羧甲基纖維素鈉/聚乙烯吡咯烷酮與獨活提取物復(fù)合涂膜對柑橘果實的保鮮效果

張博云，張 宇，李慶山，高雪峰，李 嬌，寇俊杰，徐鳳波

（南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，元素有機(jī)化學(xué)國家重點實驗室，天津 300071）

柑橘類水果因其口感好、營養(yǎng)價值高而在全世界廣泛種植[1]。但在貯藏過程中，柑橘果實容易發(fā)生采后真菌病害，導(dǎo)致果實質(zhì)量大幅下降和主要營養(yǎng)成分的流失，降低其市場價值[2-3]。因此研究新型、高效、安全的保鮮技術(shù)對柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[4]。當(dāng)前，對柑橘類水果保鮮劑的研究主要集中在化學(xué)保鮮和生物保鮮兩方面[5-6]。為了抑制柑橘果實采后真菌病害的發(fā)生，化學(xué)殺菌劑在過去幾十年里一直都是研究的重點，比如抑霉唑和咪鮮胺等，使綠霉菌、炭疽病菌、酸腐病菌等病害得到有效控制。但是化學(xué)農(nóng)藥在一定程度上會造成環(huán)境的污染，對人類健康產(chǎn)生危害[7]。因此，尋找安全、高效、無害的保鮮方法一直是科研人員主要的研究方向。

復(fù)合涂膜材料可以在果實表面形成一層具有選擇透過性薄膜，不僅可以有效防止水分的散失，調(diào)節(jié)果實呼吸作用，減緩有機(jī)物的損耗，延緩果實衰老，還可以對果皮起到保護(hù)作用，減少運(yùn)輸過程的機(jī)械損傷，阻止微生物的入侵，降低腐爛風(fēng)險[8-10]。羧甲基纖維素鈉 （Carboxymethyl cellulose sodium，CMC）具有良好的成膜性，且來源豐富，成本較低，無毒無害，易于降解，現(xiàn)在被廣泛用于食品保鮮領(lǐng)域[11]。聚乙烯吡咯烷酮 （Polyvinyl pyrrolidone,PVP），是一種非離子型高分子化合物，具有極低的毒性、良好的成膜性能等特點，但作為涂膜材料用于果蔬保鮮領(lǐng)域的研究還較少[12]。二者配合使用可以彌補(bǔ)羧甲基纖維素鈉機(jī)械性能差和聚乙烯吡咯烷酮阻水性能差的缺陷，制備的復(fù)合涂膜具有良好的機(jī)械性能并可以有效減少果實水分散失。本課題組前期通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)二者配合使用且總濃度為1%（其中CMC占比為50%～90%，PVP占比為50%～10%）時效果最佳。但僅單獨使用涂膜材料，其自身抑菌能力和抗氧化能力較弱，無法達(dá)到很好的保鮮效果。如將植物源抑菌成分、生長調(diào)節(jié)劑等[13-15]與涂膜材料復(fù)配形成既具有良好成膜性又具有良好抑菌、抗氧化性能的復(fù)合涂膜材料，其保鮮效果將大大增強(qiáng)[16]。

獨活的干燥根是一種傳統(tǒng)的中草藥，常作為治療風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛的藥物。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，獨活提取物（Heracleum hemsleyanumDiels extract，HHDE）對柑橘采后主要致病菌青霉菌、酸腐病菌、炭疽病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，對青霉病原菌和酸腐病原菌的EC50分別為219和422 mg/kg，對炭疽病原菌的抑制效果與陽性對照咪鮮胺的效果相當(dāng)，可以作為抑菌成分用于柑橘采后保鮮。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）是一種氨基酸，在生物體中廣泛存在[11]。LI等[17]試驗發(fā)現(xiàn)，外源的γ-氨基丁酸處理“南國梨”果實，可以顯著提高其抗氧化能力，延緩果皮褐變，降低其細(xì)胞器氧化程度。 SHENG[18]研究表明，外源GABA處理柑橘果實，可以誘導(dǎo)內(nèi)源GABA含量升高，保持抗氧化酶的活性，增強(qiáng)其貯藏性能，延長貯藏時間。目前，GABA已被認(rèn)為是用于果蔬采后處理，以緩解水果冷害、氧化損傷和誘導(dǎo)對病原菌的抗性的最為安全的功能因子[19]。鑒于國內(nèi)柑橘種植規(guī)模不斷擴(kuò)大以及人們對飲食安全需求的提高，開發(fā)安全高效的復(fù)合保鮮劑逐漸成為柑橘保險領(lǐng)域的一大熱點，而目前將CMC和PVP配合使用作為涂膜材料，獨活提取物作為抑菌物質(zhì)，GABA作為功能因子制備復(fù)合涂膜保鮮劑的研究還未見報道。

