miR-29a-3p靶向KDM5B調(diào)控腎透明細胞癌增殖和侵襲

仇海軍 李玉明 胡金朋

作者單位：300162 天津 武警特色醫(yī)學中心1急診醫(yī)學科，2研究部

腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是腎臟惡性腫瘤主要的侵襲類型，由于早期征兆不易察覺，大多數(shù)患者確診時已是晚期，預后較差［1-2］。晚期KIRC放療和化療的療效較差，預后不良，因此手術切除仍然是目前治療KIRC最有效的方法［3］。盡管現(xiàn)代醫(yī)療取得了進步，但是KIRC患者的5年生存率仍低于20%，因此亟需探索更有效的預后標志物和治療靶點［4］。近年來，表觀遺傳修飾在癌癥中的作用研究取得了很大進展，其中組蛋白甲基化及其修飾物的失調(diào)被認為與多種人類癌癥相關［5-6］。組蛋白3賴氨酸4（histone 3 lysine 4，H3K4）去甲基化酶基因中組蛋白賴氨酸去甲基化酶［lysine（K）demethylase 5，KDM5］家族的4個成員（KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D）均包含1個 JmjC結(jié)構(gòu)域，能夠?qū)?H3K4中的轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)去除［5，7］。目前，許多研究已報道了KDM5家族在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的作用，包括前列腺癌［8-9］、肺癌［10-11］和胃癌［12］等。既往研究發(fā)現(xiàn)，KDM5B表達水平的升高可以通過多種表觀遺傳效應促進肝癌細胞的生長及維持慢性髓系白血病［13-14］。miRNA常通過不完全互補方式與目標 mRNA 的 3′非翻譯區(qū)（3＇-untranslated region，3′UTR）結(jié)合來負向調(diào)節(jié)靶基因的表達，而這種結(jié)合往往會影響細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進展［15-16］。研究表明miRNA可作為腫瘤抑制因子或致癌因子而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［17］。目前研究也顯示，miR-29a-3p與腫瘤關系密切，可作為腫瘤抑制因子而參與調(diào)控多種腫瘤的生物學過程［18-19］。如miR-29a-3p通過調(diào)控KDM5B蛋白抑制前列腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡［20］。然而miR-29a-3p與KDM5B在KIRC中的關系尚未明確。因此，本研究旨在闡明miR-29a-3p和KDM5B在KIRC中的作用及其作用機制，以期為臨床相關研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人KIRC細胞786-O、Caki-1及293T細胞購自中科院細胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和青霉素/鏈霉素購自Gibco公司，mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit購自Takara公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒HyperScriptⅢmiRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自新貝（上海）生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM培養(yǎng)基購自 Life Technologies，miR-29a-3p inhibitor、KDM5B、KDM5B WT、KDM5B MUT、miR-29a-3p mimics和mimics-NC質(zhì)粒由賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成，MTS試劑、RT-qPCR引物、內(nèi)參引物、Trizol及去RNA酶處理的物品購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，Tranwell小室、細胞培養(yǎng)板及計數(shù)板購自康寧公司。

1.2 利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析H3K4去甲基化酶在KIRC中的表達及對預后的影響

從包含TCGA數(shù)據(jù)的網(wǎng)站（http：//www.linkedomics.org）下載KIRC患者數(shù)據(jù)集TCGA_LIHC RNASeq和TCGA_LIHC Clinical，數(shù)據(jù)信息包括細胞變異、轉(zhuǎn)錄組分析、生物樣本信息、原始測序數(shù)據(jù)、拷貝數(shù)、DNA甲基化、臨床信息等。篩選出同時包含生存時間數(shù)據(jù)信息和H3K4去甲基化酶基因表達數(shù)據(jù)的患者。根據(jù)KIRC的分期將患者分為L-stage組（Ⅰ期和Ⅱ期，n=315）和H-stage組（Ⅲ期和Ⅳ期，n=201），分析不同分期KIRC患者H3K4去甲基化酶基因表達情況及對預后的影響。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人KIRC細胞系786-O、Caki-1分別接種至含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，并置于37°C、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

