堿性條件高效降解小麥秸稈菌群的篩選及酶活力特點(diǎn)

佟旭楠，洪梓萌，白狄純，旦增卓嘎，王金龍

(天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300392)

農(nóng)作物秸稈是指作物收獲之后殘留的根、莖、葉部分。中國的秸稈產(chǎn)量達(dá)到了9億噸[1]，其中三大主要作物的秸稈總產(chǎn)量占比最高，共占秸稈總產(chǎn)量的83.51%[2]。作物秸稈是一種可再生的資源，大部分秸稈被焚燒，造成生物資源浪費(fèi)，也造成生態(tài)環(huán)境問題；而秸稈就地還田常常表現(xiàn)為秸稈降解慢，影響下茬作物的生長。因此，尋找一種安全有效省時(shí)省力的秸稈處理方式，對(duì)秸稈的有效利用具有重要意義。近年來，利用微生物有效降解作物秸稈，使秸稈發(fā)揮其有效價(jià)值，提高其利用率，既環(huán)保又利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，成為農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[3-6]。

秸稈中的木質(zhì)纖維素等難分解物質(zhì)降解的快慢是秸稈改善土壤肥力和促進(jìn)后續(xù)作物生長的決定因素。早期的研究者采用向土壤中施加外源纖維素酶來促進(jìn)秸稈的降解，然而這種措施由于成本較高而不利于在實(shí)際生產(chǎn)中推廣。微生物是植物凋落物和作物秸稈的主要分解者之一，且微生物具有相應(yīng)的高效的酶系統(tǒng)，如纖維素酶。因此，通過選擇在某種特異條件具有高酶活性的微生物或者復(fù)合微生物菌群來加速還田秸稈的分解，成為促進(jìn)都市農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展的重要措施之一。如，Gaind & Nain[7]將兩種真菌接種到還田秸稈中，可加速秸稈降解。我國地域遼闊，土壤環(huán)境多樣。其中，鹽堿化耕地面積達(dá)到9.578 4×104hm2，約占耕地總面積的6.62%。因此，篩選適宜于堿性土壤中的微生物菌群的相關(guān)工作值得研究者的廣泛關(guān)注。

本研究在構(gòu)建降解小麥秸稈復(fù)合菌群的基礎(chǔ)上，測定復(fù)合菌群羧甲基纖維素酶(CMCase)、濾紙酶(FPA)、木聚糖酶(Xylanase)和漆酶(Laccase)活性在系列偏堿性培養(yǎng)條件下的活動(dòng)變化，篩選降解小麥秸稈的高效復(fù)合菌群，為堿性土壤地區(qū)的小麥秸稈還田土壤改良提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用秸稈材料為采自天津市寶坻區(qū)長期定位試驗(yàn)田的小麥秸稈，用秸稈粉碎機(jī)磨碎、滅菌后用于后續(xù)試驗(yàn)。

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選取對(duì)堿性環(huán)境下對(duì)秸稈分解有應(yīng)用潛力的黑曲霉(Aspergillusniger)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和里氏木霉(Trichodermareesei)作為微生物材料。它們均能夠降解秸稈并對(duì)作物生長有促進(jìn)作用。其中，除蘇云金芽孢桿菌為細(xì)菌外，其余6種均為真菌，這些微生物材料購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(http://www.cgmcc.net)。

通過平板對(duì)峙培養(yǎng)，篩選無拮抗作用的兩兩菌種配置成復(fù)合菌劑。本試驗(yàn)共配置8組復(fù)合菌劑，分別為：黑曲霉+黃孢原毛平革菌(An+Pc)、黑曲霉+草酸青霉(An+Po)、蘇云金芽孢桿菌+黃孢原毛平革菌(Bt+Pc)、蘇云金芽孢桿菌+草酸青霉(Bt+Po)、黃孢原毛平革菌+擴(kuò)展青霉(Pc+Pe)、黃孢原毛平革菌+哈茨木霉(Pc+Th)、黃孢原毛平革菌+里氏木霉(Pc+Tr)、哈茨木霉+里氏木霉(Th+Tr)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同復(fù)合菌群酶活性的比較研究

