抗N-甲基D-天冬氨酸受體腦炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

喬珊，王志浩，張善超，張冉冉，吳玉嬌，姜荊，靳陽(yáng)，吳懷寬，劉學(xué)伍，3

抗N-甲基D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)腦炎是一類嚴(yán)重的自身免疫性神經(jīng)精神疾病，常以迅速進(jìn)展的精神行為異常、認(rèn)知功能下降、癲癇發(fā)作、言語(yǔ)或運(yùn)動(dòng)障礙及意識(shí)水平下降為主要臨床表現(xiàn)。該疾病的治療以免疫治療為主，多數(shù)抗NMDAR腦炎患者對(duì)于免疫治療反應(yīng)良好，部分重癥患者預(yù)后不良，嚴(yán)重者甚至死亡。以往研究提示抗NMDAR腦炎患者復(fù)發(fā)率在12.0%～31.4%之間，部分患者可出現(xiàn)多次復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活品質(zhì)。當(dāng)前研究認(rèn)為腫瘤(常為卵巢畸胎瘤)和單純皰疹病毒感染是抗NMDAR腦炎的已知主要誘因。雖有研究提示自身免疫性抗體的致病性可能是抗NMDAR腦炎的關(guān)鍵機(jī)制，但仍需更深入的研究闡明其發(fā)病機(jī)制。動(dòng)物模型的研究在揭示神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制方面起到至關(guān)重要的作用。建立理想的動(dòng)物模型有助于深入揭示抗NMDAR腦炎的潛在致病機(jī)制并探究有效的治療靶點(diǎn)。近年來(lái)，不斷有關(guān)于抗NMDAR腦炎的動(dòng)物模型報(bào)道，主要包括4類：被動(dòng)免疫模型、主動(dòng)免疫模型、病毒感染誘導(dǎo)模型及遺傳性模型。本文將綜述近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者開發(fā)的抗NMDAR腦炎動(dòng)物模型的基本特點(diǎn)及研究應(yīng)用，旨在為抗NMDAR腦炎的進(jìn)一步研究提供參考。

1 被動(dòng)免疫模型

被動(dòng)免疫模型構(gòu)建的理論基礎(chǔ)是通過轉(zhuǎn)移血清、純化免疫球蛋白、單克隆抗體，或從受影響的人類或動(dòng)物供體分離的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，在健康受體中復(fù)制疾病。在抗NMDAR腦炎動(dòng)物模型的構(gòu)建中，此類模型通常通過體內(nèi)輸注或立體定向腦室注射抗NMDAR腦炎患者的腦脊液或從患者的血清和(或)腦脊液純化的IgG進(jìn)行制備。

最早的抗NMDAR腦炎被動(dòng)免疫模型由Planagum等通過輸注來(lái)自患者的腦脊液被動(dòng)轉(zhuǎn)移NMDAR抗體建立。輸注抗NMDAR腦炎患者腦脊液的小鼠重現(xiàn)了在患者身上觀察到的一些神經(jīng)精神特征，如記憶障礙、快感缺失和抑郁樣行為，未觀察到癲癇發(fā)作或運(yùn)動(dòng)障礙。免疫印跡和共聚焦顯微鏡顯示海馬NMDAR總蛋白以及總受體和突觸受體聚集減少，進(jìn)一步證實(shí)NMDAR與觀察到的癥狀的相關(guān)性。該小鼠模型不僅揭示了NMDAR抗體的直接致病性，還為研究突觸功能障礙的機(jī)制提供了依據(jù)。Planagum等開發(fā)的動(dòng)物模型將有助于闡明NMDAR抗體在自身免疫性腦炎中的分子效應(yīng)，并有助于探究NMDAR抗體影響認(rèn)知及情緒的作用機(jī)制。Wright等通過腦室注射抗NMDAR腦炎患者的純化NMDAR IgG結(jié)合化學(xué)致驚厥劑戊四氮構(gòu)建小鼠模型。該小鼠模型出現(xiàn)反復(fù)的癲癇發(fā)作，但沒有出現(xiàn)認(rèn)知和其他特征的改變。該項(xiàng)研究證明了NMDAR抗體在體內(nèi)的致癇性。

2016年Wurdemann等將商品化的抗NMDAR及來(lái)自抗NMDAR腦炎患者的腦脊液的抗NMDAR1立體定向注射到成年雌性大鼠的齒狀回中成功制備被動(dòng)免疫大鼠模型，該模型大鼠在Morris水迷宮隱藏平臺(tái)任務(wù)中的學(xué)習(xí)表現(xiàn)顯著受損，沒有出現(xiàn)焦慮及抑郁等精神癥狀及癲癇發(fā)作，該模型在一定程度上重現(xiàn)抗NMDAR腦炎患者病程中的認(rèn)知功能下降癥狀，進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)自用抗NMDAR處理的動(dòng)物的齒狀回顆粒細(xì)胞顯示NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸后電位(EPSP)的幅度顯著降低，為探究抗NMDAR腦炎患者的記憶力下降的發(fā)生機(jī)制及突觸的病理改變機(jī)制的研究提供了動(dòng)物模型保障。

