β-煙酰胺單核苷酸對(duì)塵肺大鼠呼吸肌疲勞的改善作用及其線粒體相關(guān)機(jī)制

劉 薇，何 君，侯 玲，王 濤，季 方*

（1南京市職業(yè)病防治院藥劑科，南京 210042；2中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院新藥篩選中心，南京 210009）

塵肺病是我國(guó)職業(yè)病患者中最大的群體，塵肺病一旦發(fā)生，呈進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重降低患者勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量，且給國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，迄今國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有針對(duì)塵肺病纖維化有效的治療藥物和措施［1］。臨床研究顯示，包括塵肺在內(nèi)的慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者由于氣道阻力持續(xù)增加，并長(zhǎng)期處于低氧血癥、二氧化碳滯留及全身營(yíng)養(yǎng)不良的狀態(tài)下，容易發(fā)生呼吸肌疲勞（inspiratory muscle fatigue/weakness），不能產(chǎn)生及維持一定的肌力，進(jìn)而與原有的呼吸障礙形成惡性循環(huán)，最終可導(dǎo)致呼吸衰竭［2-3］。

呼吸肌疲勞的治療，目前主要有機(jī)械通氣、藥物、呼吸肌訓(xùn)練等。茶堿類、咖啡因等藥物有增強(qiáng)呼吸肌收縮力的作用，但缺乏確切的臨床療效數(shù)據(jù)，且長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)發(fā)生率較高；此外，機(jī)械輔助通氣屬于短期對(duì)癥治療，長(zhǎng)期應(yīng)用的難度很大且不良反應(yīng)發(fā)生率較高［4］。

以膈肌為主的呼吸肌屬于骨骼肌，是高能量需求組織，也是機(jī)體中線粒體含量最高的組織之一。在線粒體的呼吸功能方面，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，輔酶I）濃度對(duì)肌肉細(xì)胞線粒體ATP合成及氧化還原反應(yīng)能力具有直接調(diào)控作用，在維持線粒體及細(xì)胞正常功能中有著重要的作用［5］。β-煙酰胺單核苷酸（NMN）是NAD+最直接的前體，補(bǔ)充NMN 可以增加體內(nèi)NAD+含量并且能改善線粒體功能，NAD+補(bǔ)充策略在多種疾病中都發(fā)揮了有益作用［6］。本研究采用大鼠塵肺模型，考察NMN 對(duì)呼吸肌疲勞的改善作用，并探討線粒體功能相關(guān)機(jī)制。

1 材 料

1.1 試劑與試藥

β-煙酰胺單核苷酸（NMN，純度大于95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；石英粉（粒徑小于5μm，江蘇聯(lián)瑞新材料股份有限公司），采用生理鹽水制備成50 mg/mL 懸液供造模用。無(wú)菌生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；琥珀酸脫氫酶（SDH）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）等生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）。線粒體分離試劑盒和線粒體膜電位（JC-1）檢測(cè)試劑（碧云天生物技術(shù)有限公司）；組織ATP 檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

BS210S 精密電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；TL 系列中高通量組織細(xì)胞研磨破碎儀（北京鼎昊源科技有限公司）；BL-420F 生物機(jī)能系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；i-STAT 血?dú)夥治鰞x及CG4+芯片（美國(guó)雅培床旁監(jiān)護(hù)有限公司）；VarioskanLux 多功能酶標(biāo)儀，AppliedBiosystemsStepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)SD大鼠，180~220 g，雄性，杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0002。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物中心［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2021-0011］，實(shí)驗(yàn)室溫度（24±2）℃；相對(duì)濕度60%~80%；每小時(shí)空氣交換次數(shù) 10 ~ 15 次；正常光照周期（12 h 光照/12 h 黑暗），每籠不超過(guò)5 只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 模型建立

參考《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南》及文獻(xiàn)方法，將研磨過(guò)的石英粉（99%粉塵顆粒直徑≤5 μm）用生理鹽水制備成50 mg/mL混懸液，供造模用。

