三種發(fā)酵劑發(fā)酵豬糞優(yōu)勢(shì)菌種篩選及除臭試驗(yàn)研究

易誠(chéng)，劉永鑫，龍九妹，鄧景衡

(衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

我國(guó)是一個(gè)畜牧大國(guó)，畜牧生產(chǎn)的清潔化在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中至關(guān)重要，加強(qiáng)畜禽糞便清潔化生產(chǎn)，可以保護(hù)生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)資源化利用效率[1]。因此，畜禽養(yǎng)殖的糞便資源化尤為重要，畜禽糞便的資源化可以使之成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的有機(jī)肥料，使農(nóng)作物產(chǎn)量得到提高。有機(jī)肥還具有易于被植物吸收的特點(diǎn)，而化學(xué)肥料，容易對(duì)土壤造成破壞，長(zhǎng)期使用化學(xué)肥料還會(huì)使得土壤肥力下降，改變土壤原本的有機(jī)構(gòu)成[2-5]。目前，許多大型畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)沒(méi)有合理的處理糞便，這些未經(jīng)處理的畜禽糞便會(huì)產(chǎn)生惡臭氣體，還會(huì)攜帶有大量的病菌，間接的污染當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，對(duì)人體造成危害[6]。

目前畜禽養(yǎng)殖的糞便普遍的處理方法是自然堆肥。自然堆肥雖然可以利用高溫殺死病菌和寄生蟲(chóng)，但存在堆肥時(shí)間長(zhǎng)和產(chǎn)生臭氣等問(wèn)題。在畜禽糞便堆肥發(fā)酵中加入菌肥發(fā)酵劑可以解決堆肥時(shí)間長(zhǎng)和堆肥溫度高的難題，但堆肥臭氣的處理仍是目前研究的重點(diǎn)[7-8]。

復(fù)合微生物菌劑可以縮短發(fā)酵時(shí)間，徹底分解有機(jī)質(zhì)，在堆肥發(fā)酵過(guò)程中可以殺死細(xì)菌和寄生蟲(chóng)卵，提高肥效。更重要的是生物菌劑含有多種微生物，可以大大改善發(fā)酵堆肥的微生物生態(tài)環(huán)境，并篩選出高效除臭的優(yōu)勢(shì)菌種。日本曾首次研發(fā)出的EM菌包含多種菌種，是放線菌、乳酸菌、酵母菌等80多種微生物混合生物菌劑[9]。EM微生物復(fù)合發(fā)酵劑原本是土壤中輔助劑，通過(guò)一代代的改良，應(yīng)用到更加廣闊的領(lǐng)域，包含畜牧、養(yǎng)殖業(yè)和除臭等[10]。劉益仁等人通過(guò)控制變量法，研究是否加入復(fù)合微生物菌劑對(duì)堆肥發(fā)酵等各方面影響，結(jié)果表明接種微生物發(fā)酵劑具有縮短發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)和保持高溫期時(shí)長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)[11]。徐同寶等人分離出解脂耶羅威亞酵母菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、地霉菌、奴卡菌和凝結(jié)芽孢桿菌5株，將這些單株菌劑各自復(fù)合，分成15個(gè)不同組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，以此試驗(yàn)不同發(fā)酵劑菌種復(fù)合后的實(shí)際效果[12]。

微生物除臭法具有環(huán)保、可再生、高效等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖除臭方面，市場(chǎng)前景廣闊[13-15]。微生物除臭法的原理主要有兩種，一是微生物能夠吸收分解臭氣，二是微生物可以抑制發(fā)酵過(guò)程臭氣產(chǎn)生[16]。廖新悌[17]等人的研究結(jié)果表明，在動(dòng)物飼料中加入少量復(fù)合菌劑，可以使豬舍的臭氣降低。葉芬霞等人[18]將熱帶假絲酵母、巨大芽孢桿菌和灰色鏈霉菌按照一定配比制作成生物除臭劑，試驗(yàn)結(jié)果表明，堆肥5 d后的氨氣(NH3)的濃度降解率達(dá)到了84.39%。柴來(lái)云等人[19]用粉紅擲孢酵母、植物乳桿菌、細(xì)黃鏈霉菌按照不同的質(zhì)量比制成生物除臭劑，對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行無(wú)害化處理，NH3的去除率最高可達(dá)到81.98%。劉婕等人[20]將乙酰氧肟酸、啤酒酵母、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)配添加到豬飼料中，發(fā)現(xiàn)添加量為0.15%的復(fù)合劑能顯著降低豬舍內(nèi)NH3的濃度。

