不同采后處理對冷藏‘南豐蜜桔’角質(zhì)層形態(tài)結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成的影響

陳 晟，葛 帥，羅耀華，楊綠竹，何 雙，王蓉蓉，丁勝華,

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；

2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125；

3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）

角質(zhì)層作為植物與環(huán)境接觸的第一道外部屏障，已被證明在植物免受干旱脅迫、過度紫外線輻射、機(jī)械損傷以及微生物侵染等方面發(fā)揮重要生理作用[1]。除了保護(hù)作用外，角質(zhì)層還參與調(diào)節(jié)植物的生長，保護(hù)根的分生組織和促進(jìn)側(cè)根的發(fā)育[2]。角質(zhì)層在結(jié)構(gòu)上主要由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成，角質(zhì)是一種由羥基脂肪酸組成通過酯鍵連接的聚酯化合物[3]；蠟質(zhì)可分為表皮外蠟和內(nèi)蠟，表皮外蠟以晶體形式沉積在角質(zhì)層外表面，主要是由不同比例的烷烴、脂肪酸、酯、初級醇等脂肪族化合物組成[4-5]；而由烷烴、環(huán)氧脂肪酸、萜類、甾醇等主要化合物組成的表皮內(nèi)蠟則鑲嵌在角質(zhì)聚合物基質(zhì)中[6]。

角質(zhì)層是采后果實(shí)的質(zhì)量調(diào)控器，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及含量受采后貯藏條件因素的影響[7]。Chen等[8]比較了‘紅富士’和‘金冠’兩種蘋果在貨架期內(nèi)角質(zhì)層成分的動(dòng)態(tài)變化，證明貯藏期間烷烴對抑制蘋果采后失水具有重要作用。Wang等[9]探討了‘庫爾勒香梨’在常溫、冷藏和氣調(diào)貯藏條件下表皮蠟質(zhì)與貯藏品質(zhì)特性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)冷藏和氣調(diào)貯藏條件能通過調(diào)控果實(shí)角質(zhì)層蠟質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)和組分來延緩果實(shí)成熟和衰老。張靜等[10]發(fā)現(xiàn)‘溫州蜜柑’在貯藏期間表皮外蠟和角質(zhì)單體含量分別呈先增后降和持續(xù)下降的變化趨勢，體外實(shí)驗(yàn)表明外蠟可以促進(jìn)指狀青霉菌絲的生長，而角質(zhì)則能抑制該菌分生孢子萌發(fā)。Zhu等[11]也通過活體和離體實(shí)驗(yàn)證明，柑桔果實(shí)蠟質(zhì)均能顯著抑制指狀青霉菌落的擴(kuò)展。此外，徐呈祥等[12-13]發(fā)現(xiàn)常溫和低溫下‘貢柑’和‘砂糖桔’的理化品質(zhì)與蠟質(zhì)含量、化學(xué)組成存在密切關(guān)聯(lián)，冷藏不僅能顯著抑制果實(shí)的失重率、腐爛率及細(xì)胞質(zhì)膜相對透性的降低，還能有效保護(hù)果皮蠟質(zhì)的減少和表面微形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

