轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者同步放化療后外周血miR-29a miR-345水平對預(yù)后的預(yù)測價值

姜黎麗 馮菲菲 王 偉

直腸癌中以中低位直腸癌(經(jīng)MRI評估腫瘤下極距離肛緣10 cm以下)占比最高，占直腸癌的70%～75%[1]。中低位直腸癌早期多無明顯癥狀，多數(shù)患者確診時已發(fā)生其他臟器轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)時機，僅可采用化療、放療為主的姑息治療[2-3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者行同步放化療的療效較好，然而其預(yù)后效果仍需要進一步提升。目前，臨床上尚缺乏預(yù)測轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療預(yù)后的有效評價指標(biāo)，因此，尋求預(yù)測轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療預(yù)后的指標(biāo)具有重要的臨床意義。微小RNA(MicroRNA，miRNA)為一種非編碼RNA分子，其可與mRNA結(jié)合或通過介導(dǎo)切斷靶基因mRNA分子來對靶基因產(chǎn)生抑制作用[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，微小RNA-29a(MicroRNA-29a，miR-29a)與轉(zhuǎn)移性直腸癌的病情密切相關(guān)，且可用于診斷患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。微小RNA-345(MicroRNA-345，miR-345)可預(yù)測局部晚期結(jié)直腸患者放化療后的療效[8]。然而，目前國內(nèi)有關(guān)轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者同步放化療后外周血miR-29a、miR-345水平對其預(yù)后的預(yù)測價值的研究報道較少，鑒于此，本文對98例接受同步放化且隨訪3年的轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者的臨床資料進行回顧分析，探討外周血miR-29a、miR-345水平對轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療預(yù)后的預(yù)測價值，旨為臨床對此類患者擬定治療方案、改善預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年4月至2018年5月無錫市太湖醫(yī)院收治的98例接受同步放化療且受訪3年的轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者為研究對象。其中男性57例，女性46例；年齡45～77歲，平均(56.74±5.13)歲。病例納入標(biāo)準：①所有患者符合轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌的診斷標(biāo)準[9]，且經(jīng)病理學(xué)證實；②卡氏(Karnofsky，KPS)評分≥70分；③均接受同步放化療治療；④肝腎功能正常者；⑤均為首次確診者；⑥3年隨訪資料完整。排除標(biāo)準：①合并造血系統(tǒng)疾病者；②預(yù)計生存期≤3個月者；③合并其他類型惡性腫瘤者；④哺乳期或妊娠期女性；⑤合并精神系統(tǒng)疾病者；⑥患自身免疫疾病者；⑦合并急慢性感染性疾病者。

1.2 方法 依據(jù)隨訪3年結(jié)果，參照《臨床診療指南·腫瘤分冊》[10]中預(yù)后判定標(biāo)準將患者分為預(yù)后良好組(無進展生存)45例與預(yù)后不良組(死亡或進展生存)53例。比較兩組患者血清miR-29a、miR-345水平及臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、合并基礎(chǔ)疾病、病理分型、組織學(xué)分化程度、原發(fā)灶腫瘤直徑、是否實施鞏固化療、臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)數(shù)目、單個臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)目、同步放化療后血漿清蛋白水平差異。將上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素logistic回歸分析患者同步放化療后3年內(nèi)預(yù)后不良的影響因素。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲線，以曲線下面積(area under the curve，AUC)分析患者同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平單獨及聯(lián)合檢測對同步放化療后3年內(nèi)預(yù)后的預(yù)測價值。

