新型還原酶的挖掘與設(shè)計及手性醇的制備

王能強, 吳思琪, 王新鳳, 黎小軍, 徐櫻翠, 高 健

(1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院 經(jīng)濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室,湖南 湘潭 411201; 2. 新余學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室, 江西 新余 338004)

1 前 言

手性醇是一類重要手性模塊化合物，在醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有極高的應(yīng)用價值[1-3]，如(S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲醇、(S)-3-氯-1-苯基-1-丙醇和(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯可分別合成抗過敏藥物倍他司汀[4]、抗抑郁藥氟西汀[5]和降壓藥物卡托普利[6]等。利用還原酶或全細胞為催化劑不對稱生物還原潛手性羰基化合物是制備手性醇的有效途徑。還原酶是一類以NAD(P)H 為輔酶、在酶學(xué)分類上屬于短鏈脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)類，因具有立體選擇性強、反應(yīng)條件溫和、安全性和環(huán)境相容性好等特點，日益受到研究者關(guān)注，且投入大量研究工作[7-9]。隨著生物技術(shù)和手性技術(shù)的快速發(fā)展，還原酶的需求越來越大，開發(fā)更多高效、新型還原酶催化劑已成為當(dāng)前研究熱點之一。

(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇((R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol，(R)-BTPE)是合成阿瑞吡坦、福沙吡坦和羅拉吡坦等藥物的關(guān)鍵手性模塊[10-11]。(R)-BTPE 的制備方法有化學(xué)法合成[12-13]、酶法拆分[14-15]和生物催化不對稱還原[11,16-25]等，基于還原酶或全細胞為催化劑的不對稱生物還原法具有高立體選擇性、副產(chǎn)物少和理論產(chǎn)率可達100% 等特征，越來越多的還原酶或微生物細胞被報道用于不對稱還原制備(R)-BTPE，如Leifsoniaxyli[17]、Lactobacillus kefir[11,18]、Penicilliumexpansum[19]、Microbacteriumoxydans[20]、TrichodermaasperellumZJPH0801[21]、Chryseobacteriumsp.CA49[22]、Burkholderiacenocepacia[23]、Leifsoniasp.S749[24]和固定化的酮還原酶[25]等。然而，大多數(shù)報道的還原酶在生物催化制備(R)-BTPE 時存在催化活性低、底物濃度限制和反應(yīng)條件敏感等問題，不利于工業(yè)化應(yīng)用。本研究基于基因挖掘技術(shù)和還原酶保守序列分析，經(jīng)篩選和設(shè)計獲得不對稱生物催化還原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮(3,5-bis(trifluoromethyl)acetophenone，BTAP)制備(R)-BTPE 的新型還原酶SDR05；以表達還原酶SDR05 的重組大腸桿菌為催化劑，采用單因素實驗和Box-Behnken 法構(gòu)建重組菌不對稱還原BTAP 制備(R)-BTPE 的反應(yīng)體系，提高還原酶SDR05 的催化效率，克服底物濃度限制，實現(xiàn)底物在高質(zhì)量濃度下轉(zhuǎn)化。

2 材料和方法

2.1 試劑

[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮、(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇、(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇、十二烷、異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)和卡那霉素、酵母抽提物、胰蛋白胨、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)等。

2.2 菌體培養(yǎng)和收集方法

(1) 種子培養(yǎng)：從解凍的甘油管中取0.5 mL 菌液接種于裝有50 mL Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，然后置于37 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h。

(2) 重組菌靜息細胞的獲得：取1.0 mL 培養(yǎng)好的種子液，接種于裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于37 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)90 min(菌體的光密度值OD600nm為0.25～0.30)，無菌條件下加入終濃度為0.6 mmol·L-1IPTG，再置于29 ℃、150 r·min-1條件下繼續(xù)培養(yǎng)14 h，然后在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9% 的NaCl 溶液洗滌2 次，即得重組濕菌體。

