安羅替尼聯(lián)合吉非替尼對吉非替尼耐藥非小細胞肺癌PC9/GR細胞增殖的影響及其可能的作用機制

吳敏 金蒙蒙 曹曉慧 李永懷

作者單位：230061 合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽省公共衛(wèi)生臨床中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)生與多種致癌基因突變密切相關(guān)，其中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶激活突變是最常見的NSCLC驅(qū)動基因變異，在亞裔非吸煙肺腺癌患者中，其突變頻率高達40%～60%［1］。吉非替尼、厄洛替尼等小分子表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是最早批準(zhǔn)用于EGFR突變晚期NSCLC的靶向藥。目前，大多數(shù)攜帶EGFR基因變異的NSCLC患者均在EGFR-TKIs靶向治療中獲得非常好的生存獲益，但這種獲益并非永久或無限期，后期仍不可避免地出現(xiàn)耐藥性問題。因此，探尋新的治療方案以克服EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥成為當(dāng)前的迫切需要。

抗血管生成藥物在晚期NSCLC的治療中也扮演著非常重要的角色。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，抗血管生成藥物與其他治療藥物聯(lián)合能為患者帶來更好的療效及生存獲益［2］。如，LI等［3］研究顯示抗血管生成藥物阿帕替尼聯(lián)合吉非替尼可增強吉非替尼的抗腫瘤活性，延緩EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥的發(fā)生。安羅替尼作為一種新型的小分子口服多靶點抗血管生成藥物，能抑制腫瘤細胞增殖和血管生成，目前已批準(zhǔn)用于晚期NSCLC的三線治療［4］。安羅替尼聯(lián)合EGFR-TKIs一線治療EGFR突變NSCLC的臨床研究也已初顯療效［5］，但其在EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥中的效應(yīng)及其機制目前尚未明確。本研究通過體外研究初步探討安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合給藥在NSCLC吉非替尼繼發(fā)性耐藥細胞株中的抗腫瘤效應(yīng)及其潛在的分子機制，以期為臨床上克服NSCLC患者EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥提供可選的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人非小細胞肺癌PC9/GR（gefitinib resistance）細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，根據(jù)本課題組前期研究提示原代PC9細胞株吉非替尼的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為（0.023±0.003）μmol/L［6］。吉非替尼（批號：2101251381，規(guī)格：250 mg/片）購自英國阿斯利康公司；安羅替尼（批號：210507183，規(guī)格：10 mg/片）由正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司惠贈；胎牛血清（FBS）和DMEM（高糖）購自美國Hyclone公司，二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）和噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司，p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2及β-Actin抗體購自美國CST公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及給藥

PC9/GR細胞接種至DMEM培養(yǎng)液中（內(nèi)含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），并置于含5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長融合度達90%時，用0.25%胰酶消化傳代。

將對數(shù)生長期的PC9/GR細胞制成單細胞懸液，按3 500/孔細胞密度接種至96孔板，同時設(shè)置6個復(fù)孔。依據(jù)不同給藥情況將細胞分為四組：陰性對照組（僅含細胞和培養(yǎng)液）、吉非替尼單藥組、安羅替尼單藥組、吉非替尼和安羅替尼聯(lián)合用藥組。各組細胞置于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細胞穩(wěn)定貼壁后，單藥組分別采用按不同濃度范圍進行倍比稀釋后的安羅替尼（0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L）或吉非替尼（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、16.0 μmol/L）給藥，聯(lián)合用藥組分別以安羅替尼和吉非替尼各單藥濃度按1∶4比例給藥，各組細胞繼續(xù)孵育72 h后，收集待用。后續(xù)細胞周期檢測及Western blot實驗所用藥物濃度約為各單藥的IC50。

1.3 體外MTT法檢測細胞增殖情況

不同處理組的PC9/GR細胞在培養(yǎng)箱中孵育72 h后，吸出原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，于37℃條件下繼續(xù)孵育4 h，向每孔加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀輕輕震蕩10 min。用自動酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔的吸光度（OD）值，并計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=［1-（加藥組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）］×100%。采用SPSS 23.0軟件計算各單藥組的IC50，CompuSyn 2.0軟件計算聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI），以CI＜1代表協(xié)同效應(yīng)，CI=1代表相加效應(yīng)，CI＞1代表拮抗效應(yīng)。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期

PC9/GR細胞以1×105/mL密度均勻接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后，按上述1.2方法中的細胞分組和處理方式，加入終濃度為5.0 μmol/L的吉非替尼和（或）2.0 μmol/L的安羅替尼。各組細胞繼續(xù)孵育72 h后，吸出原培養(yǎng)基，用PBS沖洗，胰酶消化后，離心，棄上清液，加入75%冰乙醇于4℃固定過夜。次日離心棄上清液，用冷PBS沖洗，加入PI染液，避光反應(yīng)30 min后，上流式細胞儀檢測。采用ModFit軟件分析細胞周期分布。

