萱草原生質(zhì)體制備體系的優(yōu)化

牛曉茹，景歡歡，田寧，鄭碩理，陳白冰，黃程前*，陳己任,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.風(fēng)景園林與藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院；b.園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省森林植物園 花卉研究所，湖南 長沙 410116；3.湖南省中亞熱帶優(yōu)質(zhì)花木繁育與利用工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410128)

萱草(Hemerocallisfulva)是百合科(Asphodelaceae)萱草屬(Hemerocallis)一種多年生宿根草本植物，它株型挺拔，花色艷麗，花期長，抗性強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛用于道路綠化、公園綠化和陽臺(tái)美化，在歐洲與北美地區(qū)的花園中占據(jù)重要的地位[1-2]。萱草在我國分布廣泛，栽培歷史悠久，但其單體花期不超過一天，限制了其往切花應(yīng)用方面的發(fā)展[3]。研究表明，萱草花期受不同的單基因控制[4]。因此開花時(shí)間不同的萱草品種雜交有可能延長花期，Darrel Apps[5]利用早花和晚花品種雜交選育出連續(xù)開花6個(gè)月的“金娃娃”。近年來，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良牽?；╗6]、菊花[7]、紫羊茅[8]、水稻[9]等植物的花期。原生質(zhì)體融合技術(shù)是傳統(tǒng)育種的輔助手段，不僅能夠克服有性生殖障礙，而且可以促進(jìn)優(yōu)良性狀的種內(nèi)、種間、屬間整合，從而獲得有性雜交無法得到的優(yōu)良種質(zhì)資源[10-11]。狼尾草與天竺草[12]、羊草與小麥[13]、多花黑麥草與小麥[14]采用PEG法進(jìn)行原生質(zhì)體融合得到了雜種植株，為野生資源的利用提供了新途徑。原生質(zhì)體的制備與培養(yǎng)是進(jìn)行細(xì)胞融合的前提，在植物育種、性狀改良和遺傳轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域具有重要意義[15-16]。

植物原生質(zhì)體是沒有細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，具有細(xì)胞全能性，可以再生成完整的植株。原生質(zhì)體的分離方法主要有酶解法、機(jī)械法和化學(xué)法等[17]，其中酶解法的應(yīng)用最為廣泛[17]。Cooking等[18]最早通過酶解法分離出番茄根尖的原生質(zhì)體，隨著纖維素酶、果膠酶等酶類的普及，原生質(zhì)體分離技術(shù)也越來越成熟。20世紀(jì)80年代，周嫦[19-21]利用內(nèi)壁酶解的方法分離出了萱草的花粉原生質(zhì)體，并在含有不同添加物的K3基本培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體細(xì)胞分裂，形成細(xì)胞團(tuán)和原胚。吳逸等[22]以大花萱草的花瓣為試驗(yàn)材料，分離出花瓣細(xì)胞的原生質(zhì)體。在以黃花菜葉片為材料提取原生質(zhì)體時(shí)，采用果膠酶、纖維素酶、崩潰酶來分離原生質(zhì)體[23]。國內(nèi)外關(guān)于萱草原生質(zhì)體制備研究報(bào)道較少，以花粉、花瓣為原材料，其取材方面受到一定限制，以葉片為原材料，后期原生質(zhì)體培養(yǎng)易受污染。本研究以萱草無菌苗葉片和花瓣為試驗(yàn)材料，通過正交試驗(yàn)，探究纖維素酶濃度、離析酶濃度、酶解時(shí)間、滲透壓調(diào)節(jié)劑種類、滲透壓大小、離心轉(zhuǎn)速等因素對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，為體細(xì)胞雜交及后期新品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萱草葉片取自萱草‘貴婦’(Hemerocalliscv.‘Guifu’)前期建立再生體系的無菌苗的幼嫩葉；花瓣取自室外盆栽苗，盛花期采摘，花瓣顏色為紫紅色。

主要試劑有纖維素酶(R-10,Yakult Honsha)、離析酶(R-10,Yakult Honsha)、山梨醇、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、MES、亞甲基藍(lán)溶液、Z3培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+7 g/L瓊脂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的擴(kuò)繁

萱草外植體經(jīng)消毒后，進(jìn)行組織培養(yǎng)建立再生體系；切取再生出的幼嫩芽接種于Z3培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)周期50～60 d，培養(yǎng)條件為16 h光照+8 h黑暗，25±2 ℃。