選取對數(shù)生長期的786-O和Caki-1細胞，用胰酶消化并計數(shù)后，按5×105/孔鋪于6孔板，待細胞密度達90%時，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作步驟分別轉(zhuǎn)染miR-29a-3pmimics、mimics-NC和miR-29a-3p inhibitor，并分別定義為miR-29a mimic組、mimics NC組和Inhibitor組。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集待用。

1.4 RT-qPCR檢測miR-29a-3p和KDM5B mRNA的表達水平

采用Trizol法提取細胞中的總RNA，用Qubit熒光定量儀定量總RNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script RT reagent Kit將總 RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄為 mRNA反應所需的cDNA，反應程序為37℃15 min，85℃5 s。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HyperScriptⅢmiRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit將總 RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄為miRNA反應所需的cDNA，反應程序為25℃5 min，50℃15 min，85℃5 s。RT-qPCR反應條件：95℃ 變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，重復40個循環(huán)?；蚣耙镄蛄幸姳?，miR-29a-3p以U6作為內(nèi)參，KDM5B以β-actin 作為內(nèi)參。采用 2-ΔΔCt法計算 miR-29a-3p 和KDM5B的相對表達量，結(jié)果以平均值±標準差表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-29a-3p與KDM5B的靶向關系

利用生物信息學網(wǎng)站TargetScan預測KDM5B的保守結(jié)合序列miR-29a-3p。將與miR-29a-3p結(jié)合的KDM5B mRNA 3′UTR序列的野生型（WT）或突變型（MUT）插入pmirGLO質(zhì)粒中，以構(gòu)建重組熒光素酶報告質(zhì)粒（KDM5B WT和KDM5B MUT）。按試劑使用說明，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-29a-3p mimics/mimics-NC與pmirGLO/KDM5B WT/KDM5B MUT共轉(zhuǎn)染到293T細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測法檢測293T細胞的熒光素酶活性。采用螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性來表示相對熒光素酶活性。

1.6 MTS法檢測786-O、Caki-1細胞的增殖能力

用DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細胞，以2×104/孔置于96孔板中，每組設3個復孔。各組細胞分別孵育24 h、48 h、72 h和96 h后，向每孔加入10 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的光密度（OD）值，取各組OD均值繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.7 Transwell小室實驗檢測786-O、Caki-1細胞的侵襲能力

用0.25%胰酶消化各組轉(zhuǎn)染細胞，無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105/mL，在預鋪Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室內(nèi)加入200 μL細胞懸液，下室內(nèi)加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，經(jīng)PBS清洗后，用棉簽擦去小室薄膜上層細胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗后吸干上層固定液，每孔加入0.1%結(jié)晶紫染色液800 μL，室溫浸染下層細胞20 min，流水浸泡后，置于光學顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野進行計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5軟件繪圖，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗；相關性分析采用Spearman相關性分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗，Cox回歸分析用于生存差異比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分期KIRC患者H3K4去甲基化酶表達情況及其與預后關系

TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，與L-stage組相比，H-stage組中 KIRC患者的 KDM5B、KDM5C、FBXL10、LSD1和LSD2表達水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中表達水平差異最明顯的是KDM5B，而KDM5A、KDM5D表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖1A～G。KIRC患者中KDM5B表達量的中位數(shù)為10.11，以10.11為界值將患者分為低表達組（Low組）和高表達組（High組）。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，Low組患者術后生存率高于High組，差異有統(tǒng)計學意義（HR=2.882，P＜0.001），見圖1H。

圖1 KIRC患者H3K4去甲基化酶表達情況Fig.1 Expression of H3K4 demethylase in KIRC patients

2.2 KIRC患者中KDM5B表達水平與miRNA的相關性分析

經(jīng)過生物信息學網(wǎng)站TargetScan預測，miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p作為保守序列作用于人源KDM5B基因，作用位點見圖2A。通過TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站下載這3個miRNA的表達數(shù)據(jù)信息。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，與L-stage組KIRC患者癌組織相比，H-stage組KIRC患者癌組織的miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p表達水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2B～D；其中miR-29a-3p表達水平差異最為明顯。KDM5B表達水平與miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p的表達水平均呈負相關（r=-0.283，-0.246，-0.259；均P＜0.001），見圖2E～F；其中miR-29a-3p表達水平與KDM5B表達水平最相關，因此選擇miR-29a-3p作進一步研究。