本研究以HHDE為抑菌劑，CMC和PVP為成膜劑，添加功能因子GABA，以及食品級的甘油、檸檬酸、苯甲酸鈉等助劑，制備出一種成膜、抑菌性能良好的復(fù)合涂膜保鮮劑。本試驗探討了主要成分HHDE、CMC/PVP、GABA的濃度對腐爛率、失重率和抗壞血酸含量的影響，并采用響應(yīng)面法（Response Surface Method, RSM）對配方進(jìn)行優(yōu)化。并研究最優(yōu)配方對柑橘采后果實品質(zhì)和生理生化指標(biāo)的影響，以期開發(fā)一款新型的高效、安全的保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

贛南臍橙（Citrus sinensisOsb.var.brasliliensisTanaka） 采自江西贛州的一個商業(yè)柑橘種植園。收獲當(dāng)天快遞運(yùn)輸至南開大學(xué)有機(jī)化學(xué)實驗室。預(yù)冷3 h后，挑選表面無損傷，無病蟲害，無腐爛，并且大小、成熟度均相當(dāng)?shù)墓麑?，用清水清洗，除去雜質(zhì)，自然晾干后備用；獨活藥材 河北仁心藥業(yè)有限公司，采自四川；羧甲基纖維素鈉 食品級，天津三江賽瑞達(dá)商貿(mào)有限公司；聚乙烯吡咯烷酮 食品級，北京伊諾凱科技有限公司；γ-氨基丁酸GABA 純度＞99%，北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；吐溫80、吐溫20 均為分析純，天津康科德科技有限公司；硬脂酸、甘油、檸檬酸、苯甲酸鈉 食品級，天津希恩思生化科技有限公司。

BJ-800A型中藥粉碎機(jī) 上海拜杰實驗器材有限公司；PE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 北京斯坦森科技有限公司；GY-3果實硬度計 上海高致精密儀器有限公司；TD2862手持折光儀 山東辰信機(jī)械設(shè)備有限公司；KQ-AS1500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 獨活提取物的制備 稱取獨活30 g，50 ℃烘干，粉碎，過50目篩。粉末按料液比1:10加入300 mL 95%乙醇，80 ℃回流2 h，得到濾液1。之后再加入300 mL 95%乙醇，80 ℃回流2 h，得到濾液2，合并濾液并減壓濃縮得到原液。在原液中添加約10倍體積的純凈水，超聲分散均勻后，添加約等體積的石油醚萃取三次，除去低極性成分，然后在水分散液中加入等體積的乙酸乙酯萃取三次，收集乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮得到獨活提取物0.87 g，收率2.9%[20-21]。

1.2.2 復(fù)合涂膜保鮮劑的制備 復(fù)合涂膜保鮮劑的制備，參考Formiga等[22-23]的方法。

水相的制備：分別稱取一定質(zhì)量的羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、γ-氨基丁酸溶于純凈水中，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按保鮮劑總質(zhì)量100 g計算）為1%檸檬酸、0.5%苯甲酸鈉、1%甘油，不斷攪拌加熱至72 ℃，最后加入0.075%硬脂酸，攪拌均勻得到水相。

油相的制備：稱取一定質(zhì)量的獨活提取物，加入（按保鮮劑總質(zhì)量計算）5%的正丁醇作為溶劑，將體系加熱到70 ℃，持續(xù)攪拌至完全溶解，最后加入5%吐溫80和1%吐溫20作為乳化劑，攪拌均勻得到油相。

最后將水相緩慢加入油相中，持續(xù)攪拌30 min，得到復(fù)合涂膜保鮮劑。

1.2.3 果實處理 將果實在配制的各濃度保鮮液中浸果1 min，取出后自然放置1 h，待其風(fēng)干自然成膜，分組等量放入PVC材質(zhì)的保鮮袋中，隨后在一定條件的恒溫箱中進(jìn)行貯藏，定時測定相關(guān)指標(biāo)[24]。

