miR-203a-3p通過靶向LASP1介導(dǎo)Akt/GSK-3β/Snail信號通路調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為

董翔 董猛 時曉曉 于若卉 蘇君君

作者單位：061000 滄州 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌類型，手術(shù)和肝移植是早期HCC治療的基礎(chǔ)，目前隨著HCC治療方式的不斷改進(jìn)，靶向治療也在HCC治療中占據(jù)重要地位，如索拉非尼已被批準(zhǔn)用于HCC的一線治療；然而由于HCC的高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移特性，患者整體預(yù)后仍然較差，尤其是晚期患者的臨床治療效果亟需進(jìn)一步提升［1-2］。而積極探索、識別HCC發(fā)病機(jī)制和相關(guān)生物標(biāo)志物對提高HCC臨床治療效果具有重要意義。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種非編碼RNA，參與了細(xì)胞增殖、分化、遷移、存活和凋亡等生物學(xué)過程。miR-203是在14q32.33染色體上發(fā)現(xiàn)的miRNA，主要作為腫瘤抑制因子參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。miR-203a-3p是miR-203家族的一員，近年來研究顯示miR-203a-3p在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為方面起著關(guān)鍵作用［4］。在原發(fā)性肝癌患者和HCC細(xì)胞系中，miR-203a-3p表達(dá)均下降，對HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲也具有調(diào)控作用［5-6］。但miR-203a-3p調(diào)控HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)分子機(jī)制尚未明確。LIM和SH3蛋白1（LIM and SH3 protein 1，LASP1）是一種多功能蛋白，參與癌癥細(xì)胞骨架的重組調(diào)控及細(xì)胞的侵襲、遷移，可作為癌癥預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。在臨床樣本中，LASP1的表達(dá)與腫瘤的分級、大小和轉(zhuǎn)移有關(guān)，LASP1表達(dá)上調(diào)可能通過與細(xì)胞骨架的相互作用和核易位的增加促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移［7］。王賀等［8］檢測發(fā)現(xiàn)，LASP1在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)水平異常升高，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)，但是LASP1在HCC中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究分析miR-203a-3p和LASP1對HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探索HCC中miR-203a-3p和LASP1的相互作用及其分子機(jī)制，以期為臨床治療HCC提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人HCC細(xì)胞HepG2購自北京晶萊華科生物技術(shù)有限公司。C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0010。小鼠在SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食飲水。本實驗經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2020121），實驗過程中嚴(yán)格遵循“3R”原則。主要試劑與儀器：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國賽默飛公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；RIPA細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自上海貝博生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；miR-203a-3p模擬物（miR-203a-3p mimics）及陰性對照（miR-NC mimics）、LASP1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-LASP1）及陰性對照質(zhì)粒（pcDNA-NC）購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒均購自MedChemExpress公司；LASP1、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、磷酸化GSK-3β（phosphorylated GSK-3β，p-GSK-3β）、Snail、GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的二抗購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。MCO-170ACL-PC型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自萊恩生物科技有限公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司；GX53倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；HBS-ScanX全波長酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)購自力新儀器（上海）有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染

將HepG2細(xì)胞添加至DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%雙抗）中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將miR-203a-3p mimics、miR-NC mimics分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，依次記為miR-203a-3p組、miR-NC組。將miR-203a-3p mimics和pcDNA-NC、miR-203a-3p mimics和pcDNALASP1分別共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，依次記為miR-203a-3p+pcDNA-NC組、miR-203a-3p+LASP1組。以正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞作為對照組（control組）。轉(zhuǎn)染48 h后用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 qRT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-203a-3p和LASP1 mRNA的相對表達(dá)水平