1.2.2 試劑配制

酶解液的配制：按試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加纖維素酶R-10、離析酶R-10、山梨醇、8 mmol/L CaCl2、3 mmol/L緩沖液MES(pH=5.7)、0.1%BSA，pH為5.6～5.8，對(duì)酶解液進(jìn)行過濾滅菌(0.22 μm微孔濾膜抽濾滅菌)。酶解液濃度配比按照三因素三水平的正交試驗(yàn)L9(33)(表1)，9個(gè)處理中山梨醇濃度均為0.5 mol/L[22]。

表1 萱草原生質(zhì)體分離正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design for protoplast isolation of H. fulva

W5溶液制備：154 mmol/L NaCl+125 mmol/L CaCl2·2H2O+5 mmol/L葡萄糖+0.03%MES，pH為5.8，高壓滅菌20 min，室溫保存。

1.2.3 原生質(zhì)體的酶解與純化

取培養(yǎng)50～60 d的健康萱草葉片和盛開的花瓣，用干凈的手術(shù)刀片將其切成寬0.5～1 mm的長條，將處理好的材料按1∶10(即0.5 g切碎的材料加入5 mL酶解液)的比例加入酶解液中，于50 r/min、25±1 ℃黑暗條件下震蕩酶解2～6 h。酶解結(jié)束后，向酶解混合物中加入等體積的W5溶液靜置5 min，終止反應(yīng)；用40 μm的過濾篩過濾酶解產(chǎn)物；分別用(400、600、800、1 000、1 200 r/min)室溫離心2 min，棄上清液，收集原生質(zhì)體，之后再加入1 mL W5溶液重懸后，800 r/min離心2 min，棄上清，加入0.5 mL W5溶液重懸,得到純化后的原生質(zhì)體備用；將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)行稀釋，在倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)血球計(jì)數(shù)板上的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)。

1.2.4 滲透壓調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

將葉片和花瓣分別放入其最佳酶液組合中，分別加入0.5 mol/L的甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖4種滲透壓調(diào)節(jié)劑，黑暗條件下酶解4 h，比較不同滲透壓調(diào)節(jié)劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

將葉片和花瓣分別放入其最佳酶液組合中，分別加入甘露醇0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L共6個(gè)處理，黑暗條件下酶解4 h，比較不同濃度甘露醇對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

1.3 原生質(zhì)體的產(chǎn)量測(cè)定

用移液槍吸取10 μL原生質(zhì)體溶液滴加在0.1 mm血球計(jì)數(shù)板上，靜置10 s，讓液體自然充滿計(jì)數(shù)室，在倒置顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量。產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)用血球計(jì)數(shù)板法，在倒置顯微鏡下找到計(jì)數(shù)室的25個(gè)方格，統(tǒng)計(jì)中間和4個(gè)角上方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)(共5格)，然后根據(jù)以下公式計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

1.4 原生質(zhì)體活力的測(cè)定

原生質(zhì)體活力的測(cè)定用亞甲基藍(lán)染色法，取5 μL原生質(zhì)體溶液和染色劑2∶1混合后2 min置于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的顯色情況。具活性的原生質(zhì)體不被染色,不具活性的原生質(zhì)體則呈現(xiàn)深藍(lán)色。隨機(jī)觀察6個(gè)視野，記錄染成深藍(lán)色的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)和不被染色的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)，并根據(jù)以下公式計(jì)算原生質(zhì)體活力：

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，用SPSS 26.0進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，極差分析，并用鄧肯氏新復(fù)級(jí)差法(DMRT)測(cè)驗(yàn)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 萱草原生質(zhì)體的分離

以萱草葉片和花瓣為原材料，分離出的原生質(zhì)體如圖1所示。葉片原生質(zhì)體直徑約為40～80 μm(圖1A)要明顯大于花瓣原生質(zhì)體20～50 μm(圖2B)。

圖1 萱草的原生質(zhì)體Figure 1 Isolation and purification of protoplasts from leaves of H. fulva

2.2 酶濃度與酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

酶是分離原生質(zhì)體的重要影響因素，選擇合適的酶種類、濃度可提高產(chǎn)量和活力，一般選用纖維素酶和離析酶分離原生質(zhì)體。本試驗(yàn)采用三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)萱草原生質(zhì)體制備所需的酶解液最佳濃度和酶解時(shí)間進(jìn)行篩選。

表2 萱草原生質(zhì)體分離正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test on protoplast isolation from H. fulva