1.2.4 復(fù)合涂膜保鮮劑配方篩選

1.2.4.1 單因素實驗 按照1.2.2的工藝條件，按保鮮劑總質(zhì)量100 g計算，固定單因素實驗條件：獨活提取物濃度為1.5%，CMC+PVP濃度為0.7%+0.3%，GABA濃度為0.75%。

以純凈水為空白對照組，分別考察獨活提取物濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、CMC/PVP濃度（0.5%/0.5%、0.6%/0.4%、0.7%/0.3%、0.8%/0.2%、0.9%/0.1%）和 GABA濃度（0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%）三因素對柑橘失重率、腐爛率、抗壞血酸含量的影響。

試驗過程中，柑橘貯藏溫度為(20±1) ℃，濕度80%±5%，每5 d檢測各組腐爛率、失重率、抗壞血酸含流失率，連續(xù)進(jìn)行25 d，每次10個樣品，重復(fù)6次。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計響應(yīng)面試驗對配方進(jìn)一步的優(yōu)化（見表1），以加權(quán)綜合指數(shù)（Y）為響應(yīng)值，確定最優(yōu)配方。試驗過程中，柑橘貯藏溫度為（20±1） ℃，濕度 80%±5%，第 25 d檢測各組腐爛率、失重率、抗壞血酸含流失率并計算加權(quán)綜合指數(shù)，每組10個樣品，重復(fù)6次。結(jié)合參考文獻(xiàn)[25]及實際情況，由于腐爛率為考察果實品質(zhì)最直觀最重要的因素，所以將其比重設(shè)置為40%，將失重率及抗壞血酸含量流失率比重分別設(shè)置為30%，得到如下計算公式（1）：

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Independent variables and their levels used for reponse surface test

1.2.5 最優(yōu)配方保鮮效果的測定 通過單因素實驗與響應(yīng)面試驗優(yōu)選了復(fù)合涂膜保鮮劑的最優(yōu)配方，并可以得出影響復(fù)合涂膜保鮮劑效果的兩個顯著因素為成膜基質(zhì)和獨活提取物，所以進(jìn)一步設(shè)計四組實驗，分析比較各組分對保鮮效果的影響：空白對照組（純凈水）；復(fù)合涂膜保鮮劑實驗組。具體制備過程如下（制備100 g）：油相的制備：稱取5 g正丁醇于小燒杯，加入2 g （2%）獨活提取物，加熱至70 ℃不斷攪拌直至完全溶解，后加入5 g吐溫80與1 g吐溫20，攪拌均勻備用。水相的制備：稱取63 g純凈水，加入 0.6 g CMC，0.4 g PVP，0.075 g硬脂酸，加熱至72 ℃攪拌至完全溶解，隨后分別加入1 gγ-氨基丁酸、1 g、0.5 g苯甲酸鈉、1 g甘油，攪拌至完全溶解備用。最后將水相緩慢加入油相中，持續(xù)攪拌30 min，得到復(fù)合涂膜保鮮劑；復(fù)合膜對照組。不加獨活提取液，其余組分配比及濃度與復(fù)合涂膜保鮮劑實驗組一致；獨活提取物對照組。不加成膜基質(zhì)，其余組分配比及濃度與復(fù)合涂膜保鮮劑實驗組一致。

按照1.2.3處理柑橘果實，為了模擬實際冷庫貯藏環(huán)境，所有柑橘均于4 ℃冷藏，相對濕度80%±5%，每10 d檢測一次各項指標(biāo)，連續(xù)80 d。測試指標(biāo)如下：

1.2.5.1 貯藏效果的測定 腐爛率的測定[25]：果實表面出現(xiàn)水漬或者霉菌菌落視為腐爛。

硬度測定：在果實中間部位剔除部分果皮露出果肉，將果實放置在平面上，手持硬度計，均勻按壓直至探頭壓至10 mm處，讀取示數(shù)，即為果實硬度（N）。每組隨機(jī)取出五個果實，每個果實重復(fù)測試3次，記錄示數(shù)，取平均值。

1.2.5.2 果實品質(zhì)的測定 從每組中隨機(jī)取出5個果實，經(jīng)破壁機(jī)破碎，低溫離心后取上清液進(jìn)行果實品質(zhì)分析。光學(xué)分析法測定果實中抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）的含量[26]；采用手持高精度折光儀測定可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）[27]；采用酸堿滴定法測定可滴定酸度（titratable acidity，TA）的含量；采用蒽酮比色法測定果實的總糖含量（total sugar content，TSC）[28]，SSC 含量每組測定十次取平均值，AsA、TA、TSC每組測定五次取平均值。