柑桔是我國重要的水果之一，2020年我國柑桔年產(chǎn)量達(dá)5121.90萬噸?！县S蜜桔’是我國地方的重要名特柑桔之一，年均產(chǎn)量達(dá)150萬噸，具有皮薄核少、酸甜適口、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，但由于采后耐貯藏性差，導(dǎo)致采后損失嚴(yán)重[14-15]。多種環(huán)保便捷的采后保鮮手段被應(yīng)用到柑桔采后商品化處理，且多集中在采后貯藏品質(zhì)特性評價(jià)和微生物防控等方面。如熱激（heat shock，HT）被證明能降低柑桔果實(shí)呼吸強(qiáng)度和丙二醛含量，提高防御酶活性，進(jìn)而延長采后貯藏期[16]；殼聚糖（chitosan，CS）可在柑桔果實(shí)表面形成透明薄膜，能夠降低果實(shí)呼吸強(qiáng)度、減少水分蒸騰和抵御微生物侵染[17]；熱激和殼聚糖聯(lián)合處理也被證明可于防控茂谷柑采后綠霉病[18]。然而，目前這些柑桔保鮮研究鮮有報(bào)道果實(shí)角質(zhì)層的變化，且采后處理如何影響角質(zhì)層形態(tài)結(jié)構(gòu)及其化學(xué)組成尚不明晰。因此，本研究以‘南豐蜜桔’為研究對象，采用熱激、殼聚糖以及熱激聯(lián)合殼聚糖處理3種保鮮方式，設(shè)置對照組對比探究4 ℃冷藏過程中不同處理對‘南豐蜜桔’角質(zhì)層形態(tài)結(jié)構(gòu)及其化學(xué)組成的影響，旨在揭示角質(zhì)層的演變規(guī)律，以期為‘南豐蜜桔’的貯藏保鮮提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南豐蜜桔 選取成熟期的‘南豐蜜桔’ ，于2020年11月采自湖南省郴州市臨武縣蓮塘村果園，果實(shí)采后立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室冷庫在（4±0.5） ℃下預(yù)冷24 h。挑選果形端正、大小勻稱、表面顏色相近、外觀完整無損傷的‘南豐蜜桔’，用干布擦凈后隨機(jī)分為4組備用；殼聚糖（食品級） 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；三氯甲烷、乙酸、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）、正二十四烷（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；14%三氟化硼甲醇溶液 德國CNW 公司；N,O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamid, BSTFA） Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；纖維素酶（≥400 U/mg）、半纖維素酶（≥2 U/mg）、果膠酶（≥500 U/mg） 上海瑞永生物科技有限公司。

LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 安捷倫科技有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；EDT-2000型離子濺射儀、EVO/LS10型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）德國Zeiss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 挑選1200個(gè)新鮮‘南豐蜜桔’均分為對照組（CK）、熱激組（HT）、殼聚糖組（CS）和熱激聯(lián)合殼聚糖組（HT+CS），每組300個(gè)果實(shí)。對照組：新鮮蜜桔未經(jīng)任何處理；熱激組：蜜桔在52 ℃水中完全浸泡3 min，在約20 ℃室溫下瀝干冷卻[19]；殼聚糖組：將蜜桔在1%的殼聚糖（W/V）中完全浸泡1 min，后于室溫風(fēng)干至果實(shí)表面不粘手[20]；熱激聯(lián)合殼聚糖組：先將蜜桔在52 ℃水中完全浸泡3 min，在約20 ℃室溫下瀝干冷卻，再將其放入1%的殼聚糖（W/V）中完全浸泡1 min，于室溫風(fēng)干至果實(shí)表面不粘手。4個(gè)處理完成后，全部分裝于穿孔塑封袋中，每袋 30 個(gè)果實(shí)，平鋪放置在（4±0.5） ℃，相對濕度為85%～90%的冷庫中貯藏，在冷藏的第 0、15、30、45、75 d取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 果皮表面外蠟形態(tài)結(jié)構(gòu)的SEM觀察 每個(gè)處理分別取6個(gè)果面光潔、大小色澤均一的果實(shí)，用打孔器在表皮赤道部位取樣，將果皮薄片冷凍干燥后用 EDT-2000型離子濺射儀（2×10-4MPa, 25 mA，300 s）鍍金膜，最后用EVO/LS10 SEM觀察拍片。

1.2.3 果皮蠟質(zhì)成分的提取和檢測 每個(gè)處理分別選取18個(gè)果實(shí)，一組重復(fù)6個(gè)果實(shí)，共3次重復(fù)。參考Liu等[21]的方法先后提取表皮外蠟和內(nèi)蠟。提取外蠟時(shí)，用阿拉伯膠（1 g/mL）在果實(shí)表面涂抹均勻，室溫風(fēng)干后收集阿拉伯膠層，重復(fù)2次。用蒸餾水溶解所得的阿拉伯膠，并在室溫下用3倍體積的三氯甲烷萃取3次，收集合并所得的有機(jī)相即為外蠟溶液，并用有機(jī)濾膜（0.22 μm）過濾，于30 ℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮出有機(jī)溶劑后貯藏于-20 ℃待測。去除外蠟的果實(shí)在三氯甲烷中完全浸泡1 min得到內(nèi)蠟溶液，重復(fù)2次，合并所得內(nèi)蠟溶液于30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后貯藏于-20 ℃待測。