1.5 Western blot檢測 p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達

各組PC9/GR細胞經(jīng)胰酶消化后，以1×108/mL密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，按上述1.2方法中的細胞分組及處理方式，加入終濃度為5.0 μmol/L的吉非替尼和（或）2.0 μmol/L的安羅替尼。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，提取各組細胞蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品，加入10%聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2一抗（稀釋比例均為1∶2 000），4℃ 孵育過夜；次日加入相應(yīng)二抗孵育1 h，轉(zhuǎn)入暗室后加入ECL發(fā)光液，最終得到目的蛋白條帶。以β-Actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image J 1.8軟件進行蛋白條帶的灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行處理，各實驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，獨立樣本t檢驗用于兩組間的均數(shù)比較，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 吉非替尼和安羅替尼單藥對PC9/GR細胞增殖的影響

PC9/GR細胞用不同濃度的吉非替尼（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、16.0 μmol/L）和安羅替尼（0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L）分別處理72 h后，MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的吉非替尼和安羅替尼均對PC9/GR細胞增殖具有抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度增加而逐漸增強，具有濃度依賴性，見圖1A～B。PC9/GR細胞經(jīng)吉非替尼和安羅替尼作用72 h的IC50值分別為（4.83±0.15）μmol/L和（1.91±0.18）μmol/L，因此后續(xù)細胞周期檢測及Western blot實驗采用2.0 μmol/L安羅替尼和5.0 μmol/L吉非替尼處理。

2.2 安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞的增殖抑制效應(yīng)

安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于相應(yīng)濃度單藥組（均P＜0.05），見圖1C。經(jīng)CompuSyn軟件計算，不同濃度安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞的CI值均小于1，平均CI值為0.448，見圖2。以上實驗結(jié)果表明，安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合對PC9/GR細胞具有協(xié)同抗增殖作用。

圖1 MTT法檢測不同濃度安羅替尼和吉非替尼對PC9/GR細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of anlotinib and gefitinib on the proliferation of PC9/GR cells detected by MTT assay

圖2 吉非替尼與安羅替尼聯(lián)合作用于PC9/GR細胞72 h的CIFig.2 CI of gefitinib combined with anlotinib for 72 h in PC9/GR cells

2.3 安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞周期的影響

安羅替尼（2.0 μmol/L）和吉非替尼（5.0 μmol/L）單藥或聯(lián)合處理PC9/GR細胞后，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，其余各組的G0/G1期細胞比例均增高（均P＜0.05），同時安羅替尼單藥組的G2/M期細胞比例明顯增高（P＜0.05）；與各單藥組比較，聯(lián)合用藥組的G0/G1期細胞比例明顯增多（均P＜0.001），相應(yīng)的S期細胞比例則明顯降低（均P＜0.001）。見圖3。

圖3 安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞周期的影響Fig.3 Effects of anlotinib and gefitinib combination on the cell cycle of PC9/GR cells

2.4 安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞p-AKT和p-ERK1/2蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，吉非替尼單藥組p-AKT和p-ERK1/2表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），安羅替尼單藥組p-AKT和p-ERK1/2表達水平明顯下調(diào)（均P＜0.05）；聯(lián)合用藥組的p-AKT和p-ERK1/2表達水平則較陰性對照組及各單藥組明顯下調(diào)（均P＜0.01）。見圖4。

圖4 安羅替尼與吉非替尼聯(lián)合用藥對PC9/GR細胞p-AKT和p-ERK1/2蛋白表達的影響Fig.4 Effects of anlotinib and gefitinib combination on p-AKT and p-ERK1/2 protein expression in PC9/GR cells