1.2.1 同步放化療方案 放療：采用CT進行模擬定位，隨后勾畫腫瘤靶區(qū)(gross tumor volume，GTV)(影像學(xué)、腸鏡確診的直腸腫瘤區(qū)域)；臨床靶區(qū)(clinical target volume，CTV)，包括淋巴結(jié)引流區(qū)域與原發(fā)病灶，具體為骶前區(qū)、直腸系膜區(qū)域、盆腔側(cè)壁、坐骨直腸窩等區(qū)域，真骨盆內(nèi)緣為CTV側(cè)界，肛管下緣與L5椎體分別為CTV下界與上界，骶骨皮質(zhì)后緣與膀胱后壁1/4～1/3分別為CTV后界與前界；計劃靶區(qū)(planning target volume，PTV)為CTV外擴0.5～1 cm。GTV區(qū)域劑量為50 Gy，PTV處方劑量為45 Gy，每次1.8～2.0 Gy，1次/天，5次/周，持續(xù)放療5周，期間口服卡培他濱(國藥準字H20123425，連云港潤眾制藥有限公司)825 mg/m2，2次/日，每周5天。鞏固化療：采用CapeOx方案(即奧沙利鉑+卡培他濱)治療。奧沙利鉑(國藥準字H20020648，成都長青制藥有限公司)130 mg/m2，靜脈滴注，大于2小時，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2，2次/天，口服，第1～14天，隨后休息7天，每3周重復(fù)1次。同步放化療完成后按照患者的個人意愿行鞏固化療。

1.2.2 外周血miR-29a、miR-345水平的檢測 采用實時熒光定量PCR測定外周血miR-29a、miR-345水平。同步放化療后采集所有患者全血標(biāo)本4 mL，隨后通過TD-4M低速離心機(離心半徑為10 cm，離心轉(zhuǎn)速為3 000 r/min山東博科)分離血清，離心10 min后取上清液于-70℃條件下保存，通過miR試劑提取盒提取miRNA(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：DE-01001)，隨后采用Nanodrop2000分光光度計(上海在途生物科技有限公司)定量miRNA，采用miScript Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：DXT-218061，上?？泼羯锟萍加邢薰?，選擇1 μg RNA實施反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作參照試劑盒，U6下游引物為5’-TCCTTTGAAACCTTGTGA-3’，上游引物為5’-ACGGTTAACCGTAATGCC-3’；miR-345下游引物:5 ’-GTGCACCGTCGCAGGT-3’，上游引 物 5’-GCTCAGTGCTACTCCA-3 ’；miR-29a下游引物為5’-GAAATCGGTTA-3’，上游引物為：5’-TAGCACCATCT-3’；隨后采用ABI7500 熒光定量PCR儀(美國生物系統(tǒng)公司)對miR-29a、miR-345進行擴增，以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt算法計算血清miR-29a、miR-345水平。

1.2.3 隨訪 以門診復(fù)查的形式進行隨訪，隨訪內(nèi)容為患者是否死亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，調(diào)查的資料及時錄入，資料錄入準確，保證數(shù)據(jù)的真實性，不可隨意篡改數(shù)據(jù)。每3個月隨訪1次，隨訪3年。以復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡或隨訪時間截止為隨訪終點。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組血清miR-29a、miR-345水平比較 同步放化療后，預(yù)后不良組血清miR-29a、miR-345水平高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組血清miR-29a、miR-345水平比較

2.2 患者預(yù)后不良的單因素分析 預(yù)后不良組患者組織學(xué)分化程度為低分化、原發(fā)灶腫瘤直徑≥5 cm、臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)>1個、同步放化療時血漿清蛋白≤35 g/L例數(shù)占比均高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 患者預(yù)后不良的單因素分析

2.3 同步放化療后3年內(nèi)患者預(yù)后不良的Cox多因素分析 將組織學(xué)分化、原發(fā)灶腫瘤直徑、臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)數(shù)目、同步放化療時血漿清蛋白、血清miR-29a、miR-345水平納入Cox比例風(fēng)險回歸模型，賦值：低分化=1，中高分化=0；原發(fā)灶腫瘤直徑≥5 cm=1，原發(fā)灶腫瘤直徑<5 cm=0；同步放化療時血漿清蛋白≤35 g/L=1，血漿清蛋白>35 g/L=0；臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)>1個=1，臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)為1個=0；其余為連續(xù)變量。以轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療后3年內(nèi)的預(yù)后情況為因變量(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)，Cox多因素分析顯示，臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)>1個、同步放化療時血清miR-29a、miR-345水平為轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療后3年內(nèi)預(yù)后不良的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 同步放化療后3年內(nèi)患者預(yù)后不良的Cox多因素回歸分析

