Fe-EDDHA 矯治梨缺鐵黃化病應(yīng)用效果研究*

郭獻(xiàn)平，郭鵬，王東升，蔣卉，吳中營(yíng)，韓永平，智夢(mèng)茹

（1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，鄭州450002）（2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院）

鐵是參與植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的重要元素，與葉綠素合成和光合作用密切相關(guān)。在干旱、半干旱的石灰性土壤上，pH 值較高，富含游離碳酸鈣，作物缺鐵現(xiàn)象非常普遍[1-2]。在不同地區(qū)，東方梨和西洋梨均有報(bào)道梨樹缺鐵黃化病[3-6]。缺鐵會(huì)導(dǎo)致梨樹葉片葉綠素含量下降，葉脈間萎黃，降低光合作用，果實(shí)產(chǎn)量降低，甚至樹體死亡[7-8]。生產(chǎn)上通常施用各種鐵肥矯治梨樹缺鐵黃化病，包括無(wú)機(jī)鐵肥、螯合鐵肥、有機(jī)復(fù)合鐵肥等[9]。采用的方式有土壤施用、葉面噴施及樹干注射等[10]。土施方面，在石灰性土壤上施可溶性無(wú)機(jī)鐵肥（如FeSO4·7H2O），因氧化作用及土壤堿性作用最終會(huì)轉(zhuǎn)化為氫氧化鐵，即使增加鐵肥施用量，其效果仍不是很理想[11]；有機(jī)復(fù)合鐵肥（如木質(zhì)素磺酸鐵）雖然易降解，但矯治作物缺鐵的效果不如螯合鐵肥。螯合鐵肥一般源于對(duì)鐵有高度親和力的有機(jī)酸與無(wú)機(jī)鐵鹽中Fe3+螯合而成，常見螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、乙二胺二鄰羥苯基乙酸（EDDHA）等[9]。研究表明，螯合劑螯合鐵的能力與pH 值相關(guān)性強(qiáng)，隨著溶液pH 值增高，螯合能力從小到大依次為EDTA、DTPA、EDDHA。pH 值高于6.7，鐵可從Fe-EDTA 中被置換，pH 值高于7.7，鐵可從Fe-DTPA 中被置換，而Fe-EDDHA 幾乎不受pH 值影響[12]。因此，EDDHA 被廣泛作為生產(chǎn)螯合鐵肥的螯合劑。

目前，土施Fe-EDDHA 在柑橘[13]、桃[14]、獼猴桃[15]等果樹上均有防治缺鐵黃化病的應(yīng)用。在石灰性土壤條件下，土施Fe-EDDHA 在梨樹上的應(yīng)用較少。本研究以5 年生缺鐵黃化新高梨和1 年生水培黃化杜梨苗為研究對(duì)象，土施不同用量無(wú)機(jī)鐵肥FeSO4·7H2O 和螯合鐵肥（Fe-EDDHA），果實(shí)成熟時(shí)測(cè)定新高梨葉片葉綠體色素、微量元素含量和果實(shí)品質(zhì)，并通過在水培黃化杜梨苗溶液中加入FeSO4·7H2O 和螯合鐵肥（Fe-EDDHA），測(cè)定杜梨葉片葉綠素含量和光合指標(biāo)、根系活性鐵等微量元素含量及鐵吸收關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化，探究Fe-EDDHA 矯治梨樹缺鐵黃化病的應(yīng)用效果，及其促進(jìn)梨樹復(fù)綠的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材為5 年生缺鐵黃化新高梨和1 年生水培黃化杜梨苗。5 年生結(jié)果初期新高梨種植于河南省蘭考縣谷營(yíng)鎮(zhèn)霍寨村梨園，砧木為杜梨，面積約3 hm2，南北行向，行株距4 m×2 m，樹高2.6 m，主干粗6.2 cm。園區(qū)土壤為沙壤土，pH 值8.7，有機(jī)質(zhì)含量0.9%，堿解氮含量46.8 mg/kg，有效磷含量16.6 mg/kg，速效鉀含量138.1 mg/kg，有效鐵含量8.4 mg/kg，CaCO3含量114.90 g/kg，HCO3-含量0.32 g/kg。