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各種酶濃度都可以產(chǎn)生原生質(zhì)體，但不同濃度酶液下分離出的原生質(zhì)體產(chǎn)量存在顯著差異(表2)。葉片在處理3中原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)4.25×105個(gè)/克，處理1原生質(zhì)體產(chǎn)量較低，僅0.75×105個(gè)/克，但原生質(zhì)體活力最高，說明各因素不同水平對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力的影響存在較大差異；葉片與花瓣適宜的酶濃度和酶解時(shí)間不同，花瓣在處理7中分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)4.33×105個(gè)/克，但原生質(zhì)體的活力一般。花瓣、葉片在試驗(yàn)處理水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)原生質(zhì)體分離效果的影響程度可通過極差(R)的大小體現(xiàn)。

由表3極差(R值)可知，三個(gè)因素對(duì)于葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響順序是：離析酶濃度>酶解時(shí)間>纖維素酶濃度。當(dāng)纖維素酶濃度為0.5%(水平1)時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，與其他兩水平無差異，但隨著纖維素酶濃度增加，產(chǎn)量逐漸下降。然而，隨著離析酶濃度和酶解時(shí)間的增加原生質(zhì)體產(chǎn)量在逐漸增加，當(dāng)離析酶濃度達(dá)到0.75%和酶解時(shí)間6 h時(shí)產(chǎn)量均達(dá)到高峰，且離析酶濃度和酶解時(shí)間均對(duì)于原生質(zhì)體的產(chǎn)量有顯著的影響。故此葉片原生質(zhì)體制備的最佳組合為0.5%纖維素酶+0.75%離析酶+酶解時(shí)間6 h。

表3 不同處理對(duì)萱草原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力影響的極差分析Table 3 Intuitive analyses of effect of different treatments on yield and viability in H. fulva

三個(gè)因素對(duì)花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響與葉片不同，其影響大小順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>纖維素酶濃度>離析酶濃度。隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸提高，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到高峰；隨著纖維素濃度逐漸增加，花瓣產(chǎn)生的原生質(zhì)體也逐漸增高加，當(dāng)纖維素濃度達(dá)到1.5%時(shí)產(chǎn)量到達(dá)最高。離析酶濃度各水平之間無顯著差異，但隨著離析酶濃度的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量先上升后降低，在酶濃度為0.5%(水平2)時(shí)產(chǎn)量達(dá)到高峰。故花瓣原生質(zhì)體制備的最佳組合為1.5%纖維素酶+0.5%離析酶+酶解時(shí)間4 h。

原生質(zhì)體活力測(cè)定中，三因素對(duì)于葉片和花瓣原生質(zhì)體活力的影響大小順序均為：酶解時(shí)間>纖維素酶濃度>離析酶濃度。酶解時(shí)間和纖維素酶濃度均對(duì)萱草葉片和花瓣原生質(zhì)體活力呈現(xiàn)出顯著性差異，說明主效應(yīng)存在，纖維素酶濃度和酶解時(shí)間均會(huì)對(duì)活力產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)纖維素酶濃度、酶解時(shí)間2個(gè)因素均為低水平時(shí)，原生質(zhì)體活力較高，說明纖維素酶濃度過高和酶解的時(shí)間過長均不利于原生質(zhì)體活力的保持。離析酶濃度對(duì)葉片和花瓣原生質(zhì)體活力的影響無顯著性差異，因此離析酶濃度對(duì)原生質(zhì)體活力影響較小。

2.3 滲透壓調(diào)節(jié)劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，酶解液的滲透壓需要與細(xì)胞的滲透壓相似才能保持其膜穩(wěn)定性和活力。通常加入葡萄糖、甘露醇或山梨醇等滲透壓調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)酶解液的滲透壓[24]。本試驗(yàn)探究甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖4種原生質(zhì)體常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑對(duì)萱草原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

結(jié)果表明，4種滲透壓調(diào)節(jié)劑均對(duì)葉片和花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量產(chǎn)生了顯著影響(圖2)。以山梨醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑時(shí)葉片和花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量均為最高。滲透壓調(diào)節(jié)劑為山梨醇時(shí)，分離的葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)3.33×105個(gè)/克，而甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量略低于山梨醇，但兩者產(chǎn)量無顯著差異，因此兩者皆可以作為萱草葉片原生質(zhì)體提取的滲透壓調(diào)節(jié)劑。與之不同的是，在花瓣原生質(zhì)體的制備中，當(dāng)滲透壓調(diào)節(jié)劑為山梨醇時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)4.25×105個(gè)/克，以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑是原生質(zhì)體產(chǎn)量僅1.83×105個(gè)/克，兩者產(chǎn)量相差2.42×105個(gè)/克，因此以花瓣為原材料時(shí)，滲透壓調(diào)節(jié)劑宜選用山梨醇。