目前，除臭優(yōu)勢(shì)菌種的篩選是國(guó)內(nèi)外的主要研究方向，但國(guó)內(nèi)選育的微生物除臭菌劑還不是很常見(jiàn)。因此，本試驗(yàn)從三種發(fā)酵劑發(fā)酵新鮮豬糞中篩選出具有除臭功能的微生物，通過(guò)篩選和純化，篩選出具有高效除臭功能的菌株，為養(yǎng)豬場(chǎng)生物除臭提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 堆肥材料

試驗(yàn)使用的新鮮豬糞來(lái)自于湖南省衡陽(yáng)市本地，鋸木屑產(chǎn)自湖南省邵陽(yáng)市，將鋸木屑與新鮮豬糞一定比例混合可以調(diào)節(jié)豬糞含水率。紅糖用于活化發(fā)酵劑。水壺、木鏟，塑料桶用于新鮮豬糞的攪拌混合。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

(1)純化分離培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，800 mL純凈水和1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液。

大燒杯中裝約800 mL純凈水，置于加熱爐上加熱，分別稱取牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，依次加入試劑，確保第一種試劑完全溶解方加入第二種試劑，至加入瓊脂完全溶解，整個(gè)溶解過(guò)程在加熱和不斷攪拌的過(guò)程中完成。

(2)NH3選擇培養(yǎng)基:蔗糖50.0 g，氨水10.0 mL，KH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.1 g，1%ZnSO45.0 mL,純凈水3 000 mL。

在大燒杯中加入3 000 mL純凈水，依次稱取蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.1 g，1%濃度ZnSO45.0 mL加入其中，使用玻璃棒攪拌至全部溶解，然后裝入24個(gè)150 mL錐形瓶中，使用棉花塞和報(bào)紙包裹后，在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，然后在超凈工作臺(tái)中加入濃氨水各1.25 mL配置成NH3液體選擇培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器

SKY8000-M4便攜式四合一氣體檢測(cè)儀(深圳元特)、恒溫發(fā)酵罐(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)、恒溫水浴搖床(萊普特科學(xué)儀器有限公司)、水分檢測(cè)儀(深圳冠亞電子科技有限公司)、高壓滅菌鍋(上海東亞壓力容器制造有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵試驗(yàn)

(1)使用恒溫發(fā)酵桶容器承裝豬糞，每個(gè)發(fā)酵罐各自稱量4千克的新鮮豬糞。通過(guò)使用濕度檢測(cè)儀器測(cè)量新鮮豬糞的含水率，設(shè)置試驗(yàn)豬糞含水率為50%，在新鮮豬糞中加入鋸木屑調(diào)節(jié)含水率，可以使用下列公式(1)和(2)進(jìn)行計(jì)算鋸木屑的用量。

(1)

x=2m1-3m2

(2)

公式中，ω1為新鮮豬糞含水率，m1位稱取豬糞質(zhì)量，m2為豬糞干重，聯(lián)立以上兩公式，可以求得X為木屑的添加量。按照算出的結(jié)果，在豬糞中加入相應(yīng)的鋸木屑后混合均勻。

(2)復(fù)合發(fā)酵劑的活化：稱取5 g復(fù)合發(fā)酵劑(農(nóng)富康發(fā)酵劑，強(qiáng)興發(fā)酵劑和農(nóng)保有機(jī)肥發(fā)酵劑)、20 g紅糖和100 mL蒸餾水放置在廣口三角瓶中，搖晃混合均勻，進(jìn)行活化(使用時(shí)，先與豬糞混合后，測(cè)量其含水率，然后加入適量木屑調(diào)節(jié)含水率)。

(3)好氧堆肥發(fā)酵：首先使用恒溫發(fā)酵罐進(jìn)行好氧堆肥，通過(guò)終端控制器保持發(fā)酵罐溫度保持在30 ℃。通過(guò)供氧泵供氧，并調(diào)節(jié)流量劑為0.4 L/min。監(jiān)測(cè)發(fā)酵管內(nèi)堆肥發(fā)酵溫度和罐底水溫，并記錄數(shù)據(jù)。堆肥發(fā)酵預(yù)計(jì)進(jìn)行10 d左右。并設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)比加入三種發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵的影響。