2.3 還原酶基因挖掘、設(shè)計及含還原酶基因的重組菌構(gòu)建

以還原酶氨基酸序列(GenBank：AGW01025)為探針，利用基因挖掘技術(shù)從 GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中通過序列比對獲得與探針序列相似度為70%～80% 的還原酶基因，文獻檢索篩選出還原酶功能未被報道的基因為目的基因；再基于還原酶高度保守氨基酸的序列分析，對篩選獲得的目的基因進行設(shè)計，比對探針序列和已報道的相關(guān)還原酶序列，改變目的基因氨基酸殘基，使其保守氨基酸序列得以保留，得到新型還原酶基因，并在其5’和3’端添加NcoI 和Hind III 酶切位點，然后送于蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因全合成和構(gòu)建含還原酶基因的重組菌。

2.4 重組菌靜息細胞不對稱還原制備(R)-BTPE 的條件研究

(1) 單因素實驗構(gòu)建反應(yīng)體系：以2.2 節(jié)部分獲得的濕菌體為催化劑，基于單因素實驗，考察反應(yīng)溫度、緩沖液pH 值、添加劑種類和濃度、底物濃度和菌體濃度等對產(chǎn)物(R)-BTPE 產(chǎn)率的影響，構(gòu)建還原反應(yīng)體系。單因素實驗初始反應(yīng)體系：異丙醇體積分?jǐn)?shù)為25%，重組菌濕菌體質(zhì)量濃度為40 g·L-1，BTAP濃度為300 mmol·L-1和一定體積的0.1 mmol·L-1、pH 7.4 磷酸緩沖液組成5 mL 反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為30 ℃、150 r·min-1和12 h。

(2) Box-Behnken 法確定重要因素的最優(yōu)水平：基于Box-Behnken 法，考察影響重組菌催化還原反應(yīng)顯著因素(菌體濃度、異丙醇體積分?jǐn)?shù)和NAD+濃度)的交互作用，以反應(yīng)12 h 的產(chǎn)物產(chǎn)率為響應(yīng)值，通過對實驗結(jié)果二次方模型的回歸分析和方差分析，確定它們的最優(yōu)水平，驗證最優(yōu)水平下產(chǎn)物產(chǎn)率。

(3) 反應(yīng)時間和較大規(guī)模對重組菌靜息細胞制備(R)-BTPE 的影響：在以構(gòu)建獲得的重組菌靜息細胞不對稱還原BTAP 的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，考察不同反應(yīng)時間和較大規(guī)模反應(yīng)體系對生物還原制備(R)-BTPE 的影響。

2.5 酶活力、催化常數(shù)kcat 和米氏常數(shù)Km 測定

(1)酶活力測定：實驗在構(gòu)建獲得的反應(yīng)體系(異丙醇體積分?jǐn)?shù)為69%，重組菌質(zhì)量濃度為300 g·L-1，NAD+濃度為3.9 mmol·L-1，MgCl2濃度為1 mmol·L-1、BTAP 濃度為3 000 mmol·L-1和一定體積的0.1 mol·L-1、pH 7.4 磷酸緩沖液)中，32 ℃和150 r·min-1條件下，反應(yīng)30 min 后萃取，用氣相色譜法分析和計算產(chǎn)物和剩余底物濃度。定義每分鐘催化BTAP 產(chǎn)生1 μmol(R)-BTPE 所需酶量(細胞質(zhì)量，g)為一個酶活力單位(U)。

(2)催化常數(shù)kcat和米氏常數(shù)Km測定：以構(gòu)建獲得的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，分別配制底物質(zhì)量濃度為256、384、512、640 和768 g·L-1的反應(yīng)體系，在32 ℃、150 r·min-1的條件下，反應(yīng)30 min 后，乙酸乙酯萃取、離心收集乙酸乙酯相，氣相色譜法分析、計算產(chǎn)物和剩余底物濃度。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法，以產(chǎn)物(R)-BTPE 的生成速度倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)作圖，求出kcat和Km。

2.6 產(chǎn)物的分離純化及鑒定

還原反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，離心收集乙酸乙酯相，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾獲得產(chǎn)物濃縮液。產(chǎn)物濃縮液上樣硅膠層析柱，用洗脫劑(體積比V(石油醚):V(乙酸乙酯)=8:1)進行洗脫分離，用硅膠薄板層析檢測所含產(chǎn)物的收集液，合并含產(chǎn)物的收集液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾，即得產(chǎn)物。用氣相色譜法和旋光法測定產(chǎn)物純度和旋光度，用CDCl3溶解后進行氫譜1H-NMR 和碳譜13C-NMR 分析。

