán)境恒溫靜置1～2 h后進(jìn)行全血離心16 min，分離出白膜層，再將白膜層于(22±2)℃環(huán)境恒溫靜置2 h以上(但不超過采血后24 h)，進(jìn)行白膜離心10 min，分離上清制備出PC。

表1 9種離心方案

1.4.2 不同全血容量方案 30袋300 ml全血采用新改良白膜法，離心方式采用方案6制備PC，并與20袋400 ml全血以離心方案6制備PC的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。

1.4.3 不同制備方法 將60袋400 ml全血隨機(jī)分為3組，每組20袋。分別采用富漿法、改良白膜法和新改良白膜法制備PC。(1)富漿法組：以1 328×g、11 min程序離心，分離出富含血小板血漿三聯(lián)袋，再以2 988×g、6 min程序離心血漿三聯(lián)袋，分離去除上清，留取50～76 ml/2 U富含血小板的血漿即為PC。(2)改良白膜法組：采用離心方案6的離心參數(shù)，將全血以1 993×g、16 min程序離心分離出富含血小板白膜三聯(lián)袋，將白膜三聯(lián)袋置(22±2)℃恒溫保存箱靜置2 h以上(但不超過采血后24 h)，再以163×g、10 min程序離心，分離上清制備出PC。將兩種方法制備PC與新改良白膜法應(yīng)用離心方案6制備PC的實驗數(shù)據(jù)對比分析。

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指標(biāo)檢測 (1)全血血細(xì)胞計數(shù)：將全血標(biāo)本充分混勻，用XS-800i全自動血細(xì)胞計數(shù)儀檢測血細(xì)胞計數(shù)。(2)PC中的血小板計數(shù)：將PC充分混勻后留取2 ml標(biāo)本，取200 μl用生理鹽水稀釋5倍，再用XS-800i全自動血細(xì)胞計數(shù)儀檢測血小板計數(shù)。(3)PC中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞混入量：分別用紅細(xì)胞稀釋液和白細(xì)胞稀釋液對PC進(jìn)行稀釋處理后充入Nageotte白細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)池中，于顯微鏡下計數(shù)。

2 結(jié)果

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不同離心方案制備所得PC的參數(shù)比較 在制備前，9種方案血小板水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)。完成制備后比較結(jié)果顯示，全血離心方案6所得PC的血小板回收率最高；不同離心方案制備所得PC的紅細(xì)胞混入量和白細(xì)胞混入量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)。見表2。

表2 不同離心方案制備所得PC的參數(shù)比較

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不同全血容量方案制備所得PC的參數(shù)比較在制備前，兩組血小板濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)。完成制備后比較結(jié)果顯示，400 ml全血組的PC紅細(xì)胞混入量顯著高于300 ml全血組(

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<0.05)。白細(xì)胞混入量略高于300 ml全血組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)。400 ml全血組的PC回收率高于300 ml全血組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)。見表3。

表3 不同全血容量方案制備所得PC的參數(shù)比較

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不同制備方法所得PC的參數(shù)比較 在制備前，三組血小板水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)。新改良白膜法制備所得PC的白細(xì)胞混入量低于富漿法組和改良白膜法組，且血小板回收率更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)。見表4。