杜梨幼苗種植在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地梨示范園溫室大棚內(nèi)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出5～7 片真葉后，選擇高度均一的幼苗移至水培槽培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液為含1×10-4mol/L Fe-EDTA［A600437，生工生物工程（上海）股份有限公司］的改良Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液，pH 值約6.5[16]。1 周后，移至加有2 mmol/L NaHCO3、0.5 g/L CaCO3、1×10-6mol/L Fe-EDTA 的100 L 改良Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中，pH 值7.5 左右，模擬石灰性土壤條件，培養(yǎng)30 d 獲得杜梨黃化苗[17]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理

5 月新高梨出現(xiàn)缺鐵黃化病后，選擇黃化程度基本相同、樹勢(shì)一致、有代表性的梨樹作為試材。試驗(yàn)采用土施無(wú)機(jī)鐵肥［FeSO4·7H2O，生工生物工程（上海）股份有限公司］和螯合鐵肥（Fe-EDDHA含量＞6%，四川瑞隆螯合肥科技有限公司）的方法，設(shè)置5 個(gè)處理：T1，株施無(wú)機(jī)鐵肥（FeSO4·7H2O）5 g；T2，株施無(wú)機(jī)鐵肥（FeSO4·7H2O）15 g；T3，株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）5 g；T4，株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g；以不施鐵肥為對(duì)照（CK1），每個(gè)處理3 株樹。處理方法是在距離主干50 cm 挖寬15～20 cm 的環(huán)狀溝，用10 L 灌溉水溶解鐵肥后均勻地澆入溝內(nèi)，滲完后用土回填，對(duì)照用同等量的水。2 周后，按照同樣方法和用量再施1 次。最終，T1、T2 處理分別株施無(wú)機(jī)鐵肥（FeSO4·7H2O）10、30 g，T3、T4 處理分別株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）10、30 g。處理125 d 果實(shí)成熟時(shí)，測(cè)定葉片葉綠體色素、微量元素含量，各指標(biāo)每株選取代表性葉片3 片混合測(cè)定；從每株樹不同方位選取6 個(gè)果實(shí)測(cè)定果實(shí)品質(zhì)。

選擇長(zhǎng)勢(shì)、黃化程度相近的杜梨苗移至20 L 不同鐵肥的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中，設(shè)置3 個(gè)處理：T5、T6 分別是含1×10-6mol/L FeSO4·7H2O、1×10-6mol/L Fe-EDDHA 的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液；對(duì)照（CK2）是含1×10-6mol/L Fe-EDTA 的原營(yíng)養(yǎng)液。3 個(gè)處理營(yíng)養(yǎng)液中均含2 mmol/L NaHCO3和0.5 g/L CaCO3，每個(gè)處理6株，共處理15 d。選擇3個(gè)處理初始SPAD值相近的葉片10片，每隔5 d 測(cè)定葉片SPAD 值；15 d 后測(cè)定葉片光合指標(biāo)，并取部分根系轉(zhuǎn)至液氮中速凍，置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?，剩余根系測(cè)定微量元素。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

每個(gè)處理稱取0.2 g 剪碎的新高梨葉片，用96%乙醇提取，用上海佑科UV756 紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定葉綠體色素提取物在665、649、470 nm 處的吸光度值，以96%乙醇為空白，測(cè)定總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，參照Lichtenthaler等[18]的方法計(jì)算。杜梨葉片SPAD 值利用SPAD-502便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定。

活性鐵、活性銅、活性鋅、活性錳含量采用酸消解ICP 法測(cè)定[19-20]。新高梨葉片或杜梨根系在105 ℃殺青30 min，然后在70 ℃條件下烘干7 d至恒重后，稱取干燥葉片或根系0.1 g，加入10 mL的1.0 mol/L 鹽酸浸提，連續(xù)振蕩24 h，過濾后用ICP法測(cè)定浸提液中的活性鐵、活性銅、活性鋅、活性錳含量。