SD 大鼠麻醉臥位固定，于頸部切口，分離肌肉，暴露氣管，將石英粉塵混懸液1 mL經(jīng)氣管慢速注入（10 s），注射完畢豎立大鼠，保持大鼠直立體位，并按摩雙肺10 次，使粉塵進(jìn)入肺內(nèi)并均勻分布。注射完畢，縫合頸部肌肉和皮膚，標(biāo)記并分籠飼養(yǎng)。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用本方法約在造模后3 個(gè)月左右出現(xiàn)明顯的肺纖維化及呼吸狀態(tài)改變，肺組織病理檢查可見(jiàn)中度的肺泡炎（HE 染色）和肺纖維化（Masson 染色），接近塵肺病病變特征［7］。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

取上述造模大鼠48 只，根據(jù)體重隨機(jī)分為以下3 組：模型組（生理鹽水）、NMN 300 mg/kg、NMN 150 mg/kg；另取16 只正常大鼠作為空白對(duì)照組。大鼠灌胃給藥，每天1 次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥4周，給藥體積均為1 mL/kg。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 一般狀況觀察及體重測(cè)定 每天給藥前，觀察大鼠毛色、行為、運(yùn)動(dòng)等一般狀態(tài)，重點(diǎn)觀察呼吸系統(tǒng)的相關(guān)癥狀，包括：呼吸困難，腹式呼吸，喘息，呼吸暫停，紫紺，呼吸急促，鼻分泌物等。每周測(cè)定體重1次，并根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

2.3.2 呼吸功能測(cè)定 于給藥4 周后，進(jìn)行呼吸功能測(cè)定。大鼠采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）注射麻醉，仰臥固定，在劍突連線于肌力換能器，并連于生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上，用張力4.9×10-2N 定標(biāo)，記錄呼吸曲線，測(cè)算呼吸頻率和呼吸幅度（生物機(jī)能軟件根據(jù)呼吸波峰谷值計(jì)算平均張力，以平均張力表示呼吸幅度）。

2.3.3 血?dú)夥治?自頸動(dòng)脈取新鮮抗凝全血，采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)鈪?shù)：pH、氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）和血氧飽和度（SaO2）。

2.3.4 膈肌收縮功能及疲勞實(shí)驗(yàn) 每組取大鼠8只，斷頭處死，開(kāi)胸速取膈肌，包括中心腱及部分肋骨，置于充滿Kreb's 液（NaCl 135 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO41 mmol/L，NaH2PO41 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，KCl 5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，pH 7.3 ~ 7.4）的玻璃平皿中，持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣體。每塊膈肌沿中心腱分成兩半，右半膈肌去除肋骨中心腱脂肪及結(jié)締組織，用冷磷酸緩沖液（PBS）洗去血液，濾紙吸干稱重備生化測(cè)定用。左半膈肌中部剪出1 條0.4 cm × 1.5 cm 的肌條，參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行膈肌張力及疲勞測(cè)定，記錄張力-頻率曲線，并計(jì)算疲勞指數(shù)（fatigue index，F(xiàn)I）［8］。

2.3.5 膈肌線粒體功能檢測(cè) 每組取大鼠8只新鮮膈肌組織，常規(guī)制備組織勻漿，采用線粒體分離試劑盒，提取純化膈肌線粒體，分別采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位（ΔΨm，JC-1 染色）和 ATP水平。

2.3.6 膈肌氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 每組取大鼠8只凍存膈肌組織，常規(guī)制備組織勻漿，取上清液檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及琥珀酸脫氫酶（SDH）活性變化，考察膈肌組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

2.3.7 膈肌線粒體生物發(fā)生信號(hào)分子表達(dá) 每組取大鼠8 只凍存膈肌組織，采用Real time PCR檢測(cè)線粒體生物發(fā)生信號(hào)分子的mRNA 表達(dá)水平，包括：沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活因子1α（Pgc-1α），核呼吸因子1（Nrf1），線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（Tfam）。引物序列見(jiàn)表1。