1.2.2 菌株的初篩

分別選取升溫階段和發(fā)酵完成階段，進(jìn)行取樣。在兩個(gè)不同時(shí)間段的加入不同發(fā)酵劑的堆肥發(fā)酵罐中，分別每個(gè)階段取3份發(fā)酵罐內(nèi)的固液混合物10 g，加到3個(gè)容量為250 mL三角瓶中,其中含有80 mL滅菌的純水。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組一共接種6個(gè)選擇培養(yǎng)基，3個(gè)為發(fā)熱階段取樣，3個(gè)為發(fā)酵完成階段取樣。

在30 ℃、180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱震蕩30 min，隨后靜置20 min。然后在超凈工作臺(tái)中，取上清液10 mL，各自接種到配置好的NH3選擇培養(yǎng)基中，使用棉花塞好瓶口。并對(duì)18個(gè)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行編號(hào)。然后放在30 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)5 d后觀察菌液的變化，若菌液變渾濁，這說(shuō)明該菌株具有降解臭氣能力。

1.2.3 菌株的分離純化

觀察18個(gè)選擇培養(yǎng)基的渾濁程度，提取變渾濁的NH3選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)液1 mL，經(jīng)過(guò)無(wú)菌水的梯度稀釋后,取10-3、10-4、10-5的稀釋液，分別在分離純化培養(yǎng)基中，用平板劃線法接種。將接種后的培養(yǎng)皿放置在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～72 h，24 h后開(kāi)始觀察菌的生長(zhǎng)情況。選取生長(zhǎng)快、菌落大、數(shù)量多的菌進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)多次分離純化后,將單一的菌株在顯微鏡下根據(jù)形態(tài)特征及生化性質(zhì)，鑒別并編號(hào),并進(jìn)行斜面保存。

1.2.4 除臭試驗(yàn)

將分離純化好的菌株，使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h。待完成培養(yǎng)完成后，取新鮮豬糞，加入活化好的發(fā)酵劑和鋸木屑，調(diào)劑含水率為50%后，分別接種10%的除臭菌株，使其菌株與豬糞混合充分。將混合后的菌株分別放入恒溫堆肥發(fā)酵罐內(nèi)，保持溫度在30 ℃，設(shè)置智能溫控器的上限溫度為33 ℃、下限溫度為28 ℃對(duì)堆肥體進(jìn)行控溫，保持溫度在30 ℃。供氧0.4 L/min，并設(shè)置高清錄像系統(tǒng)對(duì)準(zhǔn)桶蓋上的溫度顯示儀，實(shí)時(shí)記錄發(fā)酵溫度數(shù)據(jù)。

試驗(yàn)的變量預(yù)計(jì)分組為自然發(fā)酵為一組、加了農(nóng)富康發(fā)酵劑的為一組、接種了除臭菌為一組，復(fù)合除臭菌分成一組，分組進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，使用便攜式四合一氣體檢測(cè)儀每天檢測(cè)，直到最終發(fā)酵階段完成，氨氣和臭氣濃度(Odor)沒(méi)有較大變化后可結(jié)束檢測(cè)。

Odor去除率的計(jì)算參照此公式。

1.2.5 復(fù)合菌種發(fā)酵培養(yǎng)影響試驗(yàn)

(1)原料含水率對(duì)發(fā)酵的影響。新鮮豬糞中含有水合有機(jī)物，不同的菌種適宜生存的含水率不同，會(huì)影響發(fā)酵除臭效果。本次試驗(yàn)設(shè)置30%、40%、50%、60%、70%含水率進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定臭氣濃度，得出最佳的原料含水率。

(2)接種量對(duì)發(fā)酵的影響。不同的菌種接種量會(huì)影響堆肥發(fā)酵的除臭效果，若接種量過(guò)少，則可能造成發(fā)酵不完全，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，而過(guò)多則會(huì)造成材料浪費(fèi)。本試驗(yàn)采用單一變量法，以菌種接種量分別為4%、8%、12%、16%、20%加入至堆肥發(fā)酵罐內(nèi)，發(fā)酵完成后，測(cè)定臭氣濃度，得到最佳接種量。

(3)溫度對(duì)發(fā)酵的影響。將發(fā)酵溫度分別置于20、24、28、32、36 ℃的條件下，在最佳接種量，得出最佳發(fā)酵溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

