幽門螺桿菌感染導致功能性消化不良的分子機制研究

胡艷霞，山韋喜，丁建紅，金 哲，婁 俊，楊曉旭，杜 倩，廖秋實，石國慶，徐靖宇，謝 睿，王海波

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

功能性消化不良(Functional dyspepsia，F(xiàn)D)系指起源于胃、十二指腸原因不明的上消化道功能障礙性疾病，主要表現(xiàn)為上腹飽脹、早飽、燒心、上腹痛、惡心等不適，且診斷該病須排除可引起上述癥狀的器質(zhì)性、代謝性和系統(tǒng)性疾病。羅馬Ⅳ標準將功能性消化不良分為3種類型：上腹痛綜合征、餐后不適綜合征以及上腹痛、餐后不適重疊綜合征[1]。FD具有難以完全緩解、復發(fā)性、慢性經(jīng)過的特性，嚴重影響患者的工作、生活，是困擾臨床醫(yī)生的一大難題。

目前FD的病因和發(fā)病機制尚未完全明確，文獻及本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)FD與飲食、NSAIDS藥物使用、胃腸道動力、內(nèi)臟高敏性、精神心理因素以及Hp感染等多種因素有關[2]。眾多的臨床病例研究顯示，在功能性消化不良患者中更容易檢測出Hp，對Hp陽性FD患者進行根除Hp治療有助于FD癥狀的改善。因此，Hp感染被認為可能是引起FD消化道癥狀的因素之一[2]。Hp是一種微需氧的革蘭陰性螺旋桿菌，可在惡劣的胃環(huán)境中存活幾十年，其主要的致病毒力因子是細胞毒相關基因A抗原(CagA)和空泡毒素A(VacA)毒力蛋白，根據(jù)是否存在CagA蛋白和VacA蛋白，將幽門螺桿菌分為I型菌株(CagA+ VacA+)和II型菌株(CagA- VacA-)，而這兩者中CagA陽性菌株對胃黏膜損傷更為嚴重[3]。文獻研究已經(jīng)證實CagA可以通過Hp的Ⅳ型分泌系統(tǒng)進入宿主細胞，通過依賴或者獨立于磷酸化的相關機制干擾細胞正常的信號轉(zhuǎn)導，干擾細胞增殖及凋亡，導致胃潰瘍或者胃癌[4]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)與Hp感染的無癥狀患者相比，Hp感染的功能性消化不良患者胃黏膜的CagA陽性率明顯增高，提示Hp感染后可能通過CagA影響FD患者的癥狀及疾病發(fā)展。臨床研究發(fā)現(xiàn)FD患者胃黏膜5-羥色胺(5-HT)和5-羥色胺受體(5-HTR)的mRNA的表達較正常人明顯增加，因此認為FD患者胃動力的改變與此相關[5]。5-HT是一種廣泛分布在動物體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，可調(diào)節(jié)包括情感、認知、機動、喂食、睡眠和傷害性感受等過程。胃腸道多種細胞內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)5-HTR，如腸嗜鉻細胞、平滑肌細胞、分泌細胞、神經(jīng)細胞等。目前的研究總結出5-HTR分為7種亞型(5-HTR1～5-HTR7)和多種亞亞型，其中5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4分布于腸神經(jīng)元上，與胃腸道功能關系密切，調(diào)控著神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[6]。以上3種受體均參與內(nèi)臟感覺的調(diào)控，其中5-HTR3和5-HTR4參與短暫的痛覺反應[7]，5-HTR1參與長時程的強烈痛覺反應。已有文獻證實Hp感染后能引起體內(nèi)胃泌素、多巴胺、5-HT等激素水平變化[8]，但相關機制尚不明確。