Table 1 Primer sequences of real time PCR

Real time PCR 檢測(cè)：Trizol 一步法提取組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 2 min，獲得的 cDNA 樣品-80 ℃保存。取96 孔PCR 板，依次加入下列成分（總體積20 μL）：EvaGreensupermix 10 μL，混合引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 1 μL，超純水8 μL。渦旋混勻，1 500 r/min，離心2 min，按下列循環(huán)條件反應(yīng)：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s/60 ℃，10 s，40 個(gè)循環(huán)；65 ℃ ~95 ℃，10 min。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié) 果

3.1 一般狀況觀察及體重測(cè)定

給藥期間各組大鼠精神狀態(tài)較好，模型組部分大鼠可見(jiàn)呼吸頻率有所增加，其他未見(jiàn)明顯異常。與正常對(duì)照組相比，模型大鼠體重接近，NMN給藥對(duì)大鼠體重亦未見(jiàn)明顯影響（表2）。

Table 2 Effect of β-nicotinamide mononucleotide(NMN)(ig)on body weight of pneumoconiosis rats(,n=8)

Table 2 Effect of β-nicotinamide mononucleotide(NMN)(ig)on body weight of pneumoconiosis rats(,n=8)

images/BZ_99_260_1208_2219_1325.pngControl Model NMN 439.7±25.5 427.7±28.8 428.6±27.2 428.9±21.6 300 150 455.0±23.1 440.9±15.4 451.9±21.7 447.9±24.0 472.7±16.2 453.9±15.6 458.4±22.4 453.9±23.6 482.1±18.4 469.3±13.9 472.6±26.1 465.6±24.0 492.7±17.3 480.9±13.4 483.6±32.7 478.7±25.8

3.2 呼吸功能測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，模型大鼠呼吸狀態(tài)出現(xiàn)明顯改變，呼吸頻率增加而呼吸幅度下降（P ＜0.01），提示呼吸功能的顯著改變。NMN 給藥可以明顯改善模型大鼠的呼吸狀態(tài)，300 mg/kg 組呼吸頻率和呼吸幅度均有明顯改善（P ＜0.05）（表3）。

3.3 血?dú)夥治?/h3>

如表4 所示，模型組大鼠血液pH、PaO2和SaO2均顯著降低，而PaCO2顯著升高（P ＜ 0.01），表明動(dòng)物出現(xiàn)明顯的呼吸通氣障礙。NMN 高、低劑量組可明顯增加模型大鼠PaO2和SaO2（P ＜0.05），改善呼吸通氣功能。

Table 3 Effects of NMN(ig)on respiratory parameters of pneumoconiosis rats(,n=8)

Table 3 Effects of NMN(ig)on respiratory parameters of pneumoconiosis rats(,n=8)

**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05 vs model group

Respiratory amplitude/（×10-2 N）3.4±0.2 2.8±0.3**3.1±0.1#3.1±0.1#Group Control Model NMN Dosage/(mg/kg)300 150 Respiratory rate/(times/min)103.0±8.2 119.6±11.8**109.4±4.3#112.6±4.4

Table 4 Effect of NMN(ig)on blood gas composition of pneumoconiosis rats(,n=8)

Table 4 Effect of NMN(ig)on blood gas composition of pneumoconiosis rats(,n=8)

PaCO2:Partial pressure of carbon dioxide in artery;PaO2:Partial pressure of oxygen in artery;SaO2:Oxygen saturation;1 mmHg=133.3 Pa**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 vs model group

images/BZ_99_260_2375_2219_2433.png94.8±3.5 86.0±3.9**91.0±2.9#90.5±2.5#Control group Model group NMN300 150 7.3±0.2 6.8±0.2**7.1±0.2##7.0±0.2 39.8±2.6 47.4±3.5**42.3±4.4#44.4±3.5 89.3±3.9 81.7±3.4**86.7±3.3#85.7±3.0#

