超聲造影聯(lián)合免疫組織化學(xué)診斷小肝細(xì)胞癌微血管侵犯：兩個醫(yī)院的回顧性研究

王斐倩 沼田和司 阮驪韜 中野雅行 白曉旭 劉鈺鑫 曲凱

作者單位：710061 西安 1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科；232-0024 橫濱 2日本橫濱市立大學(xué)附屬市民綜合醫(yī)療中心消化器病中心；92-0024 東京 3日本東京都中央?yún)^(qū)中央病理實驗室；710061 西安 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院4肝膽外科，5生物樣本信息資源中心

微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）被公認(rèn)為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）切除術(shù)后復(fù)發(fā)常見的危險因素，甚至被認(rèn)為是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的唯一或最重要的危險因素［1］。HCC的MVI發(fā)生率為15.0%～57.1%［2］，存在MVI的患者3年無復(fù)發(fā)生存率從62.5%降至27.7%［3］。HCC手術(shù)治療（包括肝切除術(shù)、射頻消融術(shù)等）前及早發(fā)現(xiàn)MVI對臨床決策，如手術(shù)方式（是否考慮術(shù)后輔助治療）和切除范圍（對存在MVI的病灶采取＞1 cm的寬手術(shù)切緣）的規(guī)劃具有重要的指導(dǎo)意義［4-5］。已有研究顯示，針對MVI陽性的HCC患者，采用解剖性肝切除或經(jīng)動脈化療栓塞、射頻消融等局部聯(lián)合治療可降低腫瘤復(fù)發(fā)率［6-7］。MVI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是在顯微鏡下、于腫瘤周圍可見血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的癌細(xì)胞巢團（以癌旁門靜脈分支為主），且沒有肉眼可見的腫瘤血管侵犯［8］。由于MVI診斷對標(biāo)本完整性有一定要求（包含癌旁組織），因此無法使用肝癌穿刺活檢標(biāo)本，而是使用手術(shù)切除后的標(biāo)本進行MVI診斷［9］。這一特點導(dǎo)致MVI診斷通常是在手術(shù)后完成，因此具有顯著滯后性［10］。開發(fā)術(shù)前準(zhǔn)確診斷MVI的方法將有助于外科醫(yī)師制定更完善的手術(shù)規(guī)劃，同時可將系統(tǒng)治療前置，以進一步降低腫瘤復(fù)發(fā)率。

超聲造影（contrast enhanced ultrasound，CEUS）因?qū)崟r性、無創(chuàng)性、無放射性、造影劑過敏反應(yīng)低、診斷結(jié)果可以立即獲得、價格低廉、易操作、可重復(fù)使用等優(yōu)點而被日本的肝癌治療指南推薦為肝癌高危人群的篩查工具［11］。此外，近年發(fā)展起來的第二代新型超聲造影劑示卓安?（Sonazoid?）有獨特的血管后期（post-vascular phase，PVP），可延長造影后期的觀察時間，大大增加了診斷信息［12］。鑒于CEUS在診斷HCC中的重要價值，近年來已有研究嘗試將CEUS從診斷HCC擴展到應(yīng)用于診斷MVI并取得了一些有意義的結(jié)果。例如，存在MVI的病灶邊緣區(qū)域和周圍肝實質(zhì)的造影劑濃度/時間速率在造影劑進入和洗脫時都表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異［13］。還有研究顯示，動脈期（arterial phase，AP）癌旁的造影劑高灌注是MVI發(fā)生的獨立危險因素［14］。然而，目前有關(guān)CEUS診斷MVI的研究大多圍繞腫瘤形態(tài)及造影劑彌散特征而展開，且仍然存在假陽性率高等局限性。因此，如何進一步提高CEUS的MVI診斷效率，是當(dāng)前亟需突破的難點問題。