表4 不同制備方法所得PC的參數(shù)比較

3 討論

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PC的質(zhì)量受多種因素影響，包括離心方案、原料全血容量、血液運輸、儲存條件和溫度等。本研究在傳統(tǒng)白膜法離心參數(shù)的基礎(chǔ)上，逐步調(diào)整全血及白膜的離心力組合，通過對紅細(xì)胞和白細(xì)胞混入量、血小板計數(shù)、血小板回收率等常規(guī)指標(biāo)進(jìn)行比較，評估PC制備的最佳方案。結(jié)果顯示，全血以1 993 g離心16 min，白膜以163 g離心10 min的組合為最佳離心方案。該離心方案的全血離心參數(shù)與王承琳等報道的最優(yōu)離心參數(shù)相近。本研究在保證白細(xì)胞混入量達(dá)標(biāo)情況下盡可能減小白膜離心力，同時，采用自制定型模板裝杯離心，以減少白膜離心時血小板的損耗。自制定型模板裝杯與王承琳等改進(jìn)裝罐的理念相同。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，200 ml、300 ml、400 ml三種不同規(guī)格的全血制備PC的血小板回收率存在顯著差異。本次研究采用新改良白膜法制備PC，以300 ml和400 ml全血為原料制備所得PC的紅細(xì)胞混入量和血小板回收率也仍然存在顯著差異，400 ml全血組的血小板回收率高于300 ml全血組。紅細(xì)胞混入量雖相對略高，但其本身與全血容量相關(guān)，若換算成紅細(xì)胞混入濃度，二者之間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，全血容量也是一個很重要的影響因素。

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除此之外，筆者認(rèn)為，選擇合適的制備方法也尤為重要。本研究結(jié)果顯示，改良白膜法優(yōu)于富漿法，這與國內(nèi)相關(guān)的報道相符。本研究在單泓等報道的PC制備方法基礎(chǔ)上簡化離心步驟，優(yōu)化離心參數(shù)，增加全血和白膜的恒溫靜置流程，此方法顯著提高了血小板回收率，同時又降低了白細(xì)胞混入量，提升了PC質(zhì)量。在改良白膜法基礎(chǔ)上增加全血的恒溫靜置，其原理是全血中的血小板在血液運輸交接過程中可能發(fā)生了可逆性聚集，通過靜置一定時間來促進(jìn)其解聚，有利于血小板的制備回收，與室溫過夜的原理相同。本研究結(jié)果與刁榮華等研究報道的全血室溫過夜制備PC可以明顯提高血小板回收率的結(jié)論一致，且適宜性更好。因為可以控制在血液采集6 h內(nèi)完成全血靜置和白膜漿袋的分離，從而實現(xiàn)在不影響其他血液成分質(zhì)量的基礎(chǔ)上制備出質(zhì)量更好的PC。本研究采用新改良白膜法制備所得PC的血小板計數(shù)、血小板回收率較陳永婷報道的更高。國外研究也表明，采用全血室溫過夜后進(jìn)行血小板制備比常規(guī)方法可以得到更多的血小板，平均高出18.6%～33.0%。但全血過夜可能影響紅細(xì)胞質(zhì)量和新鮮冰凍血漿的制備，不符合我國血液貯存要求。

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采用全自動血液成分分離機(jī)精準(zhǔn)制備PC，減少人工操作誤差，是提高PC質(zhì)量的有效措施。本站從2018年3月采用全自動血液成分分離機(jī)制備PC，PC質(zhì)量也得到大幅提升，此方法國內(nèi)報道較多，在此不再贅述。在實際推廣工作中，本站根據(jù)研究過程中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵影響因素對用來制備PC的原料全血進(jìn)行了嚴(yán)格的限定：(1)只將市區(qū)采血點采集到的400 ml全血用于制備PC，每隔4 h取一次血，以確保在血液采集6 h內(nèi)完成全血靜置和白膜漿袋的分離。(2)針對其他重要影響因素加強(qiáng)了細(xì)節(jié)的改進(jìn)，包括在采血和成分制備部門配置(22±2)℃恒溫血液保存箱；使用專用運血車減少血液振蕩；配置專用血小板運輸箱確保血液運輸溫度；離心裝杯時，將白膜袋用自制塑料模板平整裝杯，避免袋體產(chǎn)生褶皺；成分制備工作人員不斷提升PC目視檢查能力，剔除目視不合格的PC。隨著工作的不斷優(yōu)化，血小板質(zhì)量也得到了提升。

綜上所述，新改良白膜法首次采用全血和白膜兩次恒溫靜置制備PC，明顯提高了PC的制備質(zhì)量，值得在對血小板產(chǎn)品制備有高需求的中小血站中推廣應(yīng)用。