2.7 氣相色譜法測定產(chǎn)物產(chǎn)率和對映體過量值

還原反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用一定體積的乙酸乙酯萃取，離心收集乙酸乙酯相(即氣相分析樣品)，參照文獻[26]，采用氣相色譜法測定產(chǎn)物和剩余底物濃度，計算產(chǎn)物產(chǎn)率(yield)和對映體過量值(enantiomeric excess，ee)，方法分別為yield = (cP/c0)100%和ee = [(cR-cS)/(cS+cR)] × 100%，其中，c0為底物的起始濃度，cP為產(chǎn)物濃度，cR、cS分別為產(chǎn)物(R)-BTPE 和(S)-BTPE 的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 還原酶基因的挖掘、設(shè)計及其重組菌構(gòu)建

以LeifsoniaxyliHS0904 源還原酶(GenBank：AGW01025)為探針，利用基因挖掘技術(shù)從GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過序列比對獲得15個來源于不同微生物種屬的還原酶基因，它們與探針序列相似度為70%～80%；經(jīng)文獻檢索篩選出5 個還原酶功能未見有相關(guān)文獻報道的基因為目的基因，它們均屬于SDR 家族的氧化還原酶基因，GenBank 號分別為 WP_134172672、BAP47552、WP_066039821、WP_147782688 和WP_180934612；基于還原酶保守氨基酸的序列分析，比對目的基因與探針高度保守氨基酸殘基(如T14G15-(X)3-G19-X-G21，D65，N90-N91-A92-G93，催化四聯(lián)體N116-S144-Y157-K161，N179，P187-G188和T192。)和其他已報道具有催化功能的還原酶序列，對選定的5 個目的基因進行設(shè)計，改變其氨基酸殘基，使目的基因保留高度保守氨基酸殘基，或同時對其他位置的氨基酸進行適當(dāng)改變，獲得5 個新型還原酶(命名為SDR01、SDR02、SDR03、SDR04 和SDR05)基因，并分別進行全基因合成和構(gòu)建含相應(yīng)還原酶基因的重組菌。對構(gòu)建獲得的重組菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以培養(yǎng)獲得的重組菌靜息細胞為催化劑，進行不對稱還原BTAP 制備相應(yīng)手性醇的功能驗證。結(jié)果表明，表達還原酶SDR05 的重組菌具有較高的不對稱還原BTAP 制備(R)-BTPE 的能力(產(chǎn)物產(chǎn)率為35.1%，ee 值為99.9%)，而表達還原酶SDR01(產(chǎn)率為0)、SDR02(產(chǎn)率為0)、SDR03(產(chǎn)率為0)和SDR04(產(chǎn)率為1.2%)的重組菌沒有或僅有較低的催化能力。比對原有目的基因序列，還原酶SDR01、SDR02 和SDR03 分別改變0、1(K179N)和1(K179N)個氨基酸殘基，僅使高度保守氨基酸序列保留；還原酶SDR04 和SDR05 分別改變8(E60R/K61A/A148S/K179N/T182V/N183V/H191R/V249T)和18(L27T/R42E/G43E/E46N/T49V/V73E/E80V/A81E/P129D/V145I/S154Y/G163A/H175Y/Q178K/Q179N/A197S/A202D/A249T)個氨基酸殘基，它們不僅使高度保守氨基酸序列保留，且通過比對探針和其他已報道具有催化功能的還原酶序列，對其他位置氨基酸殘基進行改變。功能驗證和序列分析結(jié)果表明，還原酶只保留高度保守氨基酸殘基序列，不能確保其具有催化活性，其他位置的保守氨基酸對其催化活性也有較大的影響。