圖2 滲透壓調(diào)節(jié)劑種類對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Figure 2 Effect of osmolality regulator type on protoplast yield

2.4 滲透壓對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和狀態(tài)的影響

適宜的滲透壓濃度對(duì)原生質(zhì)體的制備十分重要，過高濃度的滲透壓會(huì)使原生質(zhì)體失水死亡，濃度過低會(huì)使原生質(zhì)體吸水脹破死亡。本試驗(yàn)以山梨醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，探究6種山梨醇濃度下原生質(zhì)體的產(chǎn)量情況及原生質(zhì)體狀態(tài)。

圖3 滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Figure 3 Effect of osmolality regulator concentration on protoplast yield

結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著山梨醇濃度的升高而上升，當(dāng)達(dá)到峰值后，隨著山梨醇濃度的增加產(chǎn)量逐漸下降。當(dāng)山梨醇濃度為0.4 mol/L時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到高峰，葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到4.67×105個(gè)/克，花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到3.22×105個(gè)/克。當(dāng)山梨醇濃度為0 mol/L時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察到原生質(zhì)體吸水脹破嚴(yán)重，碎片較多；當(dāng)山梨醇濃度為0.8、1.0 mol/L時(shí)原生質(zhì)體變形，原生質(zhì)體受壓不均勻，變形破裂。因此，篩選適合的山梨醇濃度對(duì)原生質(zhì)體的制備很重要。山梨醇濃度為0.4 mol/L時(shí)原生質(zhì)體呈規(guī)則球狀，邊界清晰，形態(tài)完整，并且產(chǎn)量最高，因此萱草原生質(zhì)體制備時(shí)山梨醇適宜濃度為0.4 mol/L。

2.5 離心轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

在相同條件下，葉片和花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速的增加先增加后降低的趨勢(shì)，在800 r/min下，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高。隨著離心轉(zhuǎn)速的增加產(chǎn)量得到了提升，但破裂的細(xì)胞碎片也在增加，適宜的離心轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量有顯著影響。相同條件下，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加原生質(zhì)體活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，雖然400 r/min下原生質(zhì)體活力最佳，但其產(chǎn)量較低，因此綜合產(chǎn)量與活力兩者原生質(zhì)體在收集時(shí)離心轉(zhuǎn)速應(yīng)為800 r/min。

圖4 離心轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Figure 4 Effect of centrifugal speed on protoplast yield

圖5 離心轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體活力的影響Figure 5 Effect of centrifugal speed on the viability of protoplasts

3 討 論

原生質(zhì)體的制備是體細(xì)胞雜交的重要環(huán)節(jié)，目前已有很多相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于萱草原生質(zhì)體的分離研究還較少。單子葉植物原生質(zhì)體的制備大多采用疏松易碎的愈傷組織或懸浮細(xì)胞[18]。本試驗(yàn)以萱草‘貴婦’葉片和花瓣為試驗(yàn)材料制備原生質(zhì)體，探究原生質(zhì)體制備中的影響因素。

(1)試驗(yàn)材料?；ò曜鳛樵囼?yàn)材料，制備出的原生質(zhì)體顏色鮮艷，便于分辨，可以清晰的觀察細(xì)胞的融合，但取材時(shí)間受植物花期影響。植物組培苗葉片取材方便，生長周期穩(wěn)定，可通過酶解法分離出大量的狀態(tài)良好的原生質(zhì)體，因此葉片是植物原生質(zhì)體分離時(shí)最常用的材料。Sauve等[23]以黃花菜葉片為材料制備原生質(zhì)體時(shí)，其葉片為室外采摘，雖進(jìn)行了消毒，但可能消毒不徹底導(dǎo)致后期的污染，使用無菌苗葉片則可以避免。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，萱草葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量與葉片的幼嫩程度有很大關(guān)系，苗齡60 d的葉片比苗齡30 d嫩葉分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量高出很多倍。李妮娜[25]等也證實(shí)不同葉齡的棉花幼葉對(duì)原生質(zhì)體得率有著顯著影響，原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨著葉齡的增加而增加，葉齡12 d的時(shí)候到達(dá)峰值，隨后原生質(zhì)體活力開始下降。研究中還發(fā)現(xiàn)，萱草花瓣制備原生質(zhì)體的效率要高于萱草葉片的提取效率。葉片前期產(chǎn)量較低，隨著時(shí)間的延長，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸提高，當(dāng)酶解時(shí)間6 h時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最高。與之相反的是花瓣酶解4 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量就達(dá)到了最高。這可能是由于萱草單朵花期只有1 d，花瓣嬌嫩，易于酶解，而葉片為50～60 d的無菌苗葉片，葉片較花瓣來說較老，也可能不同器官之間存在差異，可以進(jìn)一步研究。