圖2 KIRC患者KDM5B表達水平與miRNA的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between KDM5B and miRNA in KIRC patients

2.3 miR-29a-3p靶向調(diào)控KDM5B的表達

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，相對于同時轉(zhuǎn)染KDM5B WT和mimics-NC的293T細胞，同時轉(zhuǎn)染KDM5B WT和miR-29a-3p mimics細胞的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05）；而與同時轉(zhuǎn)染KDM5B MUT和mimics-NC的293T細胞相比，同時轉(zhuǎn)染KDM5B MUT和miR-29a-3p mimics細胞的熒光素酶活性差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。結(jié)果表明，miR-29a-3p靶向調(diào)控KDM5B的表達。

圖3 miR-29a-3p靶向KDM5BFig.3 miR-29a-3p targeted KDM5B

2.4 miR-29a-3p對786-O、Caki-1細胞中miR-29a-3p、KDM5B mRNA表達水平的影響

RT-qPCR檢測顯示，人KIRC細胞786-O、Caki-1轉(zhuǎn)染miR-29a-3p inhibitor后，與mimics NC組相比，Inhibitor組顯示出miR-29a-3p表達水平明顯下降，KDM5B mRNA表達水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；過表達miR-29a-3p后，miR-29a-3p表達水平明顯高于mimics NC組和Inhibitor組，KDM5B mRNA表達水平明顯低于mimics NC組和Inhibitor組，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4。結(jié)果表明，過表達miR-29a-3p下調(diào)KDM5B的表達，而沉默miR-29a-3p上調(diào)KDM5B的表達。

圖 4 miR-29a-3p對786-O、Caki-1細胞中miR-29a-3p、KDM5B mRNA表達水平的影響Fig.4 Effect of miR-29a-3p on the expression levels of miR-29a-3p and KDM5B mRNA in 786-O and Caki-1 cells

2.5 miR-29a-3p對786-O、Caki-1細胞增殖和侵襲能力的影響

MTS實驗結(jié)果顯示，作用96 h后，Inhibitor組786-O和Caki-1細胞的增殖能力明顯高于mimics NC組（均P＜0.05），miR-29a mimic組細胞增殖能力明顯低于mimics NC組和Inhibitor組（均P＜0.05），見圖5A～B。Transwell實驗結(jié)果顯示，Inhibitor組786-O和Caki-1細胞穿膜細胞數(shù)明顯高于mimics NC組（均P＜0.05），miR-29a mimic組穿膜細胞數(shù)明顯低于mimics NC組和Inhibitor組（均P＜0.05），見圖5C。結(jié)果表明，過表達miR-29a-3p后能提高786-O、Caki-1細胞增殖和侵襲能力，沉默miR-29a-3p后能降低786-O、Caki-1細胞增殖和侵襲能力。

圖5 miR-29a-3p對786-O、Caki-1細胞增殖和侵襲的影響Fig.5 Effect of miR-29a-3p on proliferation and invasion of 786-O and Caki-1 cells