如圖1 所示為用ESPript 3.0[27]在線繪制的還原酶SDR05 氨基酸序列的BLAST(Basic Local alignment search tool)比對分析圖， 發(fā)現(xiàn)還原酶 SDR05 氨基酸序列與其原有目的基因[來源于Nocardioidesungokensis的還原酶(GenBank：WP_180934612)]有最高的序列相似性(92.83%)，與探針序列有81.27%的序列相似性；與文獻報道的催化制備(R)-BTPE 的Leifsoniasp. S749 源還原酶(GenBank：BAD99642)有75.70%的序列相似性。還原酶SDR05 與unclassifiedLeifsonia(GenBank：WP_018191686)、Cryocolasp. 340MFSha3.1(GenBank：WP_020077127)和Pimelobactersimplex(GenBank：WP_038681732)源的酶也有較高的序列相似性，分別為80.88%、80.48% 和80.48%。因此，SDR05 是一種新型的還原酶，確定表達還原酶SDR05 的重組菌為本研究的后續(xù)菌株。

圖1 還原酶SDR05 氨基酸序列的BLAST 比對分析(還原酶的保守序列用“*”標(biāo)記)Fig.1 Blast analysis of amino acid sequences of reductase SDR05 and other proteins (The conserved sequence of reductases were marked with "*")

3.2 構(gòu)建重組菌靜息細胞不對稱還原BTAP 的反應(yīng)體系

3.2.1 反應(yīng)溫度和緩沖液pH 值對還原反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度和緩沖液pH 值是不對稱生物還原反應(yīng)的關(guān)鍵影響因素。圖2 為不同反應(yīng)溫度和緩沖液不同pH 值對還原產(chǎn)率和ee 值的影響，從圖2 中可看出，最佳反應(yīng)溫度和緩沖液pH 值分別為32 ℃和7.4。

圖2 反應(yīng)溫度和pH值對生物催化還原的影響Fig.2 Effects of reaction temperature and pH on biocatalytic reduction

3.2.2 添加劑對還原反應(yīng)的影響

金屬離子[28]、NAD+[24]和NADP+等添加劑可作為酶蛋白結(jié)構(gòu)的一部分或作為輔助因子對酶蛋白的穩(wěn)定性和活性有一定促進作用。實驗考察了反應(yīng)體系中添加金屬離子、NAD+和NADP+等對產(chǎn)物產(chǎn)率和ee 值的影響(見圖3(a))。結(jié)果表明，反應(yīng)體系中添加MgCl2和NAD+對還原反應(yīng)有促進作用，尤其是NAD+可顯著提高產(chǎn)物產(chǎn)率，可能是因為還原酶SDR05是NADH 依賴型還原酶(輔酶依賴型與探針還原酶一致[28])，NAD+的添加能強化輔酶的再生?？疾旆磻?yīng)體系中不同濃度的MgCl2和NAD+對還原反應(yīng)的影響(見圖3(b))，結(jié)果表明，MgCl2的最佳添加濃度為1 mmol·L-1，與不添加MgCl2相比，產(chǎn)物產(chǎn)率提高了11.5%；NAD+最佳添加濃度為3 mmol·L-1，產(chǎn)物產(chǎn)率為96.1%，與不添加NAD+相比，產(chǎn)率提高了111.2%。

圖3 添加劑對生物催化還原的影響Fig.3 Effects of additives on biocatalytic reduction

3.2.3 底物濃度對還原反應(yīng)的影響

制備手性醇的底物是有機物質(zhì)，在不對稱還原反應(yīng)中，它們存在底物水溶性差、對細胞有毒性、底物抑制和產(chǎn)物抑制等問題，導(dǎo)致底物濃度受到限制，影響反應(yīng)效率。目前已報道的大多數(shù)制備(R)-BTPE 用催化劑存在底物濃度限制，不適于工業(yè)化生產(chǎn)?？疾炝说孜顱TAP 不同濃度對生物催化還原的影響，結(jié)果見圖4。隨著BTAP 濃度增大，產(chǎn)物濃度也明顯增多，但產(chǎn)物產(chǎn)率下降，BTAP 濃度為3 000 mmol·L-1時，產(chǎn)物濃度最大(943.7 mmol·L-1)，產(chǎn)物產(chǎn)率為31.5%。為了實現(xiàn)底物在高濃度下的轉(zhuǎn)化，確定反應(yīng)體系中底物添加濃度為3 000 mmol·L-1。