使用水分檢測(cè)儀量出新鮮豬糞含水率為60%，鋸木屑的含水率為2%。通過(guò)公式計(jì)算可得，加入2 kg豬糞，需要加入250 g左右的鋸木屑調(diào)節(jié)含水率，最終可以得到含水率為50%的發(fā)酵堆肥的原料。

通過(guò)試驗(yàn)設(shè)置一組為不加復(fù)合發(fā)酵劑的空白對(duì)照組，另外分成農(nóng)富康發(fā)酵試驗(yàn)組、強(qiáng)興堆肥發(fā)酵劑試驗(yàn)組和農(nóng)保有機(jī)肥發(fā)酵劑試驗(yàn)組。發(fā)酵罐溫度控制在28 ℃～33 ℃之間發(fā)酵，實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵溫度，記錄發(fā)酵溫度變化可得以下結(jié)果。

發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，空白組的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)較長(zhǎng)，在堆肥后6 d前后時(shí)溫度才大于50 ℃進(jìn)入高溫階段，由于溫控發(fā)酵罐設(shè)置水溫為30 ℃，因此試驗(yàn)發(fā)酵前期升溫速度升溫較快，直至溫度升高到35 ℃后，堆體溫度緩慢升高。當(dāng)堆肥進(jìn)行第7天，空白組堆肥體溫度達(dá)到整個(gè)發(fā)酵階段的最高溫59.1 ℃，然后又開(kāi)始降溫，24 h左右溫度就下降到了50 ℃，隨后溫度一直下降直到整個(gè)發(fā)酵過(guò)程結(jié)束。在未加入堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中，高溫階段維持了48 h左右。

而加入了農(nóng)富康發(fā)酵劑后的豬糞的堆肥發(fā)酵的時(shí)長(zhǎng)明顯縮短，在堆肥后的3 d左右溫度就升高到了50 ℃，正式進(jìn)入高溫階段，在發(fā)酵后的第4天左右，溫度升高到最高溫65.7 ℃，隨后溫度又開(kāi)始慢慢下降，直至發(fā)酵后的第6天左右，溫度下降至50 ℃左右結(jié)束了高溫階段，隨后，隨著發(fā)酵的結(jié)束，溫度回到了保溫桶設(shè)置的30 ℃左右；強(qiáng)興菌肥發(fā)酵劑后的豬糞的堆肥，在第5天左右溫度到了50 ℃進(jìn)入高溫階段，在發(fā)酵后的第6天左右，溫度升高到最高溫61.7 ℃；農(nóng)保有機(jī)肥發(fā)酵劑后的豬糞的堆肥第5天達(dá)到最高溫度59.1 ℃。

圖1 堆肥發(fā)酵溫度變化Figure 1 Temperature variation of compost fermentation

從上數(shù)據(jù)我們可以看出，加入了復(fù)合發(fā)酵劑的堆肥高溫期要比空白發(fā)酵組提前，在高溫期的峰值也要高。這說(shuō)明了復(fù)合發(fā)酵劑可以有效的減少發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，其中加入了農(nóng)富康發(fā)酵劑的升溫最快。而且在堆肥發(fā)酵過(guò)程中，由于復(fù)合發(fā)酵劑含有大量的各種菌株，這些菌種會(huì)在發(fā)酵過(guò)程中快速繁殖，分解堆肥過(guò)程中的有機(jī)質(zhì)，并使堆肥溫度上升迅速，也對(duì)后續(xù)菌株篩選提供優(yōu)秀的生態(tài)環(huán)境。

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，復(fù)合發(fā)酵劑因?yàn)橛兄S富的微生物，可以促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程，加速有機(jī)質(zhì)的分解速度，從而促進(jìn)發(fā)酵。在本試驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)，加入農(nóng)富康菌肥發(fā)酵劑可以提高升溫的速度，使其堆肥溫度高溫階段的最高溫更高，還可以使其縮短發(fā)酵時(shí)間，也有助于后續(xù)篩菌的進(jìn)行；復(fù)合發(fā)酵劑中富含豐富菌種，也可以改變豬糞中微生物的生態(tài)環(huán)境，有助于篩選出目的菌種。