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素為8組不同的復(fù)合菌群，每個(gè)菌群重復(fù)3次。將不同種類的復(fù)合菌群菌液5 mL(約108個(gè)孢子；兩種菌群的比例為1∶1)分別加入已經(jīng)滅菌的裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基(pH 9.0；含有1%前期粉碎處理的小麥秸稈)的250 mL的三角瓶中，25 ℃，120 r/min搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)96 h后，取樣測量羧甲基纖維素酶活力(CMCase)、濾紙酶活力(FPA)、木聚糖酶活力(FPA)和漆酶活力(Laccase)。

1.2.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)代表性復(fù)合菌群酶活力的影響

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素為培養(yǎng)基初始pH，包括pH 8.0和pH 9.0兩種水平，每種處理重復(fù)3次。選擇黃孢原毛平革菌+擴(kuò)展青霉(Pc+Pe)這組復(fù)合菌群為研究對(duì)象，在如1.2.1相同的試驗(yàn)條件下培養(yǎng)。120 h后，測量如同1.2.1的四種酶活力。

1.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)代表性復(fù)合菌群酶活力的影響

本試驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素為培養(yǎng)時(shí)間，包括24、48、72、96和120 h共5個(gè)采樣時(shí)間，每次采樣重復(fù)3次。選擇黃孢原毛平革菌+擴(kuò)展青霉(Pc+Pe)這組復(fù)合菌群為研究對(duì)象，在如1.2.1相同的試驗(yàn)條件下培養(yǎng)，每隔24 h取樣測量如同1.2.1的四種酶活力，連續(xù)測定5次。

1.3 試驗(yàn)方法

羧甲基纖維素酶活力(CMCase)、濾紙酶活力(FPA)、木聚糖酶活力(FPA)的測定均采用DNS比色法測定，1mg C6H12O6/h記作1個(gè)酶活力單位(U)[8]。漆酶活力(Laccase)活力測定采用ABTS分光光度計(jì)法測定，1 μmol ABTS/min記作1個(gè)漆酶單位(U)[9]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用單因素方差分析中的多重比較來檢驗(yàn)不同復(fù)合菌群對(duì)四種酶活力的影響以及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)四種酶活力的影響；利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來檢驗(yàn)兩種初始培養(yǎng)基pH對(duì)四種酶活力的影響。以上分析利用軟件SPSS 22.0 (IBM, Chicago, IL, USA)進(jìn)行，并利用Excel 2016進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)合菌群酶活力的比較研究

基于羧甲基纖維素酶活力的測定結(jié)果可知：An+Pc以及Pc+Pe兩種處理?xiàng)l件下所得酶活力顯著高于An+Po，Bt+Pc和Bt+Po處理，而Bt+Pc和Bt+Po兩種處理顯著低于除Th+Tr外的所有處理(圖1A)?；跒V紙酶活力的測定結(jié)果可知：Pc+Pe、Pc+Th和Pc+Tr三種處理?xiàng)l件下所得酶活力最高，而An+Po處理?xiàng)l件下所得酶活力最低(圖1B)。基于木聚糖酶活力的測定結(jié)果可知，處理間對(duì)該酶活力無顯著影響(P>0.05)(圖1C)。基于漆酶活力的測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，An+Pc處理?xiàng)l件下所得酶活力最低，顯著低于An+Po、Bt+Po、Pc+Pe、Pc+Th和Pc+Tr(P<0.05)，而與Bt+Pc和Th+Tr間無顯著差異(P>0.05)(圖1D)。

2.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)代表性復(fù)合菌群酶活力的影響

獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)：在培養(yǎng)基初始pH 8.0 和pH 9.0兩種處理?xiàng)l件下，濾紙酶、木聚糖酶和漆酶活力無顯著差異(P>0.05)；僅羧甲基纖維素酶之間差異顯著(P<0.001)，表現(xiàn)為pH 8.0處理?xiàng)l件下所得結(jié)果顯著高于pH 9.0所得結(jié)果，約為pH 9.0處理?xiàng)l件下所得結(jié)果的4倍。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)代表性復(fù)合菌群酶活力的影響

單因素方差分析結(jié)果表明(圖3)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)羧甲基纖維素酶和濾紙酶活力影響顯著(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，這兩種酶活力逐漸增加，并于96 h達(dá)到最大值，隨后急速下降。而培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木聚糖酶和漆酶活力無顯著影響(P>0.05)。

圖1 復(fù)合菌群間四種酶活力比較(A: 羧甲基纖維素酶；B: 濾紙酶；C: 木聚糖酶；D: 漆酶)Figure 1 Comparisons of enzyme activities of composition microbes(A: CMCase；B: FPA；C: Xylanase；D: Laccase)

圖2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)代表性復(fù)合菌群酶活力的影響(***表示在0.001水平下差異顯著)Figure 2 Effects of initial pH value on enzyme activity of the representative compound microbes with wheat straw (*** indicates significant difference at 0.001 level.)