現(xiàn)有研究顯示，表達特異性分子標(biāo)志物的HCC患者MVI陽性比例明顯升高。JEON等［15］研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC3）表達陽性的HCC患者比GPC3陰性患者更易發(fā)生MVI。熱休克蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）的表達水平與HCC患者的組織學(xué)分級、腫瘤的間質(zhì)侵襲以及新生血管有關(guān)［16-17］。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）法只需觀察癌細(xì)胞有無染色即可，因此降低了病理閱片難度，減少了讀片時間，理論上也能降低不同操作者之間的誤差。更重要的是IHC不需在腫瘤交界處多位點取材以觀察癌旁微血管，穿刺活檢取得的少量標(biāo)本即可獲得診斷。因此，本研究嘗試?yán)眯g(shù)前的穿刺活檢標(biāo)本進行GPC3和HSP70染色，同時結(jié)合CEUS的AP和PVP癌旁灌注情況，探討以上指標(biāo)單獨和聯(lián)合診斷HCC的MVI的效能，以期尋找MVI的術(shù)前最佳診斷策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2017年1月至2019年12月來自日本橫濱市立大學(xué)附屬市民綜合醫(yī)療中心和同時期西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院共419例HCC患者的1 029個病灶。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴成年患者（≥18歲）；⑵均依次實施CEUS、穿刺活檢、手術(shù)切除；⑶經(jīng)組織病理學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)明確診斷有無MVI。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴Child-Pugh分級為C級（56例，253個）；⑵CEUS、穿刺活檢、切除術(shù)其中之一缺失（140例，384個）；⑶CEUS、穿刺、手術(shù)切除間隔超過1個月（37例，69個）；⑷手術(shù)標(biāo)本的組織病理學(xué)未能明確MVI的診斷（6例，9個）；⑸經(jīng)過治療后的病灶（10例，62個）；⑹病灶最大直徑＞3 cm（28例，75個）。經(jīng)過上述篩選后，本研究納入142例HCC患者共177個病灶，其中包含23例患者的37個MVI陽性病灶和119例患者的140個MVI陰性病灶。本研究經(jīng)日本橫濱市立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的倫理審查委員會（編號：B180200054）和西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會（編號：2021-461）批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言的原則。本研究為回顧性研究，故豁免患者知情同意書。

本研究憑借手術(shù)切除獲得標(biāo)本并在鏡下進行有無MVI診斷作為診斷MVI的金標(biāo)準(zhǔn)。通過回顧性檢索電子病歷系統(tǒng)、影像學(xué)圖文報告系統(tǒng)獲得患者的一般臨床特征（包括年齡、性別、肝炎病史、Child-Pugh分級）和病灶的一般特征（包括病灶大小、所屬肝臟節(jié)段），通過檢索病理系統(tǒng)中的穿刺標(biāo)本信息獲得IHC診斷信息。曾實施術(shù)前穿刺活檢的患者（病灶）主要來源于HCC診斷證據(jù)不足（例如甲胎蛋白未見明顯升高以及缺乏典型影像學(xué)特征等），或患者同時期進行其他臨床研究且要求手術(shù)切除的病灶術(shù)前已進行穿刺活檢（HCC診斷需組織病理學(xué)診斷明確）。

1.2 CEUS檢查方法

采用配有CEUS功能的LOGIQ E9超聲診斷系統(tǒng)（GE，美國），凸陣探頭頻率為2～5 MHz，機械指數(shù)為0.2～0.3。日本橫濱市立大學(xué)附屬市民綜合醫(yī)療中心患者的CEUS操作由1名工作5年的超聲技師和1名工作20年的消化科醫(yī)師協(xié)作完成；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院患者的CEUS操作由2名工作5年以上的超聲科醫(yī)師協(xié)作完成?；颊呷⊙雠P或側(cè)臥位，給予肘正中靜脈彈丸式注射0.2 mL示卓安?微泡混懸液，然后立即靜脈推注2 mL 5%葡萄糖；分別在注射造影劑后10～30 s的AP及10 min后的PVP觀察病灶較周圍同深度肝臟實質(zhì)組織的造影劑灌注情況，判斷為低灌注或等灌注（圖1）。若病灶因位置過深、肝硬化背景等原因顯示欠清晰，則采用高機械指數(shù)成像或在PVP再次注射造影劑進行觀察［12］。