1.2.5.3 生理生化指標(biāo)的測定 根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.181-2016 測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；根據(jù) GB/T 32131-2015測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性[29]；采用修改的 Marklund 方法測定超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[30]；采用分光光度法測定β-1,3-葡聚糖酶 （β-1,3-glucanase，GUN）的活性[31]；參照曹健康[8]的方法，并作適當(dāng)修改測定苯丙氨酸解氨酶 （phynylalanine ammonia lyase，PAL）的活性。每組隨機(jī)抽取5個果實測定各項生理生化指標(biāo)，每個指標(biāo)測定三次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin 8.0、Excel （Office 2010）、Design Expert10.0等軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的處理、分析及繪制圖形；SPSS26對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，用方差分析的最小顯著性差異（LSD）進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同濃度獨活提取物對失重率、腐爛率及抗壞血酸含量的影響 柑橘的腐爛率和失重率是評價保鮮劑保鮮效果最直觀的指標(biāo)。同時柑橘果實中存在較高含量的抗壞血酸，且其含量易受果實成熟度、貯藏條件等影響，所以可以作為柑橘營養(yǎng)品質(zhì)和貯藏效果的評定指標(biāo)[32]。由圖1可以分析得出：隨著貯藏時間的延長，不同濃度獨活提取物保鮮劑處理的柑橘腐爛率和失重率整體均呈上升趨勢，而抗壞血酸的含量呈下降趨勢。由圖1a可以看出，在同一貯藏時間下，加入不同濃度獨活提取物，對柑橘的失重率沒有明顯影響。但相對于空白對照組，失重率有明顯的降低，說明配方中存在阻止果實水分蒸發(fā)的成分。由圖1b可以看出，相對于空白對照組，隨著獨活提取物濃度的增大，柑橘的腐爛率逐漸降低，且當(dāng)獨活提取物濃度為2.5%時，柑橘的腐爛率最低。由圖1c可以看出，相對于空白對照組，隨著獨活提取物濃度的增大，柑橘中抗壞血酸的含量降低得愈加緩慢，且當(dāng)濃度為2.0%和2.5%時，果實中抗壞血酸含量降低得最慢。綜合分析效果最佳的獨活提取物濃度范圍為1.5%～2.5%。

圖1 不同濃度獨活提取物對失重率、腐爛率及抗壞血酸含量的影響Fig.1 Effects of HHDE concentration on weight loss rate,decay rate and ascorbic acid content

2.1.2 不同濃度成膜基質(zhì)對失重率、腐爛率及抗壞血酸含量的影響 圖2可以看出：隨著貯藏時間的延長, 不同濃度成膜基質(zhì)保鮮劑處理的柑橘的腐爛率和失重率整體均呈上升趨勢，而抗壞血酸的含量呈下降趨勢。由圖2a可以看出，在同一貯藏時間下，隨著CMC和PVP加入比例的變化，各個處理組的果實的失重率均顯著（P＜0.05）低于空白對照組，但除空白對照組之外的各處理組間的結(jié)果相差不大。由圖2b可以看出，當(dāng)成膜基質(zhì)中PVP占比逐漸升高時，果實的腐爛率逐漸降低，在貯藏25 d期間，當(dāng)CMC+PVP濃度為0.7%+0.3%～0.5%+0.5%時，柑橘的腐爛率相當(dāng)且達(dá)到最低。由圖2c可以看出，與空白對照組相比，加入成膜材料可以明顯降低柑橘中抗壞血酸含量下降的速度，當(dāng) CMC+PVP濃度為0.7%+0.3%～0.5%+0.5%時，果實中抗壞血酸含量下降得最慢。綜合考慮，CMC與PVP復(fù)合涂膜的最佳濃度為 0.5%CMC+0.5%PVP～0.7%CMC+0.3%PVP。

圖2 不同濃度成膜基質(zhì)對失重率、腐爛率及抗壞血酸含量的影響Fig.2 Effects of CMC/PVP concentration on weight loss rate,decay rate and ascorbic acid content