3.4 膈肌收縮功能及疲勞實(shí)驗(yàn)

分別記錄10，20，40，60，100 Hz 刺激下的膈肌收縮力，并采用肌肉橫截面積（CSA）進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，繪出張力-頻率曲線（圖1-A）。然后以50 Hz 刺激頻率，持續(xù)刺激膈肌條2 min 作疲勞實(shí)驗(yàn)，求得膈肌在重復(fù)刺激后收縮力占刺激開(kāi)始時(shí)的百分比，即疲勞指數(shù)（圖1-B）。與正常大鼠相比，塵肺大鼠膈肌的收縮力和疲勞指數(shù)均顯著下降（P ＜0.01），表明膈肌功能減弱，NMN 可明顯改善模型大鼠膈肌的收縮功能和疲勞指數(shù)（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。

Figure 1 Effects of NMN(ig)on contractility(A)and fatigue index(B)of isolated diaphragm in pneumoconiosis rats(,n = 8)**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 vs model group

3.5 膈肌線粒體功能檢測(cè)

與正常大鼠相比，塵肺模型大鼠膈肌ATP 含量和線粒體膜電位（ΔΨm）均顯著降低（P ＜ 0.01），提示膈肌出現(xiàn)能量代謝障礙和線粒體功能異常，NMN 300 mg/kg 具有明顯改善作用（P ＜ 0.05），而150 mg/kg組的病變也可見(jiàn)一定的減輕（圖2）。

Figure 2 Effects of NMN (ig) on ATP content and mitochondrial membrane potential（ΔΨm）of diaphragm in pneumoconiosis rats (,n = 8)**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 vs model group

3.6 膈肌氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠膈肌琥珀酸脫氫酶（SDH）活力顯著下降（P ＜0.01），提示線粒體氧化代謝功能障礙。同時(shí)超氧化物歧化酶（SOD）活力下降、丙二醛（MDA）水平增加（P ＜0.05），表明膈肌組織出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損害。NMN 灌胃給藥可以顯著增加模型組大鼠膈肌SDH和SOD活力，同時(shí)降低MDA水平（表5）。

Table 5 Effects of NMN (ig) on the levels of succinate dehydrogenase(SDH),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)of diaphragm in pneumoconiosis rats(,n = 8)

Table 5 Effects of NMN (ig) on the levels of succinate dehydrogenase(SDH),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)of diaphragm in pneumoconiosis rats(,n = 8)

*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05 vs model group

SDH/(U/mg prot)35.6±3.2 20.3±2.7**30.4±2.8#28.8±2.5#Group Control Model NMN Dosage/(mg/kg)300 150 MDA/(nmol/mg prot)6.87±0.97 9.34±1.12*7.87±0.98#8.12±0.94 SOD/(U/mg prot)87.3±7.3 63.8±7.1*79.3±6.3#75.1±6.9

3.7 膈肌線粒體生物發(fā)生信號(hào)分子表達(dá)

與正常大鼠相比，塵肺模型大鼠膈肌組織Sirt1、Pgc-1α、Nrf1 和Tfam 等線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因的mRNA 水平均顯著下調(diào)（P ＜ 0.01），NMN高、低劑量組灌胃給藥可以顯著上調(diào)模型組大鼠膈肌中線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)（P ＜0.05，P ＜ 0.01）（圖 3）。

4 討 論

塵肺是伴有進(jìn)展性和實(shí)質(zhì)性肺組織損害的嚴(yán)重肺部疾病，以膈肌為主的呼吸肌是塵肺長(zhǎng)期呼吸障礙狀態(tài)下的易損器官。