收集各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，以紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA作為模板，根據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書開展擴(kuò)增實驗。引物序列：miR-203a-3p上游引物為5＇-CCGGTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3＇，下游引物為5＇-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3＇；LASP1上游引物為5＇-CGCGCACAATCCCTACCCATCGCC-3＇，下游引物為 5＇-CTTCCAGAGGAGAGAGTTGGTTCTG-3＇；U6上游引物為5＇-GTAGATACTGCAGTACG-3＇，下 游引物為 5＇-ATCGCATGACGTACCTGAGC-3＇；GAPDH 上游引物為 5＇-GACTCCACTCACGGCAAATTCA-3＇，下游引物為 5＇-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3＇。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，SYBR Green qPCR Master Mix試劑 10 μL，加 ddH2O 至 20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行30個循環(huán)，以U6和GAPDH為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)水平。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測miR-203a-3p與LASP1的靶向關(guān)系

采用Targetscan靶基因預(yù)測庫預(yù)測miR-203a-3p與LASP1的靶向結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型質(zhì)粒LASP1-Wt和突變質(zhì)粒LASP1-Mut后，將其分別與miR-203a-3p mimics、miR-NC mimics共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，記為LASP1-Wt+miR-203a-3p組、LASP1-Wt+miR-NC組、LASP1-Mut+miR-203a-3p組、LASP1-Mut+miR-NC組，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定HepG2細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

收集miR-NC組，miR-203a-3p組和miR-203a-3p+LASP1組的HepG2細(xì)胞，制成4×103/mL細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種至96孔板，在37 ℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8溶液，10 μL/孔，繼續(xù)孵育4 h。采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞懸液在450 nm波長下的光密度（OD）值。實驗重復(fù)3次。

1.6 小鼠異體移植瘤實驗

收集miR-NC組，miR-203a-3p組和miR-203a-3p+LASP1組的HepG2細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，隨后重懸細(xì)胞調(diào)整濃度為5×108/mL。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按照對應(yīng)細(xì)胞分組進(jìn)行小鼠實驗分組，每組15只。各組小鼠分別于腋下脂肪墊接種對應(yīng)細(xì)胞懸液（100 μL/只），待腫瘤生長30 d后觀察腫瘤質(zhì)量和體積。

1.7 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

收集細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約90%時，用200 μL的無菌移液頭垂直劃線，并進(jìn)行標(biāo)記，用PBS清洗平板3次，隨后置于無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0 h、24 h后，移除培養(yǎng)基，在光學(xué)顯微鏡下拍照，采用Image J軟件對不同時間點(diǎn)的線性區(qū)域之間的劃痕距離進(jìn)行測量，計算細(xì)胞遷移率。實驗重復(fù)3次。

1.8 Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

將細(xì)胞重懸并計數(shù)后，按3×104/孔的密度接種于Transwell小室上室（預(yù)先涂有Matrigel基質(zhì)膠），Transwell小室下室加入600 μL含胎牛血清的培養(yǎng)液，Transwell小室于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，無菌棉簽擦去上室未侵襲細(xì)胞，染色后的細(xì)胞在空氣干燥后用流水沖洗3次，在倒置光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.9 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞重懸并離心后，用400 μL結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，分別加入10 μL Annexin V/FITC和5 μL PI染液，混合均勻，室溫下避光孵育15 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.10 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

采用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，以BCA檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量，用10%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封膜1 h，洗膜，加入 LASP1、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、GAPDH一抗（1∶1 000），4℃下孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫下孵育2 h。通過ECL試劑顯影，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析蛋白灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203a-3p靶向下調(diào)LASP1表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics和pcDNA-LASP1后，qRT-PCR檢測結(jié)果（圖1A和圖1B）顯示，與control組和miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞中miR-203a-3p表達(dá)量升高（t=31.572，30.560；均P＜0.001）；與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞中LASP1 mRNA 表達(dá)量降低（t=28.438，P＜0.001）；與miR-203a-3p組和miR-203a-3p+pcDNA-NC組比較，miR-203a-3p+LASP1組HepG2細(xì)胞中LASP1 mRNA表達(dá)量升高（t=17.182，17.351；均P＜0.001）。Western blot檢測結(jié)果（圖1C）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞中LASP1蛋白表達(dá)量降低（t=28.155，P＜0.001）。Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果（圖1D）顯示，miR-203a-3p與LASP1存在靶向關(guān)系。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（圖1E）顯示，與LASP1-Wt+miR-NC組比較，LASP1-Wt+miR-203a-3p組相對熒光素酶活性下降（t=85.103，P＜0.001），而 LASP1-Mut+miR-203a-3p組與LASP1-Mut+miR-NC組的相對熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.127，P=0.895）。以上表明，LASP1是miR-203a-3p的下游靶基因，且miR-203a-3p靶向下調(diào)LASP1的表達(dá)。