2.4 患者同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平單獨及聯(lián)合檢測對患者3年內(nèi)預(yù)后的的預(yù)測價值 以同步放化療后3年內(nèi)預(yù)后情況為因變量，對Cox多因素分析中有意義的miR-29a、miR-345采用ROC曲線分析各個指標(biāo)的預(yù)測效能，ROC曲線結(jié)果顯示，患者同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯(lián)合檢測預(yù)測3年內(nèi)預(yù)后不良的AUC值為0.740，高于血清miR-29a、miR-345單獨檢測的AUC值為0.687、0.667，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平單獨及聯(lián)合檢測對患者3年預(yù)后的預(yù)測價值

圖1 同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平

3 討論

近年來，雖然轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌臨床治療水平不斷提高，但患者5年生存率仍然較低[11]。同步放化療可保留器官功能、避免手術(shù)創(chuàng)傷，且能夠盡可能殺死已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的癌細胞[12]。但部分轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者行同步放化療治療的預(yù)后仍然不佳[13]。本文探討轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者同步放化療后聯(lián)合檢測外周血miR-29a、miR-345水平對治療后3年預(yù)后的預(yù)測價值，旨為臨床擬定治療方案、改善預(yù)后提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，同步放化療后，預(yù)后不良組患者血清miR-29a、miR-345水平顯著高于預(yù)后良好組，表明預(yù)后不良的轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌患者同步放化療后外周血miR-29a、miR-345水平高表達，與王華勝等[14]研究結(jié)果類似(預(yù)后不良的結(jié)腸癌患者miR-29a水平更高)，分析原因miR-29a、miR-345低表達與直腸癌患者腫瘤進展調(diào)控有關(guān)。同時本組資料顯示，臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)>1個、同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平為轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療后3年內(nèi)預(yù)后不良的影響因素。此結(jié)果與張令巧[15]、張弛等[16]發(fā)現(xiàn)的多器官轉(zhuǎn)移是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨立危險因素的結(jié)果類似。同時，本組資料顯示，轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯(lián)合檢測對預(yù)測患者3年內(nèi)預(yù)后的AUC顯著高于兩指標(biāo)單獨檢測的AUC(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯(lián)合檢測對預(yù)測患者3年內(nèi)預(yù)后較兩指標(biāo)單獨檢測具有重要參考價值。相關(guān)研究指出，miR-29a在結(jié)直腸癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，該作用主要針對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，ETM)，其基本原理為先有效結(jié)合相應(yīng)的靶點，從而來抑制E-鈣粘連蛋白表達，進而刺激EMT過程，同時該研究表明，有肝轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)miR-29a水平呈過表達狀態(tài)，可用于預(yù)測不良預(yù)后[17]。研究[18]指出，miR-345潛在的重要靶點為RUNX3、BBC3與CDKN1A，其中CDKN1A為一種周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑，可誘導(dǎo)細胞周期的停滯，miR-345可能是下調(diào)了CDKN1A的表達水平來促進結(jié)腸癌的進展。國外有研究[8]表明，miR-345可能作為預(yù)測局部晚期直腸癌患者放化療后療效的一種新型標(biāo)志物。

綜上，轉(zhuǎn)移性中低位直腸癌同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯(lián)合檢測對預(yù)測患者3年預(yù)后具有較高參考價值。鑒于本研究選取的樣本量不大，本結(jié)果后續(xù)仍需要擴大樣本量來進一步驗證。