Malviya等于2017年的研究中將人重組GluN1特異性單克隆抗體進(jìn)行小鼠腦室內(nèi)輸注后，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的記憶障礙，并且引起海馬突觸NMDAR密度降低，該研究證實(shí)抗NMDAR腦炎中存在CNS特異性體液免疫應(yīng)答并且特異性靶向NMDAR的GluN1亞單位。該動(dòng)物模型以重組的形式恢復(fù)了典型的鞘內(nèi)抗體特征，并通過被動(dòng)轉(zhuǎn)移疾病癥狀證明了其致病相關(guān)性，為闡明鞘內(nèi)免疫應(yīng)答介導(dǎo)抗NMDAR腦炎的發(fā)生發(fā)展提供了關(guān)鍵證據(jù)。此外，鑒于抗NMDAR腦炎患者的腦脊液或血清來(lái)源及數(shù)量有限，使用重組GluN1特異性單克隆抗體構(gòu)建動(dòng)物模型為研究者進(jìn)一步探究自身免疫性腦炎的發(fā)病機(jī)制提供了限制較少的有潛力的動(dòng)物模型構(gòu)建途徑。

被動(dòng)免疫動(dòng)物模型通過將抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)移至動(dòng)物體內(nèi)能在一定程度上重現(xiàn)抗NMDAR腦炎病程中出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙、癲癇發(fā)作及抑郁樣癥狀等主要臨床表現(xiàn)及突觸功能障礙的病理改變，為深入了解抗NMDAR腦炎的潛在致病機(jī)制提供了條件，但是該類模型對(duì)探討免疫啟動(dòng)因素和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以及神經(jīng)炎癥在抗NMDAR腦炎過程中的潛在作用機(jī)制方面作用有限，因此進(jìn)一步開發(fā)其他類型的動(dòng)物模型是有必要的。

2 主動(dòng)免疫模型

主動(dòng)免疫動(dòng)物模型構(gòu)建的理論基礎(chǔ)基于機(jī)體接觸抗原后誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)?？乖梢允羌兓鞍踪|(zhì)、重組或合成肽的形式。Jones等通過使用嵌入脂質(zhì)體中的GluN1-GluN2B四聚體組成的完整的NMDA受體進(jìn)行免疫建立抗NMDAR腦炎主動(dòng)免疫小鼠模型。該研究將含有NMDA受體的蛋白脂質(zhì)體皮下注射給小鼠后誘導(dǎo)出多動(dòng)、刻板運(yùn)動(dòng)(密集旋轉(zhuǎn))、癲癇發(fā)作及嗜睡等類似人類抗NMDAR腦炎發(fā)病癥狀的表現(xiàn)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有蛋白脂質(zhì)體處理的小鼠在免疫后6周均存在GluN1和GluN2B抗體，提示蛋白脂質(zhì)體免疫可能誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)多克隆反應(yīng)，該研究認(rèn)為GluN1亞基的細(xì)胞外氨基末端結(jié)構(gòu)域(ATD)特別是N368/G369區(qū)域是作為免疫反應(yīng)性所必需的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)免疫后6周模型小鼠在海馬、紋狀體及丘腦等部位出現(xiàn)明顯的神經(jīng)炎癥和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的組織學(xué)特征，免疫細(xì)胞以激活的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞(Galectin3+)、漿細(xì)胞(CD138+)、輔助性T細(xì)胞(CD4+)、B細(xì)胞(CD20+)為主，并證實(shí)B細(xì)胞和T細(xì)胞是蛋白脂質(zhì)體誘導(dǎo)的腦炎所必需的。該模型通過使用完整的NMDA受體蛋白主動(dòng)免疫誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)暴發(fā)性腦炎，重現(xiàn)人類抗NMDAR腦炎的多種核心癥狀及組織病理學(xué)表現(xiàn)，類似于人類疾病的急性期，該模型為進(jìn)一步探究神經(jīng)炎癥及免疫因素在抗NMDAR腦炎發(fā)病中的潛在機(jī)制和新的治療方法提供了良好的體內(nèi)模型。