2.2 菌株分離純化結(jié)果

2.2.1 菌株分離、純化

將加入了復(fù)合發(fā)酵劑的發(fā)酵罐，在監(jiān)控溫度時(shí)，選取發(fā)熱階段和發(fā)酵完全階段。取4份固液混合物，在發(fā)酵完成后取四份固液混合物，每份10 g。取的固液混合物加到容量為250 mL三角瓶中,其中含有80 mL滅菌的純水。震蕩沉淀后取其上清液接種至NH3選擇培養(yǎng)基中恒溫30 ℃培養(yǎng)。

在培養(yǎng)至5 d時(shí)，可以看到有變培養(yǎng)液變渾濁，因此可以判斷出該選擇培養(yǎng)基中含有可以分解NH3的菌。選取變渾濁的選擇培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)上，取其培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)蒸餾水稀釋后，在使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基使用平板劃線法分離純化，從分離純化培養(yǎng)基中觀察其菌落，發(fā)現(xiàn)有三種不同形態(tài)的菌落。分別命名為nf5、nb11和qx18(見(jiàn)表1)。

2.2.2 菌種鑒定

細(xì)菌的鑒別：nf5革蘭氏染色為陽(yáng)性，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。挑選出nf5菌株，接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，待長(zhǎng)出單菌落觀察其菌落特征，在光學(xué)顯微鏡下觀察其觀察菌體形狀、排列方式等個(gè)體特征。nf5其菌落直徑約為1.5～2.5 mm，光滑，濕潤(rùn)，乳白色，在顯微鏡下其菌體形態(tài)為桿狀，兩端平，多成鏈出現(xiàn)。并進(jìn)行生化試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶測(cè)定，運(yùn)動(dòng)性檢查，明膠液化和，吲哚實(shí)驗(yàn)，根據(jù)菌種鑒定手冊(cè)，確定nf5為乳酸桿菌科。

表1 菌落的個(gè)體形態(tài)及生理生化特征Table 1 Individual morphology and physiological and biochemical characteristics of strains

圖2 乳酸桿菌Figure 2 lactobacillus

真菌的鑒別：根據(jù)革蘭氏染色和菌落的形態(tài)，初步判定nb11和qx18為真菌。采用平板點(diǎn)植法，將接種環(huán)蘸取少許無(wú)菌水，在斜面培養(yǎng)基中挑取少量菌絲或孢子于改良馬丁培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)皿于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)，并用顯微鏡觀察菌絲和孢子。

nb11培養(yǎng)基基質(zhì)上有分生孢子梗向外伸出，菌落較厚且表面較為不平整，在分生孢子梗頂部有成串的黑褐色球狀分生孢子。在培養(yǎng)過(guò)程中，菌落生長(zhǎng)迅速并向四周蔓延，在剛開(kāi)始呈現(xiàn)為白色，隨著菌落的不斷生長(zhǎng)，顏色逐漸變成亮黃色最終轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?。觀察培養(yǎng)基背面發(fā)現(xiàn)中央帶有輕微的黃褐色或者呈現(xiàn)無(wú)色。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)分生孢子頭成黑褐色放射狀。結(jié)合菌種鑒定手冊(cè)，確定nb11為曲霉科。

qx18培養(yǎng)基基質(zhì)上有分生孢子梗向外伸出，菌落灰白色，表面光滑，呈小米粒狀。在培養(yǎng)過(guò)程中，菌落開(kāi)始為酵母樣薄膜生長(zhǎng)，隨后在中央出現(xiàn)細(xì)毛刺樣菌絲，后乳白色菌絲覆蓋，背面呈淡棕色。通過(guò)顯微鏡觀察有較多的大小不等圓形和卵圓形孢子。結(jié)合菌種鑒定手冊(cè)，可以確定qx18為酵母菌科。

圖3 曲霉Figure 3 Aspergillum

圖4 酵母菌Figure 4 Yeast

2.3 除臭試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 臭氣濃度變化

本次試驗(yàn)共分為四個(gè)組，分別是nf5單菌，nb11單菌，qx18單菌和空白試驗(yàn)組。通過(guò)氣體檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

圖5 臭氣濃度變化Figure 5 Changes in Odor Concentration

由圖5可見(jiàn)，在堆肥發(fā)酵過(guò)程中，各個(gè)試驗(yàn)組的開(kāi)始發(fā)酵的臭氣的濃度最高，約為900 ppm左右。臭氣的產(chǎn)生量會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，濃度開(kāi)始下降，當(dāng)下降到一定程度時(shí)，Odor臭氣濃度會(huì)緩慢回升，最后又會(huì)下降。而空白組臭氣濃度在各個(gè)時(shí)間都是最高值，在第4天達(dá)到第一個(gè)低點(diǎn)為，然后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，臭氣濃度繼續(xù)上升，在第7天達(dá)到最高值，隨后臭氣濃度繼續(xù)下降。