2.1.3 不同濃度GABA對失重率、腐爛率及抗壞血酸含量的影響 由圖3分析可以得出：隨著貯藏時間的延長，不同濃度GABA處理柑橘的腐爛率和失重率整體均呈上升趨勢，而抗壞血酸含量呈下降趨勢。由圖3a～圖3b可以看出，在同一貯藏時間下，加入不同濃度的GABA對失重率和腐爛率影響差異不顯著。由圖3c可以看出，隨著GABA濃度的增加，柑橘中抗壞血酸的含量降低的越來越緩慢，當(dāng)濃度為1.25%時，果實中抗壞血酸的含量降低得最慢，且當(dāng)濃度范圍為0.75%～1.25%時差別不大，這可能是由于外源GABA處理可以減少柑橘果實采后貯藏過程中呼吸作用和能量代謝過程中檸檬酸和氨基酸的消耗，有效地提高果實貯藏性能，降低腐爛率，還可以誘導(dǎo)內(nèi)源GABA，具有良好的抗氧化作用，可以防止抗壞血酸的損失[17]。綜合分析，GABA的適宜濃度范圍為0.75%～1.25%。

圖3 不同濃度GABA對失重率、腐爛率及抗壞血酸含量的影響Fig.3 Effects of GABA concentration on weight loss rate,decay rate and ascorbic acid content

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在上述單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以X1：HHDE濃度、X2：CMC+PVP 濃度、X3：GABA 濃度為因子，加權(quán)綜合指數(shù)（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗，不同濃度保鮮劑處理后的加權(quán)綜合指數(shù)見表2。隨后采用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，回歸方程的方差分析和顯著性分析結(jié)果見表3。用軟件進(jìn)行二次多項式擬合，得到預(yù)測模型如下：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results for response surface experiment

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVE) for response surface model

由表3分析可知，該試驗所建立的二次多項模型的P值小于0.0001，具有極顯著性， 失擬項P＞0.05，即不顯著，說明模型能很好地反映數(shù)據(jù)。方程的決定系數(shù)R2為0.9725，表明復(fù)合涂膜保鮮劑對柑橘果實保鮮效果的加權(quán)綜合指數(shù)建立的方程對實驗的擬合優(yōu)度較好，因此，該模型可以用于預(yù)測實際情況。校正決定系數(shù)R2Adj為0.9372，表明該模型可以解釋93.72%的保鮮劑的保鮮效果的加權(quán)綜合指數(shù)的變化；各自變量實驗因素對響應(yīng)值的影響情況如下：HHDE濃度和CMC+PVP的濃度對復(fù)合涂膜保鮮劑加權(quán)綜合指數(shù)影響極顯著（P＜0.01）。HHDE濃度、CMC+PVP濃度和GABA的濃度對復(fù)合涂膜保鮮劑加權(quán)綜合指數(shù)有顯著（P＜0.05）的交互影響。各因素的F值可以反映各因素對實驗指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實驗指標(biāo)的影響越大，重要性越大?？梢姼饕蛩貙?fù)合涂膜保鮮劑的加權(quán)綜合指數(shù)影響程度大小順序為：成膜基質(zhì)濃度＞獨活提取物濃度＞γ-氨基丁酸濃度。

圖4可反映出當(dāng)固定其中任一因素時，另外兩個因素的綜合作用對加權(quán)綜合指數(shù)的影響，等高線的形狀可以反映出兩個因素的交互作用對響應(yīng)值影響的顯著性，橢圓形表示對響應(yīng)值影響顯著，而圓形則表示影響不顯著[33]。從圖4可以看出，三個因素中，任意兩個因素形成的等高線均為橢圓，表面兩兩之間的交互影響均顯著，同時，三個響應(yīng)面均為凸型曲面，表明復(fù)合涂膜保鮮劑保鮮效果的加權(quán)綜合指數(shù)存在較高值且在考察范圍內(nèi)[25]。對預(yù)測方程進(jìn)行求解，得到最佳配方為：HHDE濃度為2.014%，CMC+PVP濃度為0.64%+0.36%，GABA濃度為1.023%，在最佳配方下，加權(quán)綜合指數(shù)理論上可達(dá)9.047?？紤]實際情況進(jìn)行修正，最佳配方條件為HHDE濃度2.0%、CMC+PVP濃度為0.6%+0.4%、GABA濃度為1.0%。隨后設(shè)計三組平行實驗進(jìn)行結(jié)果的驗證，測得柑橘20 ℃貯藏保存25 d后的加權(quán)綜合指數(shù)分別為8.93、9.04、9.12，平均加權(quán)綜合指數(shù)為 9.03，與模型預(yù)測值的相對誤差在0.2%左右，說明模型擬合性良好，驗證了模型的有效性。