圖4 BTAP 濃度對生物催化還原的影響Fig.4 Effects of BTAP concentration on biocatalytic reduction

3.2.4 菌體質(zhì)量濃度對還原反應(yīng)的影響

因反應(yīng)體系底物濃度(3 000 mmol·L-1)增加，生物催化劑的用量也要提高。因此，實驗考察菌體質(zhì)量濃度對生物催化還原的影響(見圖5)。結(jié)果表明，菌體質(zhì)量濃度對產(chǎn)物產(chǎn)率有顯著影響，當(dāng)菌體質(zhì)量濃度由20 g·L-1增大到150 g·L-1時，產(chǎn)物產(chǎn)率由16.4% 提高到51.5%；繼續(xù)提高菌體質(zhì)量濃度，產(chǎn)物產(chǎn)率也繼續(xù)增大，但提高幅度不明顯。當(dāng)菌體質(zhì)量濃度為300 g·L-1時，產(chǎn)物產(chǎn)率為56.6%，菌體質(zhì)量濃度增大到400 g·L-1時，產(chǎn)物產(chǎn)率僅增加了0.5%，因此，確定最佳菌體質(zhì)量濃度為300 g·L-1。

圖5 靜息細胞質(zhì)量濃度對生物催化還原的影響Fig.5 Effects of resting cells concentration on biocatalytic reduction

3.2.5 異丙醇體積分?jǐn)?shù)對還原反應(yīng)的影響

輔酶的持續(xù)再生是生物催化不對稱還原反應(yīng)關(guān)鍵影響因素。異丙醇作為輔酶再生的偶聯(lián)基質(zhì)，其添加量對還原反應(yīng)的輔酶再生至關(guān)重要。實驗考察異丙醇體積分?jǐn)?shù)對還原產(chǎn)率和ee 值的影響(見圖6)。結(jié)果表明，隨著異丙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，產(chǎn)物產(chǎn)率大幅度提高，在異丙醇體積分?jǐn)?shù)為60% 時，產(chǎn)物產(chǎn)率最大(83.4%)，比優(yōu)化前(異丙醇體積分?jǐn)?shù)為25% 時的產(chǎn)物產(chǎn)率為56.6%)提高了47.3%，可能是因為異丙醇作為輔酶再生的偶聯(lián)基質(zhì)，能強化輔酶再生，且異丙醇作為有機溶劑，可以增加細胞膜的通透性和底物溶解性，有利于底物進入胞內(nèi)和產(chǎn)物流出胞外，從而提高還原反應(yīng)的效率；繼續(xù)提高異丙醇體積分?jǐn)?shù)，產(chǎn)物產(chǎn)率下降，可能是因為過量的異丙醇，會對菌體有毒性，使酶失活，降低反應(yīng)效率。因此，異丙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖6 異丙醇添加量對生物催化還原的影響Fig.6 Effects of isopropanol amounts on biocatalytic reduction

3.3 Box-Behnken 實驗設(shè)計篩選重要因素的最優(yōu)水平

由單因素實驗結(jié)果可知，菌體質(zhì)量濃度(A)、異丙醇體積分?jǐn)?shù)(B)和NAD+濃度(C)是影響不對稱還原制備(R)-BTPE 的顯著因素。研究采用Box-Behnken 法進行實驗設(shè)計，考察3 個顯著因素間的交互作用以及對還原反應(yīng)的影響，并確定它們最優(yōu)水平，實驗設(shè)計及實驗結(jié)果如表1 所示。表1 中A=-1、0、1 分別為菌體質(zhì)量濃度100、200、300 g·L-1對應(yīng)的水平值，B=-1、0、1 分別為異丙醇體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%對應(yīng)的水平值，C=-1、0、1 分別為NAD+濃度1、3、5 mmol·L-1對應(yīng)的水平值。

表1 Box-Behnken法實驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of Box-Behnken method