從發(fā)酵開(kāi)始直至結(jié)束，試驗(yàn)組每天平均Odor為：空白組636.9 ppm，nf5單菌組427.9 ppm，nb11單菌組453 ppm，qx18單菌組494 ppm。表明單菌組對(duì)降低發(fā)酵產(chǎn)生臭氣具有一定的抑制作用。

單株菌種就具有一定的降低臭氣濃度的效果，在發(fā)酵的前5d中，接種nf5菌株的試驗(yàn)組臭氣濃度最低。在發(fā)酵6～8 d時(shí)，接種了nb11的菌株臭氣濃度最低。在發(fā)酵完成階段，接種了qx18的菌株臭氣濃度最低。出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于該種菌株此時(shí)為優(yōu)勢(shì)菌種，對(duì)臭氣降解起著重要的效果。

2.3.2 氨氣濃度變化

在好氧堆肥過(guò)程中，氨氣的產(chǎn)生量在達(dá)到一個(gè)峰值時(shí)，隨后會(huì)緩慢下降，與發(fā)酵的階段相對(duì)應(yīng)可以表明在發(fā)熱階段，由于微生物的快速繁殖生長(zhǎng)，使得氨氣產(chǎn)生濃度逐漸上升，隨著發(fā)酵的完全，氨氣的產(chǎn)生濃度逐漸降低(如圖6所示)。

在堆肥發(fā)酵開(kāi)始的1～4 d，接種了除臭菌株的實(shí)驗(yàn)組和空白組的氨氣釋放濃度沒(méi)有很大差別，都是隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，此時(shí)接種了nf5菌種的試驗(yàn)組氨氣濃度增長(zhǎng)速度比空白組要高，在第4天接種nf5試驗(yàn)組氨氣濃度達(dá)到最高值，空白組第5天才達(dá)到了最高值。

在堆肥發(fā)酵4 d后，三組試驗(yàn)組氨氣濃度都有快速下降，接種了nf5菌株的試驗(yàn)組此時(shí)氨氣濃度下降最快，在發(fā)酵完成時(shí)，它的氨氣濃度含量最低。接種了nb11和qx18菌株的試驗(yàn)組，全過(guò)程氨氣釋放濃度都低于空白組，在1～8 d氨氣濃度也低于接種了nf5菌株的試驗(yàn)組。

在發(fā)酵至結(jié)束時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)組的平均氨氣濃度為：空白組19.6 ppm，nf5單菌組15.1 ppm，nb11單菌組14.5 ppm，qx18單菌組13.4 ppm。從平均氨氣濃度可以直觀的得出接種了除臭菌株的試驗(yàn)組的氨氣濃度要比空白組低，除臭菌株具有降低氨氣濃度效果。

2.3.3 硫化氫濃度變化

硫化氫濃度變化也是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，先升高后下降。空白組的硫化氫濃度在1～6 d都是最高，在第6天后空白組硫化氫濃度低于接種了nf5實(shí)驗(yàn)組。在發(fā)酵完成后，qx18試驗(yàn)組的硫化氫濃度最低(如圖7所示)。

圖6 氨氣濃度變化Figure 6 Changes in ammonia concentration

圖7 硫化氫濃度變化Figure 7 Changes in hydrogen sulfide concentration

在發(fā)酵至結(jié)束時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)組的平均硫化氫濃度為：空白組0.36 ppm，nf5單菌組0.34 ppm，nb11單菌組0.33 ppm，qx18單菌組0.27 ppm，可以得出接種菌種對(duì)硫化氫濃度也具有一定的抑制作用。

2.3.4 氨氣、硫化氫和臭氣濃度的去除率效果

以空白組作為參照組，計(jì)算接種了bf5單菌、nb11單菌和qx18單菌后的試驗(yàn)組的去除率。通過(guò)公式計(jì)算可以的得出，nf5試驗(yàn)組的氨氣去除率為45.36%，硫化氫去除率為27.27%，臭氣去除率為53.47%。nb11試驗(yàn)組的氨氣去除率為34.02%，硫化氫去除率為-9.1%，臭氣去除率為66.31%。qx18試驗(yàn)組的氨氣去除率為37.11%，硫化氫去除率為42.78%(見(jiàn)圖8)。