3 討論

表觀遺傳基因組模式的改變是癌癥的一個主要特征，組蛋白修飾的異常調(diào)控會導致人類癌癥的發(fā)生［21］。既往研究表明，在胃癌［22］、乳腺癌［23］和肺癌［24］等多種癌癥中組蛋白去甲基化酶H3K4的異常表達和突變可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。KDM5A在肺癌細胞中可促進細胞增殖，誘導EMT，促進紫杉醇耐藥［25］。過表達SOX17可抑制KDM5B而阻礙乳腺癌的發(fā)生和進展［26］。KDM5C與結(jié)腸癌細胞系的耐藥性有關［27］。KDM5D低表達與前列腺癌患者預后不良有關［28］。以上研究表明，H3K4去甲基化酶KDM5家族可能作為多種腫瘤的預后標志物和治療靶點，但KDM5家族在腎癌中的表達和功能的相關研究報道較少。本研究旨在探討H3K4去甲基化酶KDM5家族基因在KIRC中的作用通過TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站分析H3K4去甲基化酶KDM5家族基因在KIRC中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種KDM5家族基因（KDM5B、KDM5C、FBXL10、LSD1和LSD2）均與 KIRC 分期相關，表現(xiàn)出低分期KIRC患者癌組織中KDM5家族基因表達水平低于高分期KIRC患者，其中KDM5B的表達差異最明顯。

有研究表明KDM5家族基因成員之一的KDM5B異常表達和功能與前列腺癌有關，其mRNA水平在前列腺癌組織中表達上調(diào)，且與腫瘤分級和患者生存期相關［29］。此外，KDM5B通過H3K4去甲基化修飾抑制CCL14的表達，導致Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而促進結(jié)直腸癌進展［30］。另外，KDM5B還通過調(diào)控microRNA-448介導的YTHDF3/ITGA6軸促進肝癌細胞增殖［31］。以上研究表明，KDM5B可能參與多種腫瘤的惡性生物學過程。本研究還分析了在不同分期KIRC患者癌組織中mRNA表達水平差異最明顯的KDM5家族基因KDM5B的表達水平與KIRC預后的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM5B高表達患者的預后較差。這些結(jié)果提示KDM5B表達水平與KIRC預后相關，KDM5B可能作為KIRC研究的潛在靶點。

miRNA可以通過調(diào)控表觀遺傳網(wǎng)絡參與腫瘤進展。有研究表明miR-29a-3p通過調(diào)控KDM5B參與前列腺癌細胞增殖和凋亡過程［20］。miR-29a通過調(diào)節(jié)P53/MDM2反饋回路，提高膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性［32］。本研究通過生物信息學網(wǎng)站TargetScan預測到KDM5B的保守結(jié)合位點有miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p。通過TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站篩查以上3個miRNA在KIRC的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均與KIRC分期相關，表現(xiàn)出低分期KIRC患者癌組織中miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p表達水平均高于高分期KIRC患者癌組織，其中miR-29a-3p的表達差異最明顯。將miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p可表達水平與KDM5B表達水平進行相關性分析，三者均與KDM5B呈負相關，其中miR-29a-3p與KDM5B的相關性最強。這些研究結(jié)果表明，miR-29a-3p可能是調(diào)控KDM5B影響KIRC進展的關鍵因素。本研究雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-29a-3p可靶向調(diào)控KDM5B的表達，提示miR-29a-3p可能通過調(diào)控KDM5B的表達發(fā)揮調(diào)控作用。本研究進一步在786-O、Caki-1細胞中沉默miR-29a-3p后發(fā)現(xiàn)KDM5B表達均升高，細胞的增殖和侵襲能力均增強，過表達miR-29a-3p后786-O、Caki-1細胞KDM5B表達均降低，細胞的增殖和侵襲能力均降低，進一步支持了miR-29a-3p可能通過靶向下調(diào)KDM5B表達抑制KIRC細胞系的增殖與侵襲。本研究的不足之處是缺乏臨床試驗，僅從數(shù)據(jù)庫分析和細胞實驗得出結(jié)論，而且目前關于miR-29a-3p/KDM5B作用于KIRC的研究較少，因此未來仍需要進一步研究證實。

綜上所述，過表達miR-29a-3p可抑制KIRC細胞系786-O、Caki-1的增殖和侵襲，而沉默miR-29a-3p可促進786-O、Caki-1細胞的增殖和侵襲。其可能的機制是miR-29a-3p通過靶向下調(diào)H3K4去甲基化酶KDM5B的表達抑制KIRC細胞增殖和侵襲。本研究結(jié)果提示KDM5B可能是潛在的治療靶點，該結(jié)果為KIRC的臨床診療提供了新的方向。