圖4 交互項對加權(quán)綜合指數(shù)影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the interaction effects on the weighted composite index

2.3 不同處理組對柑橘采后保鮮效果的影響

2.3.1 不同處理組對柑橘果實貯藏效果的影響 腐爛率、失重率和硬度是反映果實貯藏品質(zhì)與保鮮劑保鮮效果最直接、最重要的指標(biāo)。從圖5a可以看出，空白對照組、復(fù)合膜對照組、獨活提取物對照組和復(fù)合涂膜保鮮劑實驗組處理果實分別從貯后第10、10、20、30 d開始出現(xiàn)腐爛。且貯藏至80 d時，復(fù)合膜對照組腐爛率為16.24%，獨活對照組為13.13%，實驗組為 10.06%，空白對照組為 22.08%，每組處理間差異顯著（P＜0.05）。說明加入成膜材料后可以明顯降低柑橘的腐爛率，加入獨活提取物可以更加明顯降低果實的腐爛率。可能是復(fù)合膜處理可以在果實表面形成一層具有選擇性透過性的薄膜，調(diào)節(jié)果實的呼吸作用，達(dá)到微氣調(diào)的效果，還可以對果皮起到保護(hù)作用，降低腐爛風(fēng)險[8,34]。加入獨活提取物后，果實的腐爛率更低，說明獨活提取物可以有效抑制柑橘采后真菌病害的發(fā)生，可以大大提高保鮮劑的防腐防病效果。由圖5b可以看出，隨著貯藏時間的延長，果實的失重率整體均呈上升趨勢，在同一貯藏時間下，復(fù)合膜對照組與實驗組的失重率顯著（P＜0.05）低于空白對照組和獨活提取物對照組，且在貯藏至80 d時，空白對照組、獨活對照組、復(fù)合膜對照組以及實驗組的失重率分別為16.20%、16.03%、13.34%、12.46%，說明加入CMC和PVP復(fù)合膜材料可以有效降低果實失重率，原因可能是CMC和PVP具有良好的成膜性，在柑橘果實表面形成一層較為均勻的保護(hù)薄膜，一定程度上阻塞果實表皮的氣孔和皮孔，對果實的蒸騰產(chǎn)生抑制作用，從而阻止果實表皮水分的散失，達(dá)到降低果實失重率的效果[35]；另外，形成的薄膜還可以抑制果實呼吸作用，延緩內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，延緩果實失重。由圖5c 可以看出，隨著貯藏時間的延長，各個處理組果實的硬度均逐漸降低，在同一貯藏時間內(nèi)，獨活對照組與復(fù)合涂膜保鮮劑實驗組處理的果實硬度顯著（P＜0.05）高于空白對照組和復(fù)合膜對照組，且在貯藏40 d以后最為明顯，在貯藏至80 d后，空白對照組、獨活對照組、復(fù)合膜對照組以及實驗組的硬度分別為0.56、0.70、0.51、0.73 N/cm2，說明加入了獨活提取物能夠有效延緩果實硬度的下降。果膠質(zhì)在果實成熟之前呈不溶狀態(tài)，即原果膠，使果肉質(zhì)地堅硬，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而果膠的溶解是最重要的果實軟化特征溶解是最重要的果實軟化特征[36-37]，加入獨活提取物可以緩解果實硬度的下降，可能是因為獨活提取物可以抑制分解果膠質(zhì)的微生物的繁殖，比如青霉、曲霉、枝孢霉等，抑制果膠質(zhì)的分解，從而延緩果實硬度下降。

圖5 不同處理對贛南臍橙果實腐爛率、失重率和硬度的影響Fig.5 Effects of different treatments on fruit decay rate weight loss rate and hardness

綜上，復(fù)合膜能保持果實水分，降低失重率，加入獨活提取物能夠有效抑制果實腐爛，保持果實硬度。且在低溫貯藏80 d后，復(fù)合涂膜實驗組處理的果實的腐爛率和失水率最低，且硬度最大，使果實表現(xiàn)出較好的貯藏性能。