2.3.5 三種菌株自由復(fù)合的除臭數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果，可以得知三種菌株均有降低臭氣濃度的效果，本試驗(yàn)將其中幾種菌株自由組合，菌種等比例復(fù)配，檢測(cè)其臭氣去除效果如圖9所示。

從圖9中可以的得出，菌株復(fù)合臭氣去除效果都比單菌株要好，其中nf5、nb11和qx18三種菌株復(fù)合后的除臭效果最好，臭氣去除率達(dá)到了72.31%。

圖8 不同菌株臭氣、氨氣、硫化氫去除率Figure 8 Removal rates of odor, ammonia and hydrogen sulfide by different strains

圖9 不同菌株復(fù)合臭氣去除率Figure 9 Compound odor removal rate of different strains

2.4 復(fù)合菌種發(fā)酵培養(yǎng)影響因素分析

2.4.1 原料含水率對(duì)發(fā)酵試驗(yàn)影響

通過(guò)水分檢測(cè)儀測(cè)出新鮮豬糞含水率為60%，取2 kg豬糞作為實(shí)驗(yàn)通過(guò)公式計(jì)算可得出要調(diào)節(jié)豬糞含水率為30%、40%、50%、60%的豬糞，需要添加的木屑量為1.25、0.625、0.25和0 kg。70%含水率的豬糞需要加0.125 kg水。通過(guò)設(shè)置六個(gè)試驗(yàn)組，分別接種量為10%的nf5+nb11+qx18復(fù)合菌，設(shè)置發(fā)酵溫度為30℃，使用單一變量法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖10所示：

從試驗(yàn)結(jié)果中可以的得出，豬糞含水率從30%到50%這個(gè)過(guò)程中，其臭氣去除率是在上升。豬糞含水率在50%時(shí)臭氣去除效率是最高的，此時(shí)達(dá)到了71.29%，此后隨著豬糞含水率的升高，其臭氣去除率在降低。其試驗(yàn)結(jié)果原因可能是在含水率較低或者較高的情況下，水分影響的菌種的生長(zhǎng)繁殖的活性，含水率低于適宜條件對(duì)除臭效果影響更大。從此次試驗(yàn)結(jié)果可以得出三種菌株復(fù)合的最佳豬糞含水率為50%。

2.4.2 菌種接種量對(duì)發(fā)酵的影響

將nf5、nb11和qx18復(fù)合菌劑，按照4%、8%、12%、16%和20%的接種量接種至含水率為50%的豬糞中，設(shè)置發(fā)酵溫度為30 ℃，試驗(yàn)結(jié)果如圖11所示：

由圖11可知，接種量小于16%時(shí)，臭氣去除率隨著接種量增加而增加，當(dāng)接種量大于16%時(shí)，臭氣去除率基本不變，因此可以得出接種量為16%時(shí)的臭氣去除率最高，但考慮經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，接種量為12%更實(shí)惠，接種量12%的除臭效果和16%接種量接近。

圖10 豬糞含水率對(duì)除臭影響Figure 10 Effect of moisture content of pig manure on deodorization

圖11 接種量對(duì)除臭影響Figure 11 Effect of inoculation ratio on deodorization

圖12 溫度對(duì)除臭影響Figure 12 The effect of temperature on deodorization

2.4.3 溫度對(duì)發(fā)酵的影響

將復(fù)合菌株接種于含水率為50%的豬糞中，接種量為12%，設(shè)置恒溫發(fā)酵罐溫度為20、24、28、32、36、40 ℃的溫度下，保持其他條件不變，測(cè)定臭氣的濃度，計(jì)算臭氣去除率，探究最佳發(fā)酵溫度。試驗(yàn)結(jié)果如下圖所示。

由圖12可知，當(dāng)溫度低于32℃時(shí)，臭氣的去除率隨著發(fā)酵溫度的升高而增加，當(dāng)溫度高于32 ℃時(shí)，臭氣去除率開(kāi)始下降。溫度為32 ℃時(shí)的臭氣去除率最高。