取新高梨葉片0.5 g 于瓷坩堝中，在電爐中低溫碳化（至不冒煙），再移至高溫電爐中緩緩升溫，至500 ℃灼燒2～3 h，冷卻后用10～20 mL 鹽酸溶液溶解灰分，并定容至25 mL，用ICP 法測(cè)定浸提液中全硼、全銅、全鋅、全錳含量。

用天平稱量單果重，用托普云農(nóng)GY-4 硬度計(jì)測(cè)定果肉硬度，用Atago PAL-1 數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定可溶性固形物含量，可滴定酸含量按照GB 12456—2021 的方法測(cè)定，維生素C 含量按照GB 5009.86—2016 的2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定，并計(jì)算固酸比。

采用漢莎光合作用測(cè)定儀（CIRAS-3）測(cè)定葉片光合指標(biāo)，包括凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和水分利用率（WUE）。

在NCBI 中獲得杜梨三價(jià)鐵還原酶基因PbFRO2和二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PbIRT1cDNA 全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以Actin為內(nèi)參基因，PbActinQ-F：5′-CTTCCC GATGGCCAAGTCAT-3′，PbActinQ-R：5′-CATGAAT GCCAGCAGCTTCC-3′，PbFRO2Q-F：5′-CTCTTCG GTTCTGGCACTGT-3′，PbFRO2Q-R：5′-GGCCATG AGCTGTGAAGAGT-3′，PbIRT1Q-F：5′-GCCAAGGG AGAAAACGGAGA-3′，PbIRT1Q-R：5′-AGCGCAG CTACAAGACCTTT-3′。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

將-80 ℃保存的杜梨幼苗根系取出，用總RNA提取試劑盒R1200（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，用Thermo Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622（美國(guó)）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系參照南京諾唯贊生物科技有限公司的SYBR Green Master Mix 試劑盒，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法進(jìn)行表達(dá)量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，利用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)新高梨葉片葉綠體色素含量的影響

由表1 可知，施用鐵肥125 d后，新高梨葉片總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量由高到低均為T4＞T3＞T2＞T1＞CK1，其中T1 和T2 處理的葉片總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量與CK1 均無(wú)顯著差異；T3 處理的葉片部分復(fù)綠，其總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別較CK1 顯著增加了98.0%、94.7%、108.3%、92.3%；T4 處理的葉片完全復(fù)綠，其總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別較CK1 顯著增加了542.0%、521.1%、608.3%、423.1%。此外，T2 處理的葉綠素a、類胡蘿卜素含量與T3 處理均無(wú)顯著差異，總?cè)~綠素、葉綠素b含量均顯著低于T3 處理。T4 處理的葉綠體色素含量均顯著高于T1、T2 和T3 處理。

表1 不同處理新高梨葉片葉綠體色素含量 mg/g

2.2 不同處理對(duì)新高梨葉片微量營(yíng)養(yǎng)元素的影響

施用鐵肥125 d后，各處理葉片活性鐵含量由高到低為T4＞T3＞T2＞T1＞CK1，而葉片全硼、全銅、全鋅含量與活性鐵相反，葉片全錳含量由高到低為T1＞CK1＞T2＞T3＞T4。T2、T3、T4 處理的葉片活性鐵含量分別比CK1 顯著提高了75.6%、148.9%、251.4%，T1 處理與CK1 無(wú)顯著差異。T2、T3、T4 處理的葉片全硼、全錳含量分別比CK1 顯著降低了21.3%、33.3%、39.3%和7.7%、9.9%、33.7%，T1 處理與CK1 均無(wú)顯著差異，T2 和T3 處理間均無(wú)顯著差異。4 個(gè)鐵肥處理的葉片全銅、全鋅含量均顯著降低，分別較CK1 降低了10.2%、34.8%、44.1%、50.4%和8.0%、24.9%、35.9%、38.1%，T3 和T4 處理間均無(wú)顯著差異（表2）。