果實(shí)表皮蠟質(zhì)成分測定：旋干的蠟質(zhì)樣品復(fù)溶在5 mL三氯甲烷中，有機(jī)濾膜（0.22 μm）過濾后，在樣品中加入 40 μL 的內(nèi)標(biāo)正二十四烷（0.125 μg/μL）和等體積的衍生試劑 BSTFA（含 1%TMCS），在70 ℃的烘箱中衍生40 min，用于GC-MS分析。色譜條件：色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度 280 ℃，質(zhì)譜源溫度 230 ℃，流量 2 mL/min；Aux-2 溫度 280 ℃，載氣為氦氣，無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件：電子轟電離方式，能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～600 u，全掃描方式，溶劑延遲7 min。升溫程序：70 ℃保持1 min，以3 ℃/min升溫至 200 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升溫至300 ℃，保持 5 min，最后以20 ℃/min升溫至320 ℃，保持2 min。各種蠟質(zhì)成分經(jīng)GC-MS檢測后依據(jù)質(zhì)譜庫進(jìn)行定性，并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，蠟質(zhì)含量以μg/cm2表示。

1.2.4 果皮角質(zhì)單體的提取和檢測 果皮角質(zhì)單體的提取參考Wang等[22]的方法。用打孔器（內(nèi)徑=1.5 cm）在去蠟后的果實(shí)赤道部位均勻打8個(gè)孔，收集果皮圓片加入混合酶液（0.5 g/L纖維素酶、0.5 g/L半纖維素酶、0.2 g/L果膠酶）進(jìn)行酶解，隔天換1次酶液，酶解至圓片表面無碎片物質(zhì)釋出。收集酶解后的角質(zhì)膜層37 ℃烘干至恒重。取20.0 mg質(zhì)膜層浸泡在14%三氟化硼甲醇溶液中于70 ℃的烘箱中轉(zhuǎn)酯解聚16 h，然后冷卻、過濾，加入3倍體積的飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應(yīng)，再用三氯甲烷萃取3次。合并3次的萃取液，用無水硫酸鈉干燥，最后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮出有機(jī)溶液，-20 ℃保存待測。

果皮角質(zhì)單體成分測定：前處理和色譜的條件與蠟質(zhì)層組分分析一致。質(zhì)譜條件為：電子轟電離方式，能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～600 u，全掃描方式，溶劑延遲7 min。升溫程序：70 ℃保持1 min，以 3 ℃/min 升溫至 200 ℃，保持 2 min，再以 8 ℃/min升溫至 300 ℃，保持 5 min，最后以 10 ℃/min 升溫至310 ℃，保持1 min。角質(zhì)單體組分經(jīng)GC-MS檢測后依據(jù)質(zhì)譜庫定性，并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，用單位面積所含重量表示角質(zhì)單體的含量（μg/cm2）。

1.2.5 果實(shí)表面積測定 ‘南豐蜜桔’的表面積按下式計(jì)算：

式中：X表示每個(gè)平行處理果皮的總質(zhì)量，g；D和Y分別表示為在每個(gè)平行處理中用打孔器（內(nèi)徑=1.5 cm）獲得的48個(gè)小圓片的面積，cm2和質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Excel 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)結(jié)果；借助 SPSS 26.0 進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan 檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為P＜0.05；運(yùn)用 GraphPad繪制角質(zhì)層含量圖，Origin 2019 繪制角質(zhì)層比例圖，Origin Pro 2021b Heat Map with Dendrogram 繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏過程中‘南豐蜜桔’表皮外蠟形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

‘南豐蜜桔’冷藏過程中外觀顏色變化如圖1右上角所示。冷藏15 d時(shí)，所有處理組果實(shí)表皮顏色無明顯變化。冷藏30 d時(shí)，CK組果實(shí)基本轉(zhuǎn)為全黃，而其他處理組果實(shí)果皮還保留部分青綠色。冷藏45 d開始，保鮮處理組果實(shí)顏色轉(zhuǎn)黃，至75 d時(shí)CK組出現(xiàn)明顯黑斑，HT組和HT+CS組果實(shí)表面也伴有泛黑現(xiàn)象，推測為熱激產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，而CS組果實(shí)外觀在冷藏期間未出現(xiàn)黑斑，色澤均勻明亮。