圖1 miR-203a-3p靶向下調(diào)LASP1表達(dá)Fig.1 miR-203a-3p targetedly down-regulated the expression of LASP1

2.2 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞增殖

CCK-8檢測結(jié)果（圖2A）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞增殖活性降低（t=11.460，P=0.007）；與 miR-203a-3p組比較，miR-203a-3p+LASP1組HepG2細(xì)胞增殖活性顯著升高（t=15.610，P=0.005）。小鼠異體移植瘤實驗結(jié)果（圖2B）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組小鼠移植瘤體積和質(zhì)量均顯著減少（t=89.485，57.319；均P＜0.001）；與miR-203a-3p組比較，miR-203a-3p+LASP1組小鼠移植瘤體積和質(zhì)量均增加（t=96.075，48.153；均P＜0.001）。以上結(jié)果表明，miR-203a-3p通過靶向下調(diào)LASP1抑制HepG2細(xì)胞增殖。

圖2 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞增殖Fig.2 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited HepG2 cell proliferation

2.3 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞遷移

劃痕實驗結(jié)果（圖3）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞遷移率降低（t=21.169，P=0.003）；與miR-203a-3p組比較，miR-203a-3p+LASP1組HepG2細(xì)胞遷移率顯著升高（t=17.825，P=0.007）。表明miR-203a-3p通過靶向下調(diào)LASP1抑制HepG2細(xì)胞遷移。

圖3 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞遷移Fig.3 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited HepG2 cell migration

2.4 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞侵襲

Transwell小室實驗結(jié)果（圖4）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞侵襲數(shù)目降低（t=22.600，P=0.004）；與miR-203a-3p組比較，miR-203a-3p+LASP1組HepG2細(xì)胞侵襲數(shù)目升高（t=16.738，P=0.007）。表明miR-203a-3p通過靶向下調(diào)LASP1抑制HepG2細(xì)胞侵襲。

圖4 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞侵襲Fig.4 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited HepG2 cell invasion

2.5 miR-203a-3p靶向LASP1促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI實驗結(jié)果（圖5）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞凋亡率升高（t=45.158，P＜0.001）。與miR-203a-3p組比較，miR-203a-3p+LASP1組HepG2細(xì)胞凋亡率降低（t=21.741，P=0.005）。表明miR-203a-3p通過靶向下調(diào)LASP1促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。

圖5 miR-203a-3p靶向LASP1促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡Fig.5 miR-203a-3p targeting LASP1 promoted HepG2 cell apoptosis

2.6 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞中Akt/GSK-3β/Snail信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果（圖6）顯示，與miR-NC組比較，miR-203a-3p組HepG2細(xì)胞中p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值、Snail蛋白表達(dá)量均降低（t=27.561，31.019，16.450；均P＜0.001）；與 miR-203a-3p組比較，miR-203a-3p+LASP1組HepG2細(xì)胞中p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值、Snail蛋白表達(dá)量均顯著升高（t=18.935，27.410，17.500；P=0.009，0.004，0.008）。表明miR-203a-3p通過靶向下調(diào)LASP1抑制HepG2細(xì)胞中Akt/GSK-3β/Snail信號通路活化。

圖6 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2細(xì)胞中Akt/GSK-3β/Snail信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited the expression of Akt/GSK-3β/Snail signaling pathway related proteins in HepG2 cells