CagA可綁定在細胞膜內(nèi)表面，發(fā)生磷酸化后CagA與多宿主蛋白相互作用，激活下游信號通路，如MEK/ERK、NF-kB(p65)等[9]，增強胃上皮細胞的增殖能力，上調(diào)IL-6、IL-8、TNF-a、NF-kB等促炎因子表達，其中NF-kB被認為是胃發(fā)生病理生理改變的重要介質(zhì)。p65是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，其在胃炎、胃癌發(fā)展及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中有至關重要的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)NF-kB激活后不僅影響細胞因子釋放，甚至可能引起體內(nèi)激素等化學物質(zhì)變化，有文獻證實在腸嗜硌細胞瘤的研究中證實NF-kB激活可以促進5-HT釋放增加[11]，預實驗也發(fā)現(xiàn)Hp CagA陽性的胃黏膜組織中p65的蛋白表達較Hp CagA陰性的組織明顯增高，提示在胃黏膜中NF-kB很可能參與CagA相關疾病的調(diào)控機制。因此本研究將驗證Hp釋放的CagA侵入宿主細胞后能夠激活NF-kB通路，從而影響血液中5-HT的含量及與胃腸道功能調(diào)控相關5-HT1R、5-HTR3、5-HTR4的表達，導致FD病人的消化道相關癥狀。本研究不僅是對Hp導致FD機制的重要補充，更為臨床治療FD提出新的治療方向及靶點。

1 對象與方法

1.1 對象 胃黏膜組織標本來源于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡室，正常胃黏膜組織標本12個，Hp感染的CagA陽性的功能性消化不良患者胃黏膜組織標本12個，本研究獲得患者知情同意并簽署知情同意書，且通過倫理審批(倫理審批號：KLLY-2020-118)。5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4、p-p65抗體均購買于Abcam公司；CagA抗體購買于Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 免疫組化法 12例FD-Hp+CagA+和12例健康對照組的胃黏膜組織，檢測5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4、p65的蛋白表達變化。組織常規(guī)脫蠟脫水，二甲苯 Ⅰ 10 min，二甲苯 Ⅱ 10 min，無水乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min，ddH2O清洗2次，PBS清洗1次，雙氧水避光孵育15 min，清洗，抗原修復(檸檬酸鹽，微波爐中高火10 min)清洗，一抗過夜，復溫30 min，PBS清洗3次，二抗孵育30 min，PBS 洗3次，DAB顯色，流水沖洗10 min，蘇木素復染，流水沖洗，90%乙醇10 s，90%乙醇30 s，無水乙醇30 s，無水乙醇30 s，二甲苯 Ⅰ 3 min二甲苯 Ⅱ 3 min，中性樹膠封固。結果運用IPP軟件統(tǒng)計陽性信號值。再應用GraphPad Pism 7.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3 Western blot法 12例FD-Hp+CagA+和12例健康對照組的胃黏膜組織，檢測5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4、p-p65的蛋白表達變化。胃鏡下取出新鮮胃竇黏膜組織，分裝至EP管，加入RIPA裂解液，使用研磨機研缽粉碎組織塊；RC-DC 法進行蛋白定量，配制 5% 的濃縮膠和10% 的分離膠，每孔加20 μg蛋白。進行SDS-PAGE 電泳(濃縮膠60 V電泳1 h，分離膠 100 V 電泳 2 h)，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜90 min，封閉液中封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，其中5-羥色胺受體1、3、4亞型、p-p65抗體購買自Abcam公司、CagA抗體購買自Santa Cruz Biotechnology公司，稀釋比例均為1∶1 000，GAPDH抗體購買自全式金生物技術有限公司，稀釋比例為1∶5 000，二抗室溫孵育2 h，其中鼠二抗、兔二抗均購買自中杉金橋生物技術公司，稀釋比例:鼠二抗1∶5 000，兔二抗 1∶10 000。ECL化學顯色，置于曝光機曝光。采用Image J軟件測蛋白表達的灰度值，再應用GraphPad Pism 7.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學分析 兩樣本之間比較采用獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 7軟件進行統(tǒng)計并作圖，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5-HTR3在正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達 5-HTR3亞細胞定位主要表達于細胞質(zhì)內(nèi)，免疫組化結果顯示，與正常胃黏膜組織相比，F(xiàn)D-Hp+CagA+胃黏膜組織的5-HTR3表達水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.539，P=0.0206，結果見圖1 A～C)。

A：免疫組化法檢測 5-HTR3 在人正常胃黏膜組織中的蛋白表達；B：免疫組化法檢測 5-HTR3 在FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達； C：5-HTR3 蛋白在人正常胃黏膜組織及FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達比較的柱狀圖；*：FD-Hp+CagA+胃黏膜組織與正常胃黏膜組織比較，P<0.05。圖1 免疫組化法檢測5-HTR3在正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達

2.2 5-HTR4在正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達 5-HTR4亞細胞定位主要表達于細胞質(zhì)內(nèi)，與正常胃粘組織相比，F(xiàn)D-Hp+CagA+胃黏膜組織的5-HTR4表達水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.488，P=0.0223，結果見圖2 A～C)。