本研究采用的塵肺模型出現(xiàn)明顯的呼吸狀態(tài)改變（呼吸頻率增加，呼吸幅度下降），同時(shí)呼吸通氣功能也顯著抑制（血液pH、PaO2和SaO2均顯著降低，而PaCO2顯著升高），與既往研究一致［9］。NMN灌胃給藥可以改善塵肺大鼠呼吸頻率和呼吸幅度，同時(shí)顯著糾正血?dú)獬煞值淖兓?，由此表明本?shí)驗(yàn)條件下NMN灌胃給藥對(duì)于塵肺大鼠呼吸功能具有明確的改善作用。同時(shí)，NMN 可顯著改善塵肺大鼠膈肌的收縮力和疲勞指數(shù)，并升高膈肌組織ATP水平，這可能是其改善呼吸功能的重要基礎(chǔ)［10］。

Figure 3 Effects of NMN(ig)on mRNA expression levels of mitochondrial biogenesis related genes of diaphragm in pneumoconiosis rats (,n = 8)**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 vs model group

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)線粒體異?？稍斐陕宰枞苑尾』颊吖趋兰」δ苷系K，包括呼吸肌疲勞和外周骨骼肌萎縮［11-13］。本實(shí)驗(yàn)中塵肺大鼠膈肌線粒體膜電位降低，同時(shí)SDH 活力顯著下降，提示線粒體氧化代謝功能障礙。同時(shí)SOD 活力下降、MDA水平增加，表明膈肌組織出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損害。NMN 灌胃給藥對(duì)于模型大鼠線粒體功能具有明顯的改善作用，同時(shí)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，由此表明其改善呼吸肌疲勞的作用機(jī)制可能與線粒體調(diào)節(jié)作用相關(guān)［14-15］。

骨骼肌可通過(guò)線粒體生物發(fā)生（mitochondrial biogenesis）調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和功能，進(jìn)而適應(yīng)組織能量代謝的變化［16］。SIRT1 是一種 NAD+依賴的脫乙?；福诩?xì)胞能量感知和線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其下游蛋白即包括PGC-1α，而PGC-1α 是目前已知調(diào)控線粒體生物發(fā)生最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，NRF1 和TFAM 是線粒體重要功能蛋白，其表達(dá)量可以反映線粒體生物發(fā)生的水平［17-18］。本實(shí)驗(yàn)中，NMN 給藥可以顯著上調(diào)模型組大鼠膈肌中線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)，此作用與NMN 其他相關(guān)研究報(bào)道一致，這可能是NMN 調(diào)節(jié)膈肌線粒體功能，改善呼吸肌疲勞的潛在機(jī)制［19-20］。

綜上，本研究結(jié)合當(dāng)前塵肺病臨床防治需求和NMN 藥理作用特點(diǎn)，通過(guò)大鼠塵肺模型，考察NMN 對(duì)呼吸肌疲勞的改善作用及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，NMN 灌胃給藥可以調(diào)節(jié)塵肺模型大鼠膈肌線粒體功能，改善膈肌能量代謝，增強(qiáng)膈肌收縮功能，進(jìn)而改善呼吸和通氣狀態(tài)，此作用可能通過(guò)SIRT1/PGC-1α/NRF1、TFAM 途徑促進(jìn)膈肌線粒體生物發(fā)生而介導(dǎo)。多項(xiàng)研究表明，增強(qiáng)線粒體功能是運(yùn)動(dòng)鍛煉改善骨骼肌功能的重要機(jī)制［21-23］，基于本研究結(jié)果，NMN 與呼吸肌訓(xùn)練聯(lián)合對(duì)塵肺病呼吸肌疲勞將具有潛在的協(xié)同作用。此外，鑒于塵肺病的主要病因是肺組織持續(xù)和進(jìn)展性的炎癥、纖維化等病變，后續(xù)研究可以關(guān)注NMN對(duì)塵肺模型肺部組織病變的影響，同時(shí)探索NMN 與漢防己甲素等抗肺纖維化藥物聯(lián)合應(yīng)用，考察NMN 改善肺纖維化方面的潛力，進(jìn)而為其臨床應(yīng)用提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。