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)代表性復(fù)合菌群酶活力的影響Figure 3 Effects of culture time on enzyme activity of the representative compound microbes with wheat straw

3 討論與結(jié)論

秸稈降解菌的產(chǎn)酶能力往往會(huì)受到環(huán)境因素，如培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH等的影響。本研究所用代表性菌群在偏堿性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，羧甲基纖維素酶和濾紙酶活力受培養(yǎng)時(shí)間影響顯著，且均在4 d(96 h)達(dá)到最高值(圖3)。而相似的研究中多支持4～6 d為復(fù)合菌群酶活力較高的時(shí)期，如張悅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌群Pelomonasgx.+Curvibacterzj.產(chǎn)酶能力明顯高于單一菌株，且在溫度35 ℃、pH 6.5的條件下培養(yǎng)4 d時(shí)的酶活力最高；而李文學(xué)等[11]從四川成都平原多年秸稈還田的土壤中篩選得到了復(fù)合菌系WSS-1，該菌群CMCase活力在6 d左右最高。基于這些酶均為重要的纖維素分解酶，在秸稈分解后期發(fā)揮重要的作用，因此對(duì)判斷培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的作用時(shí)具有較為重要的參考價(jià)值，也是指導(dǎo)實(shí)踐的重要依據(jù)。

已有許多研究表明纖維素酶在偏酸性環(huán)境下活性較高，如王雙等[12]篩選出的曲霉菌屬LK8(Aspergilluscf.flavipesATUS)、青霉菌屬LK10(Penicilliumsp. LH33)在pH 6.0時(shí)產(chǎn)酶性能最好，降解能力較強(qiáng)。而本研究結(jié)果表明黃孢原毛平革菌+擴(kuò)展青霉(Pc+Pe)復(fù)合菌群即使pH 9.0條件下也能很好地生長，且僅羧甲基纖維素酶活力在pH 9.0條件下顯著下降，而其他三種酶活力在pH 8.0和pH 9.0之間并無顯著差異(圖2)。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)一些微生物更適宜于偏堿性環(huán)境，如孫學(xué)花等[13]利用黑曲霉、里氏木霉等8種菌對(duì)小麥秸稈進(jìn)行模擬田間腐解進(jìn)程時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些酶的生長適宜pH為8.1；裴宇航[14]在研究玉米秸稈降解菌的特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，初始培養(yǎng)基在pH 3.5至pH 8.0等間隔10種處理中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，所得最終pH均有所提升，且初始pH高于5.0的7種處理?xiàng)l件下最終pH均高于7.0，并指出復(fù)合菌群生長活動(dòng)對(duì)培養(yǎng)液pH的影響較小，培養(yǎng)液pH能夠在上升一段時(shí)間后保持穩(wěn)定，而單一菌群需要不斷地投加pH緩沖劑來控制培養(yǎng)液pH，該研究所選復(fù)合菌的最適產(chǎn)酶pH為7.5。以上研究支持部分復(fù)合菌群在偏堿性環(huán)境下也能很好發(fā)揮秸稈降解的作用，且比單一菌群具有相對(duì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，通過試驗(yàn)篩選可以得到適合堿性土壤條件下的用于秸稈分解的復(fù)合菌群。

通過不同復(fù)合菌群酶活力的差異比較，可以篩選得到高活力的復(fù)合菌群。就本研究而言，pH 9.0培養(yǎng)條件下，黃孢原毛平革菌+擴(kuò)展青霉(Pc+Pe)復(fù)合菌群四種酶活力均最高，且在觀測的4種酶活力中，有三種酶活力在pH 8.0和pH 9.0處理間無顯著差異，表現(xiàn)出較好的偏堿性環(huán)境的耐受性。這為偏堿性土壤小麥秸稈還田的有效利用提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。