(2)酶解時(shí)間。酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的直接因素。隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量也隨之增加，然而酶解時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體的活力下降，與側(cè)柏[26]研究結(jié)果一致。研究表明，葉片制備原生質(zhì)體需要酶解6 h，與黃花菜研究結(jié)果一致；花瓣則僅需4 h，這與大花萱草[22]上的研究結(jié)果相似。原生質(zhì)體的活力在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)中占據(jù)重要地位。酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力的影響還可以進(jìn)一步研究。同一品種的萱草葉片和花瓣在提取原生質(zhì)體時(shí)所需的酶解時(shí)間不同，這可能葉片與花瓣含糖量不同有關(guān)，可進(jìn)一步研究。

(3)酶組合。在原生質(zhì)體分離試驗(yàn)中，需要解離細(xì)胞壁和胞間層，使原生質(zhì)體得以提取。植物細(xì)胞壁主要由纖維素組成，胞間層多為果膠類物質(zhì)，一般采用纖維素酶和離析酶作用于細(xì)胞壁。在一定范圍內(nèi)，酶的作用效果隨著濃度的增加而增加，當(dāng)酶濃度超過一定范圍，就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，酶解效果就會(huì)下降[27]。研究發(fā)現(xiàn)隨著纖維素酶濃度的升高原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸減少，與東方百合[28]上的研究結(jié)果相似。在黃花菜原生質(zhì)體提取中使用了3種酶，本試驗(yàn)選取纖維素酶與和離析酶2種酶探究酶組合對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活性的影響，進(jìn)一步優(yōu)化了原生質(zhì)體提取方案。本試驗(yàn)酶組合是一起混合均勻后添加，酶的添加順序和時(shí)機(jī)還可以進(jìn)一步探究。

(4)滲透壓調(diào)節(jié)劑及濃度。前人研究中萱草花瓣和花粉原生質(zhì)體分離以0.5 mol/L甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，葉片原生質(zhì)體分離采用0.6 mol/L山梨醇。在以0.4 mol/L的山梨醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑的酶液中原生質(zhì)體更圓潤。在山桃原生質(zhì)體分離中，對(duì)比甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖四種滲透劑的效果，發(fā)現(xiàn)0.55 mol/L山梨醇效果最好[29]，這與本研究試驗(yàn)結(jié)果相似。表明合適的滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度，可以提高原生質(zhì)體產(chǎn)量，濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以山梨醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑的情況下，所得的原生質(zhì)體產(chǎn)量高于以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，在以蔗糖、葡萄糖為滲透壓調(diào)節(jié)劑的情況下，所得的原生質(zhì)體產(chǎn)量較低，可能是因?yàn)檎崽?、葡萄糖在酶解液的粘稠性較高，使得原生質(zhì)體聚集在一起，在純化時(shí)原生質(zhì)體無法分離，也可能是導(dǎo)致產(chǎn)量較低的原因。

(5)離心轉(zhuǎn)速。在原生質(zhì)體收集過程中，適宜的離心轉(zhuǎn)速不僅可以提高產(chǎn)量，更能保證原生質(zhì)體的質(zhì)量。轉(zhuǎn)速過高時(shí)會(huì)降低原生質(zhì)體活力，過低會(huì)減少原生質(zhì)體產(chǎn)量，因此適宜的轉(zhuǎn)速很重要，這與王珺華[30]等研究結(jié)果相似。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速對(duì)葉片原生質(zhì)體的活力影響小于花瓣，這可能與原生質(zhì)體的大小有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)影響萱草原生質(zhì)體分離過程進(jìn)行優(yōu)化，獲得了其原生質(zhì)體制備條件的最佳參數(shù)，建立了一套高效快捷的制備體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，用同一品種萱草的不同器官為原生質(zhì)體制備的原材料，所需的酶濃度及酶解時(shí)間均不同。以萱草‘貴婦’葉片為原材料，其原生質(zhì)體制備的最佳方案如下：

0.5%纖維素酶R-10+0.75%離析酶R-10+0.4 mol/L山梨醇，酶解時(shí)間為6 h；以花瓣為原材料的原生質(zhì)體制備最佳方案：1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.4 mol/L山梨醇，酶解時(shí)間為4 h。在原生質(zhì)體純化時(shí)，合適的離心轉(zhuǎn)速為800 r/min，可以保證活性的同時(shí)提高產(chǎn)量。