1.3 穿刺活檢及IHC檢查

采用超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮經(jīng)肝細(xì)針穿刺抽吸術(shù)，以21G活檢針（SONOPSY，日本）于癌灶處獲取至少2條組織標(biāo)本。所有組織均經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)等厚（3～4 μm）切片，采用HSP70和GPC3的抗體進行IHC染色，顯微鏡下觀察。HSP70陽性指腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿被染色，GPC3陽性指腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜被染色，以超過5%的細(xì)胞被染色定義為陽性（只進行有無染色判斷，不考慮染色強度），見圖1。由1名實驗員在不知曉患者臨床、實驗室、影像學(xué)檢查等信息的前提下記錄染色結(jié)果。

圖1 發(fā)生MVI的1例HCC病灶的CEUS和病理圖片F(xiàn)ig.1 Contrast-enhanced ultrasound and pathologic images of one HCC lesion with MVI

1.4 MVI診斷金標(biāo)準(zhǔn)

采用開放式或腹腔鏡手術(shù)方式切除肝臟癌灶，大體觀察癌灶后，每隔10 mm切片，癌周非癌肝組織每5 mm切片至包膜外30 mm，于腫瘤壞死區(qū)、非壞死區(qū)、包膜區(qū)內(nèi)及包膜區(qū)外非癌肝組織多點取材，然后石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察。由2名具有10年以上肝臟病理工作資歷的病理科醫(yī)師在不知曉患者臨床、實驗室、影像學(xué)檢查等信息情況下共同完成MVI診斷。本研究用于診斷MVI的指標(biāo)包括 CEUS指標(biāo)（AP、PVP）和 IHC指標(biāo)（HSP70、GPC3），其中CEUS時AP癌旁呈高灌注診斷為MVI（+），AP癌旁呈等灌注診斷為MVI（-）；PVP癌旁呈低灌注診斷為MVI（+），PVP癌旁呈等灌注診斷為MVI（-）；HSP70陽性、GPC3陽性均診斷為MVI（+），陰性均診斷為MVI（-）。上述數(shù)個診斷指標(biāo)聯(lián)合診斷如滿足“AP高灌注”、“PVP低灌注”兩個條件中至少一個即診斷為MVI（+），“AP等灌注”且“PVP等灌注”診斷為MVI（-），“PVP低灌注”并且“IHC指標(biāo)雙陽性”時診斷為MVI（+），“PVP等灌注”和/或“IHC中至少有一個陰性”診斷為MVI（-）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用STATA 15.0和SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。用卡方檢驗或Fisher確切概率法比較計數(shù)資料在MVI（+）組和MVI（-）組的組間差異。符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用獨立樣本t檢驗比較其在MVI（+）組和MVI（-）組的組間差異。分別計算CEUS指標(biāo)（AP、PVP）和IHC指標(biāo)（HSP70、GPC3）單獨及聯(lián)合診斷MVI的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、約登指數(shù)、受試者工作特征（receiver operator characteristic curve，ROC）曲線的下面積（area under curve，AUC）。采用Delong檢驗比較各個指標(biāo)間AUC的差異。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

MVI（+）組（n=23）和MVI（-）組（n=119）患者在年齡、性別、肝炎病史、Child-Pugh分級、病灶位置等分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但MVI（+）組的病灶最大直徑大于MVI（-）組（P＜0.001）。兩組患者的基線資料比較見表1。

表1 MVI（+）組和MVI（-）組患者的基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline characteristics between MVI(+)group and MVI(-)group

2.2 MVI的診斷效率

ROC曲線分析顯示，CEUS指標(biāo)（AP、PVP）和IHC指標(biāo)（HSP70、GPC3）單獨診斷MVI時，PVP的診斷效率最高，準(zhǔn)確率和AUC分別達91.0%和0.893。AP+PVP聯(lián)合診斷（滿足AP癌旁高灌注和/或PVP癌旁低灌注）的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率分別為91.9%、92.1%、92.1%，提高了AP、PVP單獨診斷時的效率。HSP70和GPC3無論單獨診斷還是聯(lián)合應(yīng)用的診斷效率均低于AP+PVP聯(lián)合診斷。僅就IHC指標(biāo)來看，GPC3+HSP70聯(lián)合診斷的效能（準(zhǔn)確率為79.8%，AUC為0.790）優(yōu)于單獨GPC3（準(zhǔn)確率為69.5%，AUC為0.752）或單獨HSP70（準(zhǔn)確率為60.7%，AUC為0.701）診斷。與GPC3+HSP70聯(lián)合診斷（敏感度為77.8%）相比，PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷的敏感度（69.4%）降低，但特異度提高至98.5%，準(zhǔn)確率為92.5%。其中AP+PVP聯(lián)合、PVP單獨和PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷的AUC分別為0.918、0.893、0.840，其中AP+PVP聯(lián)合診斷的AUC優(yōu)于PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷組合（P=0.033）。見表2。