利用Design-Expert 10.0.7 軟件，對表1 響應(yīng)值(產(chǎn)率)進行模型二次方回歸分析和方差分析(見表2)，建立二次回歸方程Y= 70.58 + 12.24A+ 6.50B+ 1.84C+6.80AB-0.22AC- 0.95BC-3.93A2-8.40B2- 0.93C2。模型方程決定系數(shù)R2、校正決定系數(shù)R2adj和預(yù)測決定系數(shù)R2pred分別為0.998、0.996 和0.978，它們的數(shù)值均接近于1，且相互間的差值較小，表明模型的擬合程度良好，模型可較準(zhǔn)確反映實驗值，可較好地預(yù)測結(jié)果和優(yōu)化試驗參數(shù)。由表2 可知，模型一次項A和B、二次項A2和B2、交叉項AB具有高度顯著性(概率p＜0.000 1)，模型一次項C，二次項C2，交叉項BC具有顯著性(p＜0.050 0)。二次回歸方程的三維響應(yīng)面曲線圖(見圖7)也表明，因素A(菌體質(zhì)量濃度)和B(異丙醇體積分?jǐn)?shù))為顯著變量，對產(chǎn)物產(chǎn)率影響較大，而C(NAD+濃度)在選定濃度范圍內(nèi)僅有輕微影響，結(jié)果與文獻[24]報道一致。此外，回歸模型的高F檢驗統(tǒng)計量值(F值=445.13)和低概率(p＜0.000 1)表明，回歸模型方程具有高度顯著性，可以預(yù)測最佳反應(yīng)條件。預(yù)測結(jié)果為菌體質(zhì)量濃度300 g·L-1、異丙醇體積分?jǐn)?shù)69% 和NAD+濃度3.9 mmol·L-1，模型預(yù)期產(chǎn)物產(chǎn)率為84.4%。由于預(yù)測的最佳反應(yīng)條件未包括在實驗設(shè)計的17 組實驗中，需驗證和確認(rèn)模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。驗證試驗結(jié)果表明，產(chǎn)物產(chǎn)率為88.1%，稍高于預(yù)期的產(chǎn)率，基本與預(yù)期產(chǎn)率相符。

表2 Box-Behnken法二次方模型的回歸分析和方差分析Table 2 Regressive analysis and ANOVA results of the Box-Behnken quadratic model

圖7 Box-Behnken 實驗二次回歸方程的三維響應(yīng)面曲線圖Fig.7 Analysis of the experimental results by Box-Behnken method

3.4 反應(yīng)時間和較大規(guī)模對重組菌靜息細胞制備(R)-BTPE的影響

在50 mL 反應(yīng)瓶中加入質(zhì)量濃度為300 g·L-1的重組菌、體積分?jǐn)?shù)為69%的異丙醇、濃度為3.9 mmol·L-1的NAD+、1 mmol·L-1的MgCl2、3 000 mmol·L-1的BTAP 和一定體積的pH 7.4 的磷酸緩沖液組成5 mL 反應(yīng)體系，在32 ℃和150 r·min-1條件下分別反應(yīng)不同時間。結(jié)果表明(見圖8)，隨著反應(yīng)時間的延長，產(chǎn)物產(chǎn)率增大，當(dāng)時間為18 h，產(chǎn)物產(chǎn)率為 98.3%，繼續(xù)延長時間，產(chǎn)物產(chǎn)率增加不大(98.8%/21h，99.1%/24h)，因此，確定反應(yīng)時間為18 h。整個反應(yīng)過程中，產(chǎn)物ee 值變化不大，都保持在99.9% 以上。研究結(jié)果與優(yōu)化前相比，BTAP 濃度由300 mmol·L-1提高到3 000 mmol·L-1，實現(xiàn)底物在高濃度下轉(zhuǎn)化；與文獻報道的不對稱生物還原制備(R)-BTPE 用還原酶相比，如Chryseobacteriumsp.CA49 源還原酶ChKRED20[22](底物濃度為586 mmol·L-1，產(chǎn)率為92%)、Codexis源還原酶P1B2[25](底物濃度為586 mmol·L-1，產(chǎn)率為97%)、LeifsoniaxyliHS0904 源突變還原酶LXCAR-S154Y[29](底物濃度為1 000 mmol·L-1，產(chǎn)率為98.7%)、Lactobacillus kefir源還原酶LkCR[18](底物濃度為1 191 mmol·L-1，產(chǎn)率為96.7%)和Leifsoniasp.S749 源還原酶KR01[24](底物濃度為2 344 mmol·L-1，產(chǎn)率為98.3%)等，本研究篩選和設(shè)計獲得的新型還原酶SDR05 具有最高的底物濃度(底物濃度為3 000 mmol·L-1，產(chǎn)率為98.3%)。