2.3.2 不同處理對柑橘果實品質(zhì)的影響 柑橘類果實中含有豐富的AsA、SSC、TA、TSC，并且果實中四種成分容易受貯藏條件的影響且隨貯藏時間延長而呈現(xiàn)一定的變化，因此可以作為評價果實營養(yǎng)品質(zhì)和貯藏效果的重要指標(biāo)[38]。由圖6a可以看出，果實AsA含量在貯藏前期均略有上升，隨后又逐漸下降。這是因為果實在貯藏前期可溶性糖、酸、礦物質(zhì)等的含量不斷升高，使可溶性固形物含量有所增加，且增加的含量多于呼吸消耗，后期隨著呼吸作用的持續(xù)進(jìn)行，可溶性固形物的含量又不斷降低。貯藏10～80 d期間，與空白對照組和獨活提取物對照組相比，復(fù)合膜對照組和實驗組均能顯著（P＜0.05）緩解果實中AsA的下降，在貯藏至80 d時，空白對照組、獨活對照組、復(fù)合膜對照組以及實驗組的抗壞血酸的含量分別為 21.04、24.87、33.12、33.41 mg/100 g，說明加入復(fù)合涂膜材料可以有效緩解抗壞血酸的流失。如圖6b所示，柑橘果實中可溶性固形物的含量隨著貯藏時間的延長，整體呈先上升后下降的趨勢，且空白對照組和復(fù)合膜對照組的SSC含量在貯藏30 d后達(dá)到峰值，分別為 11.32%和 11.46%，實驗組與獨活對照組在貯藏50 d后才達(dá)到峰值，分別為11.54%和11.60%，且前兩組和后兩組之間差異顯著（P＜0.05）。說明獨活提取物的加入可有效阻止果實中可溶性固形物含量的下降，由圖6c可以看出，TA含量在貯藏前10 d呈緩慢下降趨勢，在10～30 d呈緩慢上升，隨后持續(xù)緩慢下降，在貯藏30～50 d過程中，復(fù)合膜對照組與實驗組處理的果實TA含量一直高于空白對照組和獨活提取物對照組，在貯藏至80 d時，空白對照組、復(fù)合膜對照組、獨活對照組以及實驗組的TA含量分別為1.18%、1.19%、1.28%、1.31%，說明在貯藏30～50 d期間復(fù)合涂膜材料的加入可有效阻止果實中TA的流失。如圖6d所示，果實中TSC的含量隨著貯藏時間的延長總體上呈先上升后緩慢下降的趨勢，復(fù)合膜對照組與實驗組處理的果實TSC在貯藏30 d后達(dá)到峰值，空白對照組和獨活提取物對照組在貯藏20 d后達(dá)到峰值，且在整個貯藏過程中前兩組含量TSC顯著（P＜0.05）高于后兩組。在貯藏至80 d時，空白對照組、獨活對照組、復(fù)合膜對照組以及實驗組的TSC含量分別為10.94%、11.05%、12.68%、12.13%，說明復(fù)合涂膜材料的加入可有效阻止果實中TSC的流失。

圖6 不同處理對贛南臍橙果實AsA、SSC、TA和TSC含量的影響Fig.6 Effects of different treatments on AsA, SSC, TA and TSC in fruits

綜合分析，復(fù)合膜材料的加入可以延緩AsA、SSC、TA、TSC含量的下降，可能是由于涂膜材料在果實表面形成一層選擇性透過的薄膜，而抑制果實呼吸作用，延緩內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，而達(dá)到保鮮的目的。

2.3.3 不同處理對柑橘果實生理生化指標(biāo)的影響丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過氧化過程中的重要產(chǎn)物，是衡量膜質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，果實在逆境脅迫或衰老過程中，活性氧積累而引發(fā)膜質(zhì)過氧化作用，造成細(xì)胞膜的損害[39]。從圖7可以看出，隨著貯藏時間的延長果實中丙二醛的含量均呈先上升后降低的趨勢，但在整個貯藏期，空白對照組與復(fù)合膜對照組MDA含量迅速增加，在30 d后達(dá)到峰值為2.78 μmol/mF，總體水平高于實驗組與獨活對照組，且差異顯著（P＜0.05），在貯藏80 d后，復(fù)合膜對照組、空白對照組、獨活對照組以及實驗組的丙二醛含量分別為1.24、1.20、0.90、0.87 μmol/mF，可以判斷加入獨活提取物可有效減少果實中MDA的積累，可能是由于獨活提取物中含有大量的香豆素、黃酮類化合物，具有很好的抗氧化作用，而減少過氧化物的生成，進(jìn)而減少丙二醛的生成，減輕對果實細(xì)胞脂膜和細(xì)胞器造成的影響[40]。