表2 不同處理新高梨葉片微量營(yíng)養(yǎng)元素含量

2.3 不同處理對(duì)新高梨果實(shí)品質(zhì)的影響

由表3 可以看出，T1、T2 處理的單果重、果肉硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比和維生素C 含量與CK1 均無(wú)顯著差異。T3 處理的可溶性固形物含量、固酸比分別較CK1 顯著提高了7.9%和13.5%，單果重、果肉硬度、可滴定酸含量和維生素C 含量與CK1 均無(wú)顯著差異。T4 處理的單果重、可溶性固形物含量、固酸比分別較CK1 顯著提高了22.1%、15.3%和38.2%，果肉硬度、可滴定酸含量分別較CK1 顯著降低了8.9%和15.9%，維生素C 含量與CK1 無(wú)顯著差異。T1、T2 處理的單果重、果肉硬度、可滴定酸含量、固酸比和維生素C 含量與T3 處理均無(wú)顯著差異，可溶性固形物含量顯著低于T3 處理。

表3 不同處理新高梨果實(shí)品質(zhì)

2.4 不同處理對(duì)杜梨葉片SPAD 值的影響

如圖1 所示，杜梨幼苗在模擬石灰性土壤條件的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中處理15 d 期間，CK2 的葉片SPAD 值呈下降趨勢(shì)，T5 處理的葉片SPAD 值與CK2相比無(wú)顯著變化。T6 處理的葉片SPAD 值呈上升趨勢(shì)，且在處理前5 d 上升幅度最大，第5、10、15 d的SPAD 值均顯著高于T5 處理和CK2。在處理第15 d時(shí)，T6 處理的葉片已復(fù)綠，其SPAD 值較T5 處理顯著提高了113.7%，較CK2 顯著提高了146.6%。

圖1 不同處理不同時(shí)期杜梨葉片SPAD值

2.5 不同處理對(duì)杜梨葉片光合指標(biāo)的影響

由表4 可以看出，杜梨幼苗水培處理15 d后，T5 處理的葉片凈光合速率（Pn）、水分利用率（WUE）與CK2 均無(wú)顯著差異，胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）均顯著低于CK2。T6 處理的Pn、WUE 分別較CK2 顯著提高了1 034.5%和2 876.9%，分別較T5 處理顯著提高了528.7%、800.0%；T6 處理的Ci 顯著低于CK2和T5 處理，Gs、Tr 均顯著低于CK2，但與T5 處理無(wú)顯著差異。

表4 不同處理杜梨葉片光合特性

2.6 不同處理對(duì)杜梨根系微量營(yíng)養(yǎng)元素的影響

水培處理15 d后，各處理杜梨根系活性鐵含量由高到低為T6＞T5＞CK2，而活性銅、活性鋅、活性錳含量與活性鐵含量相反。T5、T6 處理杜梨根系活性鐵含量分別比CK2 顯著提高了71.4%、266.0%，且T6 處理根系活性鐵含量比T5 處理顯著提高了113.6%。T6 處理的活性銅、活性鋅、活性錳含量分別較CK2 顯著降低了76.2%、53.3%和57.5%。T5處理的活性銅含量顯著低于CK2，但其活性鋅、活性錳含量與CK2 均無(wú)顯著差異（表5）。

表5 不同處理杜梨根系微量營(yíng)養(yǎng)元素含量

2.7 不同處理對(duì)鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響

由圖2 可知，水培處理15 d后，各處理杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因PbFRO2和PbIRT1的表達(dá)量由高到低均為T5＞T6＞CK2，且差異均顯著。T5 處理的PbFRO2相對(duì)表達(dá)量分別是CK2和T6處理的29.1倍和5.3倍，T6 處理是CK2 的5.4 倍。T5 處理的PbIRT1相對(duì)表達(dá)量分別是CK2 和T6 處理的349.0倍和3.3倍，T6 處理是CK2 的105.5 倍。

圖2 不同處理第15 d 杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

目前，石灰性土壤面積占世界陸地總面積的30%以上[21]。我國(guó)的石灰性土壤分布很廣，約占耕地面積的一半[22]。因此，解決石灰性土壤引起的梨樹缺鐵黃化病具有重要意義。農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1615—2008 中石灰性土壤中CaCO3含量≥10 g/kg。由于的存在，石灰性土壤鐵離子會(huì)以Fe2O3的形式被固定[23]。在本研究中，新高梨園區(qū)土壤為石灰性土壤，其有效鐵含量?jī)H為8.4 mg/kg，有效鐵含量偏低[24]，從而導(dǎo)致新高梨出現(xiàn)缺鐵黃化病。