‘南豐蜜桔’經(jīng)不同處理后，各處理的果實(shí)表皮外蠟形態(tài)結(jié)構(gòu)已發(fā)生變化，用淺藍(lán)色箭頭在圖1中標(biāo)出了外蠟晶體的位置。0 d時(shí)，CK組果皮外蠟層分布了大量的蠟質(zhì)晶體，為不規(guī)則血小板狀，與報(bào)道的柑桔表皮蠟質(zhì)晶體形狀一致，還能觀察到皮孔的存在[23]；CS組和HT+CS組表面被殼聚糖膜覆蓋，可見明顯的蠟質(zhì)晶體輪廓；HT組蠟質(zhì)層較為光滑平整，無明顯的外蠟晶體分布。隨著冷藏時(shí)間的延長，表皮外蠟在不同處理中呈現(xiàn)不同的變化趨勢（圖1）。冷藏0～45 d時(shí)，CK組的果皮外蠟晶體數(shù)量呈先減后增的趨勢，且出現(xiàn)明顯裂紋；CS組和HT+CS組果皮外蠟晶體數(shù)量持續(xù)減少，逐漸趨于光滑平整。直到75 d時(shí)，觀察到4個(gè)處理的果皮表面均無明顯外蠟晶體。從不同處理間的差異分析，同時(shí)期CK組的外蠟晶體數(shù)量比其他組更多，表面也更為粗糙。前人[24]研究表明熱激能使果實(shí)外蠟晶體結(jié)構(gòu)特征消失，本研究發(fā)現(xiàn)HT組果實(shí)表皮在冷藏期間基本保持光滑平整狀態(tài)，推測52 ℃的熱激處理導(dǎo)致表皮外蠟熔融重分布形成更光滑的表皮外觀。涂膜處理的CS組和HT+CS組，冷藏開始后表皮蠟層完好無損，均被致密完整的聚合膜覆蓋。Xu等[25]也發(fā)現(xiàn)殼聚糖涂膜處理對果實(shí)表皮外蠟可起到有效的防護(hù)。所有處理在貯藏結(jié)束時(shí)均形成了較完整的表皮表面。表皮蠟質(zhì)作為‘南豐蜜桔’最外層的保護(hù)屏障，較完整的蠟質(zhì)層和較少的裂縫助于阻止水分散失并有效地抵御外界微生物侵染，進(jìn)而維持果實(shí)品質(zhì)[26]。

圖1 冷藏過程中‘南豐蜜桔’外觀及表皮外蠟形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（400×）Fig.1 Changes in appearance and epicuticular wax crystal structure of 'Nanfeng' mandarins during cold storage (400×)

2.2 ‘南豐蜜桔’表皮蠟質(zhì)組分及含量變化

2.2.1 ‘南豐蜜桔’表皮外蠟組分及含量變化 不同處理對冷藏‘南豐蜜桔’表皮外蠟主要化學(xué)組成及含量的影響如表1所示。主要檢出烷烴、酸類、酯類及萜類4類化學(xué)成分，包括16種烷烴、14種酸、3種酯、3種萜和2種醇共38種成分。烷烴種類在外蠟成分中最為豐富，其被認(rèn)為是形成柑桔表皮血小板狀蠟質(zhì)晶體的必需物質(zhì)[27]。王敏力等[28]也在‘南豐蜜桔’中檢出了烷烴、脂肪酸和醇類物質(zhì)，本研究多檢出的酯類可能是由于栽培環(huán)境或采后貯藏方式的不同所導(dǎo)致。所有處理的各個(gè)冷藏階段均被檢出的成分包括十一烷烴、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、十八烷酸、脫氫樅酸、28-Nor-17.α.（H）-霍烷、豆甾醇和β-谷甾醇。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)十六烷酸是‘紐荷爾’臍橙發(fā)育期間外蠟組分中的主要脂肪酸，其次是十八烷酸。本研究檢出的外蠟成分中十六烷酸含量同樣最高，各處理在15、45和75 d存在顯著差異（P＜0.05）。冷藏0 d時(shí)，HT組十六烷酸含量最高為2.62 μg/cm2，比最低的CK組高24.76%；至75 d發(fā)生了顯著變化（P＜0.05），HT 組降為最低的 1.77 μg/cm2，比含量最高的CK組低29.48%。在十八烷酸的變化中，HT組含量在冷藏結(jié)束為1.20 μg/cm2，相比開始時(shí)下降了32.58%。而CK組含量在30～75 d從最低升到最高，推測CK組未做任何保鮮處理，到了冷藏后期合成更多的酸類成分來對抗逆境以維持果體自身狀態(tài)，因?yàn)橹舅岜蛔C明具有潛在的抗真菌特性[30]。