A：免疫組化檢測 5-HTR4 在人正常胃黏膜組織中的蛋白表達；B：免疫組化檢測 5-HTR4 在FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達；C：5-HTR4 蛋白在人正常胃黏膜組織及FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達比較的柱狀圖；*：FD-Hp+CagA+胃黏膜組織與正常胃黏膜組織比較，P<0.05。圖2 免疫組化法檢測5-HTR4在正常胃黏膜組織、FD-Hp CagA陽性胃黏膜組織中的表達

2.3 磷酸化的NF-kB(p-p65)在正常胃粘組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達 p-p65主要表達于細胞核內(nèi)，與正常胃黏膜組織相比，F(xiàn)D-Hp+CagA+胃黏膜組織中p-p65表達水平明顯上調(diào)，(t=4.340，P=0.0007，結果見圖3 A～C)。

A：免疫組化檢測p-p65 在人正常胃黏膜組織中的蛋白表達；B：免疫組化檢測p-p65在FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達；C：p-p65 蛋白在人正常胃黏膜組織及FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的蛋白表達比較的柱狀圖；**：與正常胃黏膜組織比較，P<0.01。圖3 p-p65在正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜中組織的表達蛋白

2.4 Western blot法檢測5-HTR3、5-HTR4、p-p65蛋白在正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達 Western blot結果顯示，與正常胃黏膜組織相比，5-HTR3蛋白在FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.748，P=0.0117，結果見圖4 A)；與正常胃黏膜組織相比，5-HTR4蛋白在FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.340，P=0.0374，結果見圖4 B)；與正常胃黏膜組織相比，p-p65蛋白在FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.446，P=0.0055，結果見圖4 C)。

A：5-HTR3蛋白在人正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達B：5-HTR4蛋白在人正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達；C： p-p65蛋白在人正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達； * 、**：與對照組比較，P<0.05，P<0.01。圖4 Western blot法檢測5-HTR3、5-HTR4、p-p65在正常胃黏膜組織、FD-Hp+CagA+胃黏膜組織中的表達水平

3 討論

功能性消化不良嚴重影響患者的工作和生活，隨著社會的發(fā)展以及人民生活質(zhì)量的提高，F(xiàn)D的治療更是刻不容緩。在引起FD消化道癥狀的眾多因素中，Hp感染是否在其中發(fā)生重要作用，近年來備受關注。大量的人群調(diào)查研究顯示,大部分的FD患者同時感染Hp[12]，對Hp陽性FD患者進行根除Hp治療有助于FD癥狀的改善，但相關機制鮮有報道。本研究不僅是對Hp導致FD機制的重要補充，更為臨床治療FD提出新的治療方向及靶點。

前期實驗研究發(fā)現(xiàn)與Hp感染的無癥狀患者相比，Hp感染的功能性消化不良患者胃黏膜的CagA陽性率明顯增高，提示Hp感染后可能通過CagA影響FD患者癥狀的發(fā)生及疾病發(fā)展。有研究證實Hp感染后能引起體內(nèi)5-羥色胺水平的變化[8]，但相關機制尚不明確。亦有臨床研究發(fā)現(xiàn)FD患者胃黏膜5-羥色胺和5-羥色胺受體的mRNA的表達較正常人明顯增加，因此認為FD患者胃動力的改變與此相關[5]。實驗證實CagA陽性胃黏膜組織中5-HTR3、5-HTR4的表達較正常胃黏膜明顯增高，提示5-HTR3、5-HTR4介導了Hp感染的功能性消化不良患者的消化道癥狀的發(fā)生。NF-kB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，其在胃炎、胃癌發(fā)展及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中有至關重要的作用[10]。本研究實驗也證實了CagA陽性胃黏膜組織中磷酸化NF-kB的表達較正常胃黏膜明顯增高，在細胞實驗中也驗證了此現(xiàn)象，提示在胃黏膜中NF-kB參與了Hp感染的功能性消化不良患者的消化道癥狀的調(diào)控。

綜上所述，Hp釋放的CagA侵入宿主細胞后可能激活NF-kB通路影響與胃腸道功能調(diào)控相關的5-HTR3、5-HTR4的表達，從而介導FD病人的消化道相關癥狀，為臨床治療FD提出了新的治療方向及靶點。