圖8 反應(yīng)時間對重組菌制備(R)-BTPE 的影響Fig.8 Effects of reaction time on (R)-BTPE preparation by recombinant E. coli cells

進一步考察了較大規(guī)模反應(yīng)體系(2.0 L反應(yīng)瓶中加0.4 L反應(yīng)液)對制備(R)-BTPE的影響。結(jié)果表明，在32 ℃、150 r·min-1的條件下反應(yīng)18 h，產(chǎn)物產(chǎn)率和ee值分別為97.8% 和99.9%。單位質(zhì)量(每克)細胞產(chǎn)生產(chǎn)物量為9.8 mmol·L-1，與文獻報道的最高值7.7 mmol·L-1相比[24]，提高了27.2%。

3.5 酶活力、催化常數(shù)kcat和米氏常數(shù)Km測定

在構(gòu)建獲得的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，測得還原酶SDR05的酶活力為0.023 U，單位質(zhì)量每克菌體細胞酶活力為43.5 U。以產(chǎn)物(R)-BTPE的生成速度倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)作圖獲得雙倒數(shù)方程y=62.665x+0.207(R2=0.992)，得出Vmax(最大反應(yīng)速率)、Km和kcat分別為4.8 g·L-1·min-1、300.8 g·L-1和0.016 min-1。

3.6 產(chǎn)物的分離純化與鑒定

上述較大規(guī)模制備(R)-BTPE 的反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾和硅膠柱層析等方法分離，獲得274 g 的分離產(chǎn)物，分離收率為90%，經(jīng)氣相色譜檢測，產(chǎn)物純度為99% 以上。分離產(chǎn)物經(jīng)CDCl3溶解后進行1H-NMR 和13C-NMR 鑒定[1H-NMR (600 MHz, CDCl3):7.83 (單峰s，2H)，7.79 (s，1H)，5.04 (四重峰q，1H，耦合常數(shù)J=6.78 Hz)，2.46 (s, 1H)，1.56 (雙峰d，3H，J=6.78 Hz)]，碳譜13C-NMR(100 Hz，CDCl3)，化學(xué)位移δ= 147.9，131.7，131.8，125.6，124.9，121.8，121.1，119.4，69.4，25.5]，確定分離產(chǎn)物為BTPE，再經(jīng)過旋光度測定([α]D25= +21.5)及與標(biāo)準(zhǔn)品(R)-BTPE 的氣相結(jié)果比對分析，確證產(chǎn)物為(R)-BTPE。

4 結(jié) 論

基于基因挖掘技術(shù)和還原酶保守序列分析，經(jīng)篩選和設(shè)計獲得新型還原酶SDR05；以表達還原酶SDR05 的重組菌為催化劑，通過向反應(yīng)體系中添加異丙醇和NAD+，強化輔酶再生，獲得了不對稱還原BTAP 制備(R)-BTPE 的反應(yīng)體系(質(zhì)量濃度為300 g·L-1的重組菌，濃度為3.9 mmol·L-1的NAD+，濃度為1 mmol·L-1的MgCl2，體積分?jǐn)?shù)為69% 的異丙醇，濃度為3 000 mmol·L-1的BTAP 和一定體積的0.1 mol·L-1、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液)和反應(yīng)條件(32 ℃、150 r·min-1和18 h)，提高了還原反應(yīng)效率(產(chǎn)物產(chǎn)率98.3% 和ee 值99.9%)，克服了底物濃度限制，實現(xiàn)底物在高質(zhì)量濃度(768 g·L-1)下的轉(zhuǎn)化，為工業(yè)化制備(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇等手性化合物奠定了基礎(chǔ)。