表1 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程表皮外蠟主要成分含量的影響Table 1 Effects of different treatments on content of the main components in epicuticular wax of 'Nanfeng' mandarin during cold storage

續(xù)表 1

圖2展示了不同處理果實(shí)表皮的外蠟總含量變化。冷藏15～45 d，CK 組含量從10.12 μg/cm2下降到5.88 μg/cm2，HT 組從 6.25 μg/cm2上升到 8.19 μg/cm2，而CS和HT+CS組含量隨時(shí)間變化差異較小。冷藏45 d時(shí)，3種保鮮方式均能有效延緩?fù)庀灪康慕档?，其中熱激效果最為明顯。外蠟含量不僅隨著冷藏時(shí)間產(chǎn)生變化，也在不同處理間存在差異。除第45 d外，CK組冷藏過程中的外蠟含量均比同期處理組更高，這與圖1表皮外蠟形態(tài)結(jié)構(gòu)現(xiàn)象一致，因?yàn)橛^察到CK組表皮外蠟晶體數(shù)量也比同期其他處理組更多。反之，HT組在冷藏過程中，總體來看其外蠟總量相比同期其他處理組更低，也與圖1展現(xiàn)的表面光滑無外蠟晶體的現(xiàn)象相佐證。

圖2 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮外蠟組分含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on the content of epicuticular wax components of 'Nanfeng' mandarins during cold storage

冷藏‘南豐蜜桔’表皮外蠟4類主要成分的含量和比例變化分別如圖2和圖3所示。從整體上看酸類含量最為豐富且變化較大，第15 d的CK組含量最高為7.25 μg/cm2，是第45 d的2.30倍。酸類所占比例均在50%以上，CK組和CS組的變化趨勢為先降后升，HT組表現(xiàn)為持續(xù)下降，而HT+CS組則為上升下降交替變化。王敏力[28]也發(fā)現(xiàn)脂肪酸是不同柑桔中最豐富的蠟質(zhì)成分，其中‘南豐蜜桔’脂肪酸占比最大達(dá)到69.47%。各處理的烷烴整體含量從冷藏開始到后期表現(xiàn)為上升趨勢，尤其是HT+CS組，從0.24 μg/cm2增至 1.32 μg/cm2，增長了 4.50 倍。其在不同處理中所占比例也呈現(xiàn)上升的現(xiàn)象（圖3）?！县S蜜桔’隨冷藏時(shí)間延長失水率變大，為抑制果實(shí)失水烷烴含量也隨之升高，表明蠟質(zhì)中烷烴組分在抑制果實(shí)采后失水方面發(fā)揮重要作用，這與前人報(bào)道一致[8,31]。外蠟中萜類的含量在不同處理間無顯著變化。Trivedi等[32]發(fā)現(xiàn)越橘在發(fā)育過程中，三萜類比例隨著脂肪族化合物比例升高而降低。所有處理組的萜類比例降低的同時(shí)，也伴隨著其他3類成分占比的升高的現(xiàn)象，這可能是由于萜類化合物一般在角質(zhì)層內(nèi)蠟中被檢測到，而在外蠟晶體的形成中其作用還尚不明晰。此外，有研究者[33]報(bào)道了酯類的積累會影響蘋果表皮的油膩化程度。但酯類在柑桔蠟質(zhì)中的作用未見報(bào)道，推測可能與柑桔揮發(fā)性香氣有關(guān)，因?yàn)楣麑?shí)采后成熟衰老的過程伴有表皮香氣成分的變化[34]。本研究中CK組前期含量遠(yuǎn)高于其他組，而保鮮處理組含量后期增長較大，可能是經(jīng)熱激和殼聚糖處理后的果實(shí)響應(yīng)較慢的緣故。