圖7 不同處理對贛南臍橙果實中丙二醛（MDA）含量的影響Fig.7 Effects of different treatments on MDA content in fruits

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）均為果實的保護(hù)酶，可以提高果實的抗氧化能力，起到清除活性氧、維護(hù)氧代謝平衡的重要作用，延緩果實的衰老。植物在受到病原物侵染后，常產(chǎn)生一些病程相關(guān)蛋白以抵御病原菌的進(jìn)一步侵染，而β-1，3-葡聚糖酶（GUN）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）都與植物抗病性密切相關(guān)[8]。從圖8a可以看出，四個處理組中果實的SOD活性均隨時間的延長呈先升高后下降趨勢，且貯藏50 d后，單獨復(fù)合膜對照組和獨活提取物對照組處理的果實SOD活性均顯著（P＜0.05）高于空白對照組，復(fù)合涂膜保鮮劑實驗組處理果實的SOD活性極顯著（P＜0.01）高于空白對照組，在貯藏80 d后，空白對照組、復(fù)合膜對照組、獨活對照組以及實驗組的SOD活性分別為110.05、127.03、130.25、135.43 U/g-1。所以加入獨活提取物與成膜物質(zhì)均一定程度可以保持SOD的活性，二者結(jié)合使用具有一定的疊加效果，有效延緩果實的衰老。圖8c可以看出，GUN的活性隨貯藏時間延長先升高后降低，且在貯藏50 d以后，實驗組和獨活提取物對照組處理的果實GUN活性均顯著（P＜0.05）高于復(fù)合膜對照組和空白對照組，在貯藏80 d后，空白對照組、獨活對照組、復(fù)合膜對照組以及實驗組的GUN活性分別為 1.05、1.25、1.03、1.30 U/g-1，說明加入了獨活提取物一定程度可以緩解GUN活性降低，從而提高果實的抗病性。從圖8b、圖8d可以看出，柑橘果實冷藏期間POD、PAL活性總體均呈先上升后緩慢下降的趨勢，且四個處理組之間無顯著差異（P＞0.05），所以復(fù)合涂膜保鮮劑處理對POD、PAL活性沒有明顯的影響。

圖8 不同處理對贛南臍橙果實中SOD、POD、GUN和PAL活性的影響Fig.8 Effects of different treatments on activities of SOD, POD, GUN and PAL in fruits

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面法建立了獨活提取物濃度、CMC/PVP濃度、GABA濃度與加權(quán)綜合指數(shù)之間的響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型，對柑橘復(fù)合涂膜保鮮劑配方進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳配方為獨活提取物2.0%、羧甲基纖維素鈉/聚乙烯吡咯烷酮0.6%/0.4%、γ-氨基丁酸1.0%，響應(yīng)面模型預(yù)測值為9.047，與驗證值的相對誤差在0.2%左右，表明采用Box-Behnken法優(yōu)化柑橘復(fù)合涂膜保鮮劑配方可行、可靠。將不同處理組處理的果實連續(xù)低溫（4 ℃）貯藏80 d發(fā)現(xiàn)：加入獨活提取物可以有效抑制果實的腐爛，提高果實防腐防病效果；保持果實硬度，使柑橘果實保持了較好的感官品質(zhì)；可以減少柑橘果實中MDA的積累，減輕膜質(zhì)的過氧化程度，減少對細(xì)胞器的損害；使果實保持較高的SOD和GUN活性，提高抗氧化和抗病能力，延緩果實衰老，達(dá)到保鮮的目的。另外，加入復(fù)合膜材料可以在果實表皮形成一層薄膜，阻止果實中水分的散失，降低失重率；抑制果實呼吸作用，延緩AsA、SSC、TA、TSC含量的下降，使水果保持較好的品質(zhì)與口感。分析最優(yōu)配方處理實驗組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獨活提取物與復(fù)合膜材料二者配合使用制備復(fù)合涂膜保鮮劑可以達(dá)到既具有良好的成膜性，又具有良好的抑菌性和抗氧化性，起到效果疊加的作用，對各指標(biāo)的效果均優(yōu)于二者單獨使用。本研究為柑橘保鮮技術(shù)領(lǐng)域提供了一定的理論依據(jù)，對柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。