表2 CEUS和IHC指標(biāo)對HCC的MVI的診斷效率Tab.2 Diagnostic efficacy of CEUS and IHC indicators on MVI of HCC

由于病灶大小在MVI（+）和MVI（-）組間存在差異，因此以ROC曲線的最大約登指數(shù)（敏感度+特異度-1）對應(yīng)的病灶直徑17.5 mm為界值分為≤17.5 mm組（n=93）和＞17.5 mm組（n=80）兩個亞組。鑒于分亞組前PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷準(zhǔn)確率最高，因此進一步采用該組合進行亞組分析，結(jié)果顯示，在兩個亞組中，PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷均可以實現(xiàn)對MVI陽性和陰性病灶的良好區(qū)分（P＜0.001）。尤其在病灶直徑＞17.5 mm亞組中，PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷具有較好的效能，準(zhǔn)確率為98.8%，AUC為0.993，敏感度為100.0%。見表3。

表3 在不同病灶大小亞組中PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷MVI的效能Tab.3 Diagnostic efficiency of PVP+GPC3+HSP70 for MVI in different lesion size subgroups

3 討論

本研究表明，CEUS癌旁的AP和PVP異常灌注對診斷MVI均有積極的作用。眾所周知，病灶內(nèi)的AP高灌注和PVP低灌注是組織學(xué)上中晚期HCC的典型表現(xiàn)，該特征體現(xiàn)病灶內(nèi)發(fā)生了顯著的血流動力學(xué)改變。隨著HCC的進展，病灶內(nèi)非配對小動脈數(shù)量增加，導(dǎo)致AP血流量增加；同時動靜脈瘺形成導(dǎo)致肝靜脈壓力增加并反向［18-19］。因此，AP造影劑快速進入，而PVP造影劑快速洗脫；圖像上則表現(xiàn)為AP高灌注及PVP低灌注。癌旁發(fā)生MVI時，也會出現(xiàn)類似HCC的表現(xiàn)。癌旁的MVI區(qū)域正常的微血管密度降低，新形成大量存在結(jié)構(gòu)和功能異常（不成熟、易滲漏）的微血管，從而形成動靜脈瘺和靜脈癌栓。這會導(dǎo)致發(fā)生MVI處的造影劑快速進入，并加快洗脫［20］。本研究中MVI（+）組的HCC出現(xiàn)AP高灌注的比例（54.1%，20/37）明顯高于MVI（-）組（28.6%，40/140），MVI（+）組出現(xiàn)PVP低灌注的比例高達91.9%（34/37），與上述研究AP和PVP表現(xiàn)類似。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與AP比較，示卓安?造影劑特有的PVP對MVI有更強的診斷能力。PVP指標(biāo)在癌旁低灌注診斷模式時對HCC的MVI的診斷準(zhǔn)確率達到91.0%，AUC值為0.893，均明顯高于AP。從CEUS的成像機制角度考慮，PVP比AP診斷效率更高的研究結(jié)果提示MVI的發(fā)生可能與肝臟枯否細(xì)胞損耗有關(guān)。超聲造影劑進入肝臟后，約99%的造影劑微泡會被肝血管竇中的枯否細(xì)胞吞噬（但不破壞），這會延緩造影劑進入肺循環(huán)而被清除。因此，示卓安?造影劑可以表現(xiàn)出超長時間的PVP成像，即“枯否成像”［21］。本研究中，未發(fā)生MVI的病灶周邊絕大多數(shù)（92.1%，129/140）在PVP表現(xiàn)為與周邊肝實質(zhì)一致的等灌注，而發(fā)生MVI的病灶絕大多數(shù)（86.5%，32/37）在PVP表現(xiàn)為類似癌灶的低灌注。這可能是因為癌細(xì)胞侵犯的區(qū)域破壞了肝血管竇，肝竇內(nèi)枯否細(xì)胞數(shù)量減少，甚至消失［22］；因此被枯否細(xì)胞吞噬的造影劑減少，所以造影劑快速進入肺循環(huán)廓清。有研究證實肝癌分化程度越低，HCC癌灶內(nèi)枯否細(xì)胞的計數(shù)越少［23］，MVI發(fā)生率越高［24］，這也間接證實了MVI與PVP癌旁低灌注之間的相關(guān)性。