圖3 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮外蠟各組分比例Fig.3 Proportion of epicuticular wax components of 'Nanfeng'mandarins from different treatments during cold storage

2.2.2 ‘南豐蜜桔’表皮內(nèi)蠟組分及含量變化 ‘南豐蜜桔’去除外蠟后制得內(nèi)蠟，不同處理對表皮內(nèi)蠟主要化學(xué)組成及含量的影響如表2所示。表皮內(nèi)蠟同樣檢出烷烴、酸類、酯類及萜類4類主要化學(xué)成分，包括19種烷烴、16種酸、8種酯、5種萜、2種醇共50種成分，比外蠟要多12種。其中，所有處理組不同冷藏期果實(shí)都能檢出12種內(nèi)蠟組分，含量最多的內(nèi)蠟成分仍然是十六烷酸。特別注意的是，與果實(shí)外蠟萜類成分相比，內(nèi)蠟還檢出了角鯊烯、菜油甾醇和β-香樹精3種萜類物質(zhì)，可能是由于三萜類物質(zhì)呈環(huán)狀二維結(jié)構(gòu)多填充于聚酯結(jié)構(gòu)的角質(zhì)中，因此在內(nèi)蠟中相對較多而外蠟中相對較少[35]。前人在探究‘溫州蜜柑’和‘冰糖橙’貯藏中的角質(zhì)層組分差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蠟?zāi)茱@著抑制指狀青霉菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)[10,36]，其中萜類物質(zhì)起到關(guān)鍵作用。角鯊烯也被證明可參與清除自由基和提高氧負(fù)荷[37]。本研究發(fā)現(xiàn)角鯊烯成分僅在 CK組第15 d和HT組第0、15、45 d檢測到，推測HT處理能更好地保持果實(shí)品質(zhì)。

圖4展示了檢出的表皮內(nèi)蠟總量的變化，所有處理的內(nèi)蠟總量整體趨勢為先減后增。在冷藏15～75 d，各處理之間的含量變化差異明顯。這期間HT組和HT+CS組保持較高的含量，而CK組和CS組在冷藏過程中都保持著先減后增的變化趨勢。冷藏45 d時(shí)3種保鮮方式均能有效抑制外蠟和內(nèi)蠟含量的降低，其中熱激效果最為明顯。整個(gè)冷藏階段含量最高的是第75 d的 CK組，達(dá)到5.46 μg/cm2，最低為第30 d的CS組為1.91 μg/cm2。4類主要成分的含量和比例變化與外蠟相比有所不同。酸類同樣是表皮內(nèi)蠟中含量最高的成分（圖4）。在酸類的變化中，第15 d HT組含量最高為3.44 μg/cm2，是同期CK組的1.88倍；HT+CS在冷藏結(jié)束時(shí)達(dá)到了3.27 μg/cm2，是同期CK組的1.60倍。Belge等[38]采用熱激和CO2沖擊處理成熟的桃果實(shí)，在0 ℃下貯藏2周后在20 ℃下貯藏5 d，發(fā)現(xiàn)熱激組的蠟質(zhì)含量和百分比都為最高。與圖3不同的是，酸類比例不再占據(jù)領(lǐng)先優(yōu)勢，烷烴和萜類占比明顯提高。分析圖4中烷烴含量的變化，發(fā)現(xiàn)冷藏過程中除30～45 d的HT+CS組和第75 d的CK和CS組外，其他時(shí)間點(diǎn)的處理組之間差異不顯著，表明表皮內(nèi)蠟對蜜桔果實(shí)保水無作用[4]。與外蠟萜類相反的是內(nèi)蠟萜類含量隨貯藏時(shí)間延長而逐漸升高，尤其到了冷藏第75 d，CS組和CK組含量達(dá)到最高的1.35和1.23 μg/cm2，分別是冷藏前的 2.08倍和 2.17倍，可能是冷藏后期為了合成更多的萜類成分以抵御微生物的侵染。針對表皮內(nèi)蠟各組分的比例變化（圖5），觀察發(fā)現(xiàn)CK組、HT組及CS組3個(gè)處理組中的萜類比例存在相同的變化趨勢，均為先增后減，而HT+CS組在酯類和萜類中占比分別為持續(xù)下降和持續(xù)上升。所有處理的酸類比例在冷藏中的趨勢一致，為“上升-下降-上升”，所有處理的烷烴比例在冷藏前期也均存在先減后增的現(xiàn)象，表明貯藏期間果實(shí)角質(zhì)層的成分代謝處于動(dòng)態(tài)變化之中。