3 討 論

本次試驗(yàn)在三種復(fù)合菌肥發(fā)酵劑發(fā)酵豬糞的堆肥實(shí)驗(yàn)中，篩選出3株能降解氨氣的菌株。復(fù)合發(fā)酵劑中含有能夠降解豬糞的菌群，給堆肥中的微生物發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和改變豬糞中原有的微生物結(jié)構(gòu)，更有利于篩菌。對(duì)于豬糞中能夠篩出除臭菌株，其原因是在豬糞發(fā)酵中原本含有除臭菌株，通過(guò)添加了復(fù)合菌肥發(fā)酵劑使其成為優(yōu)勢(shì)菌種，通過(guò)選擇培養(yǎng)基將其篩選出。加入復(fù)合發(fā)酵劑的堆肥過(guò)程升溫明顯，除了與恒溫發(fā)酵罐設(shè)定起始溫度有關(guān)，還與復(fù)合菌肥發(fā)酵劑中含有豐富菌群，可以促使堆肥快速分解發(fā)酵。

在篩菌的過(guò)程，本次試驗(yàn)選用的是NH3選擇培養(yǎng)基，通過(guò)篩選出能夠降解氨氣的菌株來(lái)得到我們需要的除臭菌株。在豬糞堆肥中，臭氣的主要成分是氨氣和硫化氫，臭氣的指標(biāo)不能作為篩菌的依據(jù)，因此本次試驗(yàn)使用NH3選擇培養(yǎng)基篩菌，篩出的菌種對(duì)臭氣和氨氣兩大指標(biāo)濃度都有較好的降低效果。

在除臭試驗(yàn)過(guò)程，接種了不同菌株的實(shí)驗(yàn)組，在不同階段的臭氣降解效果不同，也說(shuō)明不同菌株在不同階段發(fā)揮的作用不同。在除臭試驗(yàn)中，臭氣濃度隨著發(fā)酵過(guò)程，先出現(xiàn)下降，在達(dá)到高溫期前會(huì)有一個(gè)短暫的上升，隨后臭氣濃度緩緩下降，不同實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)這一特征，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推斷，其原因可能是在達(dá)到高溫期前，此時(shí)的菌種大量繁殖，使之分解豬糞的速率上升，產(chǎn)生的臭氣也出現(xiàn)回升。在自然界微生物之間的作用和關(guān)系是復(fù)雜的，通過(guò)將三株菌種兩兩之間1∶1復(fù)配，組合后的菌種的除臭效果明顯，其具體生物之間的相互關(guān)系還待進(jìn)一步研究。

發(fā)酵條件是制約發(fā)酵水平的重要因素，在堆肥過(guò)程中，豬糞的含水率，發(fā)酵溫度，和接種量這三個(gè)因素影響著堆肥除臭的實(shí)際效果。含水率是影響微生物的生活環(huán)境，含水率過(guò)低或者過(guò)高都不利于微生物繁殖，硫化氫和氨氣也是可以溶于水，含水率高對(duì)臭氣濃度也是有影響。接種量是最直接影響發(fā)酵速率，當(dāng)接種量不夠，微生物需增加繁殖周期，才能達(dá)到基本的除臭效果。

4 結(jié) 論

本研究主要從三種發(fā)酵劑堆肥發(fā)酵豬糞中篩選出高效除臭菌種，并通過(guò)復(fù)合三株菌種來(lái)研究提高除臭效果。由于復(fù)合發(fā)酵劑中含有大量微生物，可以改變新鮮豬糞中原本含有的生物群落。因?yàn)闆](méi)有特定的除臭選擇培養(yǎng)基，通過(guò)查找資料了解到豬糞中臭氣主要是由氨氣和硫化氫氣體，因此本試驗(yàn)選擇使用氨氣選擇培養(yǎng)基來(lái)篩選出除臭菌株，試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)篩選出的菌株具有除臭效果，對(duì)氨氣除臭效果明顯好于硫化氫。

在復(fù)合試驗(yàn)中，三株菌種的復(fù)合的除臭效果要明顯優(yōu)于單株菌種的除臭效果，因此將單株菌株復(fù)合也是可以作為提高除臭效果的方法去研究。微生物除臭具有高效和環(huán)保等屬性，但是其受外界環(huán)境因素影響較大，因此需要從豬糞含水率、接種量和堆肥溫度來(lái)探究最佳的適宜條件，為微生物除臭應(yīng)用提供基礎(chǔ)。