3 討論

大量研究數(shù)據(jù)證實，異常表達(dá)的miRNAs在HCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中起著至關(guān)重要的作用，miRNAs可能是HCC潛在的治療靶點(diǎn)或診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物［9-10］。miR-203a-3p作為角質(zhì)形成細(xì)胞特異性miRNA之一，在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要影響［11］。如miR-203a-3p在炎性乳腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)，可作為炎性乳腺癌潛在的診斷相關(guān)性生物標(biāo)志物［12］。在結(jié)直腸癌中，miR-203a-3p通過靶向調(diào)控磷酸二酯酶4D（PDE4D）和Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及化療耐藥性［13-14］。miR-203a-3p還在胃癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮調(diào)控作用［15-16］。本研究探索miR-203a-3p在HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics后，HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，腫瘤細(xì)胞在異體移植小鼠體內(nèi)生長的速度也明顯降低。表明過表達(dá)miR-203a-3p可抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可作為HCC治療的候選靶點(diǎn)。

既往研究［17-18］已顯示，LASP1在HCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且被鑒定為miR-133b和miR-326的直接靶基因，miR-133b和miR-326可能通過直接靶向LASP1抑制HCC生長和轉(zhuǎn)移。但在HCC中miR-203a-3p和LASP1的靶向關(guān)系尚未見報道。本研究通過Targetscan軟件預(yù)測HCC中miR-203a-3p與LASP1的靶向關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203a-3p與LASP1存在靶向關(guān)系。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics可明顯降低野生型LASP1基因的相對熒光素酶活性，且HepG2細(xì)胞中LASP1 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯降低，表明在HCC中miR-203a-3p靶向負(fù)調(diào)控LASP1的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics和pcDNA-LASP1后，HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，且腫瘤細(xì)胞在異體移植小鼠體內(nèi)生長的速度也明顯增高。說明LASP1可逆轉(zhuǎn)miR-203a-3p對HepG2細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用。以上結(jié)果表明miR-203a-3p可能通過靶向負(fù)調(diào)控LASP1表達(dá)調(diào)控HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

Akt/GSK-3β/Snail信號通路在血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等許多生理病理過程中發(fā)揮作用［19］。在Akt/GSK-3β/Snail信號通路中，Akt受到上游信號刺激發(fā)生磷酸化，活化的Akt能夠啟動下游級聯(lián)反應(yīng)，激活下游GSK-3β。由于Snail序列中存在GSK-3β保守結(jié)合位點(diǎn)，GSK-3β與Snail結(jié)合可誘導(dǎo)Snail在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定和核定位［20-21］。當(dāng)GSK-3β磷酸化后，其與Snail的結(jié)合作用解除，這使細(xì)胞內(nèi)的Snail表達(dá)水平上調(diào)，最終促進(jìn)侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程的發(fā)生［22］。已有研究［23-25］發(fā)現(xiàn)，Akt/GSK-3β/Snail信號通路在上皮卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤中過度激活，并且參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究檢測HCC細(xì)胞中Akt/GSK-3β/Snail信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics后，HepG2細(xì)胞中p-Akt、p-GSK-3β和Snail蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說明miR-203a-3p可抑制HCC中Akt/GSK-3B/Snail信號通路活化。而共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics和pcDNA-LASP1后，HepG2細(xì)胞中p-Akt、p-GSK-3β和Snail蛋白表達(dá)水平均明顯升高，提示LASP1可逆轉(zhuǎn)miR-203a-3p對HepG2細(xì)胞中Akt/GSK-3β/Snail信號通路的抑制作用。以上結(jié)果表明miR-203a-3p可能通過靶向LASP1介導(dǎo)HCC中Akt/GSK-3β/Snail信號通路活性，從而調(diào)控HCC細(xì)胞生物學(xué)行為。

綜上所述，過表達(dá)miR-203a-3p可抑制HCC細(xì)胞增殖、生長、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向LASP1介導(dǎo)Akt/GSK-3β/Snail信號通路活性有關(guān)，表明miR-203a-3p/LASP1軸可能是HCC潛在的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制及其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的診療提供了新思路。