圖5 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮內(nèi)蠟各組分比例Fig.5 Proportion of intracuticular wax components of 'Nanfeng' mandarins from different treatments during cold storage

續(xù)表 2

2.3 ‘南豐蜜桔’表皮角質(zhì)組分及含量變化

表3列出了不同處理的表皮角質(zhì)單體組成及含量變化?！县S蜜桔’果實(shí)角質(zhì)單體共檢出7種，分別為1,4苯二甲酸、十六烷酸、十八烷酸、辛酸、壬酸、α-亞麻酸、亞油酸。不同處理組檢出的角質(zhì)單體數(shù)量有所不同，CK組共檢出4種，HT組和CS組共檢出5種，而7種角質(zhì)單體均能在HT+CS組檢出。冷藏第45 d，CK組角質(zhì)單體僅為十六烷酸，CS組和HT+CS組角質(zhì)單體種類均減少到2種，冷藏結(jié)束時(shí)檢出種類又增多；而HT組檢出的種類在第45 d增多到4種，75 d時(shí)減少到2種。Riikka等[39]發(fā)現(xiàn)漿果角質(zhì)單體主要物質(zhì)是含有官能團(tuán)的C16和C18羥基酸。Marga等[40]發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層的機(jī)械性能受C16單體含量的影響，其含量越高表皮韌性越強(qiáng)。隨著冷藏時(shí)間的延長，各處理組的十六烷酸含量逐漸減少，因此‘南豐蜜桔’果實(shí)表皮也逐漸變軟。十六烷酸是唯一在所有處理不同時(shí)間點(diǎn)都能檢出的成分，發(fā)現(xiàn)冷藏15～45 d，CK組的含量較其他處理組更低，但冷藏結(jié)束時(shí)又有所回升，推測是由于逆境脅迫而合成了比其他處理更高的含量，以抵御采后病原菌的侵染[41]。不同處理檢出的表皮角質(zhì)單體總量如圖6所示。冷藏30～45 d，各處理之間存在顯著差異（P＜0.05）。冷藏期間HT組角質(zhì)單體總量始終高于其他處理組，最高為冷藏開始的2.73 μg/cm2；而CK組則與之相反，在冷藏 0～45 d 從 2.00 μg/cm2顯著下降到 0.38 μg/cm2（P＜0.05），第 75 d 回升到 0.50 μg/cm2。分析不同處理檢出的角質(zhì)單體的比例變化（圖7），發(fā)現(xiàn)十六烷酸是冷藏45～75 d的主要角質(zhì)單體，各處理中所占比例均超過50%。圖6中，CK組因未做任何保鮮處理在冷藏過程中角質(zhì)單體含量較其他處理組更少，而HT組、CS組和HT+CS組明顯含量更高，尤其是HT組，表明熱激可以抑制角質(zhì)單體含量的下降，具有更優(yōu)的保鮮優(yōu)勢。

圖6 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮角質(zhì)單體總量的影響Fig.6 Effects of different treatments on the total amount of epidermal cutin monomer of 'Nanfeng' mandarins during cold storage

圖7 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮角質(zhì)單體組分比例Fig.7 Proportion of epidermal cutin monomer of 'Nanfeng' mandarins from different treatments during cold storage

表3 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程表皮角質(zhì)單體含量的影響Table 3 Effects of different treatments on compositions in epidermal cutin monomer of 'Nanfeng' mandarins during cold storage