HCC的腫瘤異質(zhì)性較強。研究發(fā)現(xiàn)，表達一些特殊分子標(biāo)志物的HCC更容易發(fā)生MVI。GPC3作為肝癌的特異性標(biāo)志物之一［25］，表達水平與MVI發(fā)生率相關(guān)［15］。熱休克蛋白家族成員HSP70的血漿蛋白水平也與MVI相關(guān)［26］。本研究對穿刺標(biāo)本進行GPC3和HSP70檢測，以觀察其對MVI的診斷效能。雖然GPC3和HSP70聯(lián)合診斷的敏感度稍降低（單獨GPC3和HSP70診斷及兩者聯(lián)合診的敏感度分別為86.5%、86.1%和77.8%），但聯(lián)合診斷的特異度大幅度提高，從單獨GPC3和HSP70診斷的特異度65.0%和54.0%，提升至80.3%。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步聯(lián)合使用GPC3、HSP70和PVP以期提高MVI診斷效能，結(jié)果顯示，PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷的特異度提高至98.5%，準(zhǔn)確率為92.5%。既往研究已報道，病灶大小是MVI的獨立風(fēng)險因素［27］。本研究在亞組分析中排除病灶大小的影響后，結(jié)果依然顯示PVP+GPC3+HSP70聯(lián)合診斷獲得較好的診斷效率，尤其在病灶直徑＞17.5 mm中，該組合表現(xiàn)出較高的診斷價值，準(zhǔn)確率為98.8%，AUC為0.993，敏感度為100.0%。考慮到MVI陽性診斷可對HCC患者治療策略的選擇產(chǎn)生較大影響（如需要增加術(shù)前新輔助治療以及術(shù)中需要獲得更寬的切緣等），因此為了避免過度治療，選擇特異度更高的指標(biāo)對降低假陽性率具有更好的臨床意義。因此，認(rèn)為最適宜的MVI診斷標(biāo)準(zhǔn)是GPC3/HSP70雙陽性聯(lián)合CEUS癌旁PVP低灌注特征。

本研究也存在以下局限性：⑴本研究為小樣本回顧性研究，納入的MVI陽性病例數(shù)有限，因此CEUS和IHC標(biāo)志物診斷MVI的價值仍需驗證集或前瞻性研究進一步評估。但是，本研究只收集了最大直徑不超過3 cm的HCC。由于肝臟環(huán)境的復(fù)雜性，特別是肝硬化背景下，小肝癌一直是術(shù)前影像學(xué)診斷的難點［28］。目前專門以小HCC為目標(biāo)病灶的MVI研究較少。因此，基于小肝癌的MVI研究尤其必要。⑵GPC3和HSP70對MVI的診斷效率不高?？紤]可能是因為本研究采用的診斷原則為有、無染色的簡單分類，未依據(jù)染色程度劃分等級。因此，仍需進一步對IHC標(biāo)志物進行詳細(xì)分類，觀察能否提高MVI的診斷效率。⑶GPC3和HSP70診斷MVI尚屬于初步探索，雖然取得了陽性結(jié)果，但其潛在機制還有待進一步挖掘。

綜上所述，采用IHC標(biāo)志物（GPC3和HSP70）和CEUS（AP和PVP）進行HCC（尤其是小HCC）手術(shù)前的MVI診斷是可行的方法，其中PVP+GPC3+HSP70的聯(lián)合應(yīng)用是術(shù)前診斷MVI較為理想的方案，未來值得開展大樣本、多中心、前瞻性研究進一步證實。