鑒于GluN1亞基的細(xì)胞外氨基末端結(jié)構(gòu)域在免疫反應(yīng)中的重要性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷進(jìn)行針對(duì)的主動(dòng)免疫動(dòng)物模型的探索。在2020年，Wagnon等的研究中使用針對(duì)GluN1 359-378區(qū)域的肽段免疫小鼠，該免疫小鼠出現(xiàn)認(rèn)知、情緒和行為障礙等人類抗NMDAR腦炎的典型癥狀，并觀察到腦膜及腦室周圍空間的B淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步通過阻斷B細(xì)胞應(yīng)答降低腦炎小鼠癥狀的嚴(yán)重程度，提示B淋巴細(xì)胞反應(yīng)可導(dǎo)致針對(duì)NMDAR的自身免疫反應(yīng)。Ding等通過皮下注射針對(duì)GluN1 ATD的GluN1 356-385肽的主動(dòng)免疫誘導(dǎo)高滴度的致病性抗GluN1自身抗體成功建立抗NMDAR腦炎主動(dòng)免疫小鼠模型。此免疫小鼠主要表現(xiàn)為記憶障礙，并未表現(xiàn)出如情緒障礙或自發(fā)性癲癇發(fā)作等其他抗NMDAR腦炎的癲癇癥狀。上述主動(dòng)免疫模型的建立進(jìn)一步證實(shí)了GluN1亞基的細(xì)胞外氨基末端結(jié)構(gòu)域的致病性，并為進(jìn)一步探究NMDAR抗體在體內(nèi)的作用機(jī)制提供了條件。

3 病毒感染模型

單純皰疹病毒(HSV)感染被認(rèn)為是已知的抗NMDAR腦炎誘因之一，以往研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的HSV腦炎患者血清和(或)腦脊液中檢測(cè)到NMDAR抗體，表明新的神經(jīng)癥狀與自身免疫性腦炎相符。隨后的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)27%的HSE患者會(huì)發(fā)生自身免疫性腦炎，通常與NMDAR抗體有關(guān)?；谝陨侠碚摶A(chǔ)，Linnoila等首次通過經(jīng)鼻接種HSV成功誘導(dǎo)出抗NMDAR腦炎小鼠模型。在此項(xiàng)研究中小鼠經(jīng)鼻接種HSV-1后用阿昔洛韋(ACV)治療2周，經(jīng)檢測(cè)2/3的小鼠產(chǎn)生了血清NMDAR抗體：1只在注射后3周、1只在6周和2只在注射后8周。免疫熒光染色顯示，血清NMDAR抗體陽(yáng)性的小鼠海馬突觸后膜NMDAR簇?cái)?shù)量減少，該研究未對(duì)誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)的主要癥狀進(jìn)行描述。該模型為在體內(nèi)條件下闡明病毒感染等觸發(fā)因素及免疫機(jī)制在抗NMDAR腦炎中的潛在致病機(jī)制提供了可能。

4 遺傳性模型

遺傳性動(dòng)物模型通常通過NMDAR的編碼基因進(jìn)行基因編輯實(shí)現(xiàn)。功能性NMDAR由1個(gè)共同的NR1亞基和4個(gè)NR2亞基之一(NR2A-NR2D)以不確定的比例組合而成，形成異聚受體復(fù)合物，抑制性NR3亞基也可能存在于受體復(fù)合物中。NMDAR由于其獨(dú)特的電生理學(xué)特性以及其在突觸精細(xì)化及神經(jīng)元可塑性中的作用被研究者廣泛關(guān)注。在以往的研究中，缺失各類NMDAR亞基的基因編輯小鼠模型陸續(xù)被報(bào)道。將GRIN1(編碼NMDAR的NR1亞基)敲低至表達(dá)量為正常小鼠表達(dá)水平的5%～10%時(shí)，GRIN1敲低小鼠可存活至成年，并出現(xiàn)多動(dòng)、刻板運(yùn)動(dòng)障礙及精神行為異常等癥狀。選擇性敲除海馬CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞中的NR1會(huì)引起小鼠空間記憶功能下降。此類模型主要用于探究NMDAR相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，由于其癥狀較為單一且操作相對(duì)復(fù)雜，當(dāng)前在抗NMDAR腦炎的發(fā)病機(jī)制研究中應(yīng)用尚不多。

5 總結(jié)與展望

抗NMDAR腦炎是一種嚴(yán)重的神經(jīng)免疫性疾病，闡明其發(fā)病機(jī)制并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。建立理想的動(dòng)物模型對(duì)于相關(guān)研究的開展意義重大。目前抗NMDAR腦炎尚無(wú)公認(rèn)的動(dòng)物模型，已報(bào)道的動(dòng)物模型存在一定的局限性，尚不能很好模擬人類抗NMDAR腦炎的癥狀及病理特點(diǎn)。因此，為了更好的模擬人類抗NMDAR腦炎地臨床癥狀、病理改變及發(fā)生機(jī)制，仍需構(gòu)建更為理想的動(dòng)物模型用于抗NMDAR腦炎的研究。