續(xù)表 3

2.4 ‘南豐蜜桔’表皮角質(zhì)層組分的聚類分析

采用Ward最小方差和歐式距離法對檢出的角質(zhì)層組分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果以熱圖形式顯示在圖8。圖例表示紅色越深值越大，物質(zhì)含量就越高；而藍(lán)色越深值越低，含量則越低。左邊是樣品的聚集區(qū)，上邊是角質(zhì)層成分的聚集區(qū)。左邊分支和上邊分支軸歐式距離越長，相關(guān)性就越弱。如紅線所示樣本可以大致分為三大類，為0 d、15～75 d以及CK組第75 d三個(gè)貯藏階段。進(jìn)一步細(xì)分為6類，同一類的樣本之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。0 d樣本進(jìn)一步分為CK組和其他處理組，表明果實(shí)經(jīng)不同處理后，在冷藏開始時(shí)就已經(jīng)有了成分代謝的響應(yīng)變化。分類Ⅲ都是15 d樣品。而30 d和45 d的樣本被歸為Ⅳ類，說明該時(shí)期各處理之間差異較小，熱圖也由大面積紅色轉(zhuǎn)為臨界色，含量明顯下降。值得注意的是，HT+CS組第45 d和其他組75 d樣本被分到了Ⅴ類，該類樣本含量顯著升高，說明HT+CS組后期合成角質(zhì)層成分較其他組更快。而CK組的第75 d樣品紅色區(qū)域較多較深單獨(dú)歸為一類，和前期分析一致，可能是由于冷藏后期CK組以抵御微生物侵染而提前合成更多的角質(zhì)層成分。表皮外蠟、內(nèi)蠟和角質(zhì)單體的聚集可分為3類。幾乎所有的第一類物質(zhì)都是內(nèi)蠟組分，第二類物質(zhì)也幾乎是外蠟組分，第三類則幾乎包括內(nèi)蠟和絕大多數(shù)的角質(zhì)單體組分，表明外蠟、內(nèi)蠟以及角質(zhì)成分之間存在聚類差異。隨著冷藏時(shí)間的延長，Ⅰ類物質(zhì)含量總體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，與圖4內(nèi)蠟總量變化一致；II類物質(zhì)顏色差異較小，冷藏前后含量變化不明顯，也與圖2外蠟總量無明顯變化規(guī)律相吻合；最后一類物質(zhì)貯藏前后期顏色變化顯著，整體上物質(zhì)含量隨著貯藏時(shí)間延長而降低。

圖8 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中角質(zhì)層組分的熱圖和聚類分析Fig.8 Heatmap and clustering of cuticle components of 'Nanfeng' mandarins from different treatments during cold storage

3 結(jié)論

角質(zhì)層對果實(shí)采后貯藏保鮮至關(guān)重要，本研究采用不同保鮮方式（熱激、殼聚糖、熱激聯(lián)合殼聚糖）處理新鮮‘南豐蜜桔’，探究了其外蠟晶體結(jié)構(gòu)和角質(zhì)層成分代謝的變化規(guī)律。‘南豐蜜桔’外蠟晶體為不規(guī)則的血小板狀，熱激能使外蠟熔融重分布產(chǎn)生更光滑的表皮外觀，外蠟晶體隨著冷藏時(shí)間的延長而逐漸消失。GC-MS分析表明，外蠟一共檢出38種成分，包括16種烷烴、14種酸、3種酯、3種萜和2種醇，內(nèi)蠟共檢出50種化學(xué)成分，包括19種烷烴、16種酸、8種酯、5種萜、2種醇。蠟質(zhì)的主要成分均為烷烴、酸類、酯類和萜類，其中酸類含量最為豐富。不管是蠟質(zhì)還是角質(zhì)，十六烷酸都是最主要的組分。外蠟含量整體上無明顯的變化規(guī)律，內(nèi)蠟含量則隨時(shí)間延長呈先減后增的變化趨勢，冷藏45 d時(shí)3種保鮮方式均能有效延緩?fù)庀灪蛢?nèi)蠟含量的下降，其中熱激處理的效果最為明顯。角質(zhì)單體主要檢出1,4苯二甲酸、十六烷酸、十八烷酸、辛酸、壬酸、α-亞麻酸、亞油酸7種成分。角質(zhì)單體含量隨貯藏時(shí)間延長而下降，3種保鮮方式都能明顯抑制其含量的降低，其中以熱激處理的效果最為顯著。綜上所述，熱激作為一種有效的保鮮方式，可通過改變柑桔果實(shí)外蠟晶體的結(jié)構(gòu)，以及調(diào)控角質(zhì)層的代謝變化來保持采后貯藏品質(zhì)。這些結(jié)果對開發(fā)‘南豐蜜桔’的綠色保鮮方法提供了新視角。