3 討論

腫瘤分子靶向治療具有特異性強、副作用小等特點，目前已成為攜帶敏感突變NSCLC患者主要的治療方案［7］。然而，盡管EGFR驅(qū)動基因突變的晚期NSCLC患者使用EGFR-TKIs較傳統(tǒng)化療具有更好的臨床療效，但所有初始治療有效的患者大多出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［8］。腫瘤新生血管的形成與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EGFR-TKIs雖然具有一定的抗血管生成作用，但是腫瘤新生血管的形成也參與了EGFR-TKIs耐藥［9］?？寡苌伤幬镏饕ㄟ^阻斷腫瘤滋養(yǎng)血管的形成，進而抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，目前在腫瘤聯(lián)合治療中起重要作用［2］。安羅替尼作為國產(chǎn)口服劑型的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，可高效抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、纖維母細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）等多個參與血管生成的靶點，具有全面阻斷腫瘤新生血管形成和抗腫瘤增殖作用［10］。目前，安羅替尼聯(lián)合EGFR-TKIs一線治療EGFR突變晚期NSCLC的Ⅲ期臨床試驗（ALTER-L004）已初顯療效，在ALTER0303試驗［11］中安羅替尼聯(lián)合EGFR-TKIs可延長EGFR突變NSCLC患者的無進展生存期及總生存期，同時延緩獲得性耐藥的產(chǎn)生。但對于EGFR-TKIs單藥一線治療后出現(xiàn)EGFR-TKIs獲得性耐藥的患者，以安羅替尼聯(lián)合EGFR-TKIs作為二線治療方案目前僅見個案報道［12］，因此其療效尚不明確。本研究的體外實驗研究發(fā)現(xiàn)安羅替尼聯(lián)合EGFR-TKIs吉非替尼對吉非替尼獲得性耐藥NSCLC細胞PC9/GR的抗腫瘤增殖作用明顯強于吉非替尼單藥組和安羅替尼單藥組，且兩藥聯(lián)合的CI值小于1，提示兩藥具有明顯的協(xié)同抗增殖效應(yīng)。

目前有研究發(fā)現(xiàn)低濃度的安羅替尼可誘導(dǎo)HCC827 GR細胞株（吉非替尼繼發(fā)性耐藥NSCLC細胞株）發(fā)生G2/M期和G0/G1期細胞周期阻滯，且隨著安羅替尼作用濃度的增高，處于G2/M期的細胞比例逐漸增多，從而導(dǎo)致細胞凋亡增加［13］。本研究也得出類似結(jié)果，安羅替尼作用PC9/GR細胞后可將其阻滯在G2/M期和G0/G1期，吉非替尼則主要將PC9/GR細胞阻滯在G0/G1期，兩者聯(lián)合后G0/G1期的細胞比例顯著上升，而S期的細胞比例明顯下降。表明這兩種藥物產(chǎn)生協(xié)同增殖抑制效應(yīng)的機制可能與細胞周期阻滯在G0/G1期，從而阻礙了細胞進入DNA復(fù)制階段的S期，進而抑制細胞增殖有關(guān)。

PI3K/AKT及MEK/ERK信號通路是EGFR基因下游的兩條重要信號通路，可調(diào)節(jié)包括增殖、分化、凋亡和遷移等多種細胞過程，其異常激活可導(dǎo)致腫瘤血管生成、腫瘤細胞過度增殖和發(fā)生耐藥，進而導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤進展［14-15］。在NSCLC中，PI3K/AKT信號通路可被多種因素激活，如上游EGFR、VEGFR或PI3K/AKT突變或擴增［16］。SATO等［17］通過體外研究發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路有望克服NSCLC細胞對吉非替尼的耐藥。安羅替尼作為多靶點的抗血管生成藥物，多項研究亦顯示其可通過抑制PI3K/AKT和MEK/ERK等細胞生存信號通路的激活而在多種實體瘤中發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的作用［18-21］。在本研究中，吉非替尼單藥處理后PC9/GR細胞中p-AKT和p-ERK1/2表達水平無顯著變化，但安羅替尼單藥處理后PC9/GR細胞中p-AKT和p-ERK1/2表達水平下調(diào)，而安羅替尼聯(lián)合吉非替尼處理后的PC9/GR細胞中p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表達水平較各單藥組明顯下調(diào)，提示安羅替尼聯(lián)合吉非替尼可通過抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路中p-AKT和p-ERK1/2蛋白的活化水平抑制腫瘤細胞增殖，同時增強細胞對吉非替尼的敏感性，進而逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥，這可能是兩藥表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)的重要機制之一。

綜上所述，安羅替尼聯(lián)合吉非替尼對非小細胞肺癌PC9/GR細胞具有良好的協(xié)同抗增殖作用，安羅替尼可能增強EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥NSCLC細胞株對吉非替尼的敏感性，逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥，提高藥物的抗腫瘤活性，其協(xié)同作用機制可能與誘導(dǎo)細胞周期阻滯和下調(diào)p-AKT和p-ERK1/2蛋白的活化水平有關(guān)。本研究為EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥患者的治療提供了新的治療思路及參考依據(jù)。但EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥的機制復(fù)雜，本研究為體外實驗，且未對耐藥細胞株進行耐藥機制檢測，后續(xù)研究仍需對耐藥機制作進一步研究，并完善動物實驗加以驗證。