本研究中，施用鐵肥125 d后，T4 處理［株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g＋2 周后株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g］的新高梨葉片完全復(fù)綠，葉片總?cè)~綠素含量和活性鐵含量分別比對(duì)照提高了542.0%和251.4%，單果重和可溶性固形物含量分別比對(duì)照提高了22.1%和15.3%；T3 處理［株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）5 g＋2 周后株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）5 g］的葉片未能完全復(fù)綠，葉片總?cè)~綠素含量和活性鐵含量分別比對(duì)照高98.0%和148.9%，可溶性固形物含量比對(duì)照高7.9%；T1 和T2 施用無(wú)機(jī)鐵肥（FeSO4·7H2O）處理的效果較差，這與Fe-EDDHA 矯治桃和秦美獼猴桃失綠的研究結(jié)果一致[14-15]。不同樹種和同一樹種不同樹齡或者冠幅對(duì)鐵元素的需求量不同，造成了黃化果樹復(fù)綠所需的Fe-EDDHA 用量不同。另外，本研究是在出現(xiàn)缺鐵黃化癥狀之后間隔2 周各施用1 次螯合鐵肥（Fe-EDDHA），而桃樹是在剛萌芽后、獼猴桃在幼葉剛出現(xiàn)時(shí)施用，柑橘在春梢始長(zhǎng)期和謝花后1周各施用1次[13]。因此，在梨幼樹期、結(jié)果初期、盛果期等不同樹齡或者冠幅矯治缺鐵黃化病施用Fe-EDDHA 的用量、次數(shù)以及施用的最佳時(shí)期還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過在水培黃化杜梨苗的溶液中加入無(wú)機(jī)鐵肥（FeSO4·7H2O）和螯合鐵肥（Fe-EDDHA），進(jìn)一步探究Fe-EDDHA 促進(jìn)梨樹復(fù)綠的機(jī)理。在模擬石灰性土壤條件的溶液中加入Fe-EDDHA 處理15 d后，杜梨葉片SPAD 值和活性鐵含量分別比對(duì)照顯著提高了146.6%和266.0%，而FeSO4·7H2O作用效果較差，與本研究中新高梨應(yīng)用效果相同。杜梨根系采用機(jī)制Ⅰ吸收鐵[25]，本研究T5 處理（1×10-6mol/L FeSO4·7H2O）PbFRO2和PbIRT1的相對(duì)表達(dá)量分別為T6處理（1×10-6mol/L Fe-EDDHA）的5.3 倍和3.3倍，說明與T6 處理相比，T5 處理還處在缺鐵狀態(tài)，導(dǎo)致其鐵吸收關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量較高。植物在缺鐵脅迫后PbFRO2和PbIRT1的相對(duì)表達(dá)量會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[16,26]，CK2在獲得杜梨黃化苗時(shí)缺鐵處理30 d，在測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)量時(shí)已缺鐵處理45 d，這可能是CK2 的2 個(gè)鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)量較T5 和T6 處理低的原因。

缺鐵條件下二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因IRT表達(dá)量升高，不僅增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的效率，同時(shí)也提高了轉(zhuǎn)運(yùn)鋅和錳等二價(jià)金屬離子的能力，缺鐵脅迫下，擬南芥根系中鋅和錳含量均顯著提高[27]。本研究中，缺鐵條件下，對(duì)照和施用無(wú)機(jī)鐵肥（FeSO4·7H2O）處理的新高梨葉片全硼、全銅、全鋅、全錳含量與杜梨根系活性銅、活性鋅、活性錳含量均高于施用螯合鐵肥（Fe-EDDHA）處理，與張林森等[14]研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，梨樹結(jié)果初期出現(xiàn)缺鐵黃化癥狀之后，株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g＋2 周后株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g 能夠有效提高石灰性土壤上梨樹葉片活性鐵含量和葉綠體色素含量，提升果實(shí)品質(zhì)，矯治缺鐵黃化病。