木槿花瓣中的總黃酮成分及抗氧化能力分析

陳 含，李浙浙，王東升，程蓓蓓,

（1.河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北秦皇島 066004；

2.河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066000）

木槿（Hibiscus syriacusL.）隸屬于錦葵科，木槿屬，是我國(guó)北方夏季重要的觀賞木本花卉。木槿具有耐寒、耐旱、耐水濕等優(yōu)良特性，在我國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)都有栽培種植[1]。除觀賞價(jià)值外，木槿還具有豐富的食藥用價(jià)值，其花、根、葉均可入藥。木槿花在我國(guó)已有多年的食用歷史，目前在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)還保留有食用脫水木槿花的習(xí)俗[2-3]。木槿花中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維等基本的營(yíng)養(yǎng)元素[4]，除此以外木槿花中還含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮類物質(zhì)，據(jù)研究在每100 g木槿的干花中就含有1.15 g的總黃酮[5-6]。黃酮類化合物是一種常見的次級(jí)代謝物，具有安全無(wú)毒且抗氧化能力遠(yuǎn)高于維生素C的特點(diǎn)[7]，除此之外還具有抗癌、預(yù)防心血管疾病和抗感染的作用[8-11]。目前已經(jīng)在天竺葵、玫瑰、樹莓、竹葉花椒等植物[12-15]的類黃酮提取液中都發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。研究木槿花中黃酮類物質(zhì)及其抗氧化能力，有利于開發(fā)木槿花中類黃酮資源，提升木槿花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。木槿花可成為保健食品和飲料的重要原料，將其作為食用花卉進(jìn)行應(yīng)用和開發(fā)，從而拉長(zhǎng)木槿花產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)鏈，促進(jìn)相關(guān)人員增收。

目前對(duì)物質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法，可以分為體內(nèi)評(píng)價(jià)方法和體外評(píng)價(jià)方法。體外抗氧化評(píng)價(jià)方法與體內(nèi)評(píng)價(jià)方法相比具有更加快速和靈活的特點(diǎn)，因而得到了更為廣泛的應(yīng)用。通過不同的抗氧化能力評(píng)價(jià)體系對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)得的結(jié)果會(huì)有所差異，因此，在一般情況下需要選用2種或2種以上的抗氧化能力評(píng)價(jià)方法才能獲得較為準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果[16-18]。孫澤飛通過 DPPH和ABTS法對(duì)牡丹的抗氧化性進(jìn)行研究，結(jié)果表明牡丹花具有較高的清除DPPH和ABTS+自由基的能力[19]。在木槿抗氧化性研究方面，黃采姣對(duì)木槿花的生物活性物質(zhì)的取工藝進(jìn)行了優(yōu)化[7]，使其生物活性物質(zhì)得率不斷提高。目前，對(duì)木槿花的營(yíng)養(yǎng)成分[4]、水溶性與揮發(fā)性物質(zhì)的成分[20]研究也在不斷深入，但關(guān)于木槿花總黃酮的組成及抗氧化性方面的研究還是較少，因此，解析木槿花總黃酮的組成成分及其抗氧化性就顯得尤為重要。

本研究采用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，分析不同品種木槿花總黃酮成分，并以DPPH法和ABTS法為指標(biāo)對(duì)抗氧化能力進(jìn)行比較。本研究旨在闡明木槿花的成分組成和抗氧化活性，為木槿花中總黃酮物質(zhì)的利用提供理論依據(jù)，為抗氧化功能食品、藥品和天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木槿花 本研究的實(shí)驗(yàn)材料是于2020年9月采摘于浙江省嘉善縣笠歌生態(tài)科技有限公司種植基地，均選用樹齡相同、無(wú)病蟲害、生長(zhǎng)于同一部位一年生枝條上、處于盛開期的‘藍(lán)莓冰沙’（H.syriacus'Blueberry Smoothie'）、‘紅色法國(guó)酒館’（H.syriacus'Red French Cabaret'）、‘牡丹’（H.syriacus'Paeoniflorus'）、‘紫色法國(guó)酒館’（H.syriacus'Purple French Cabaret'）、‘紅心’（H.syriacus'Red Heart'）木槿花，其顏色分別為藍(lán)色、紅色、粉色、紫色和白色。將采集的花瓣去除殘瓣及花暈后投入液氮冷凍再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，待冷凍后加液氮將花瓣研磨成粉末狀并置于使用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥33 h后避光保存?zhèn)溆茫?/p>

蘆?。ā?8%）、水溶性維生素E（Trolox，≥98%）均為標(biāo)準(zhǔn)品，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS） 均為分析純，上海源葉科技有限公司；甲醇、過硫酸鉀、過硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純），乙腈、甲酸（均為色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Ultimate 3000高效液相色譜儀、Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司；HHXG-10A超聲波水浴鍋 宏華儀器；723N紫外-可見分光光度計(jì) 上海赫爾普國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮物質(zhì)的提取 在參考黃采姣[7]方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。分別準(zhǔn)確稱取5個(gè)木槿品種花瓣的冷凍干燥粉末0.10 g并過60目篩，用20 mL甲醇在恒定25 ℃的超聲波水浴鍋中超聲萃取30 min，倒出第一次的提取液，在相同條件下用20 mL甲醇再次萃取30 min，將兩次的萃取液合并，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后定容至50 mL放入4 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2.2 總黃酮物質(zhì)成分鑒定 對(duì)提取獲得的甲醇提取液用X-5大孔樹脂分離純化，提取液上樣濃度為0.5 mg/mL，上樣流速為6 BV/h，水洗體積為4 BV，洗脫液為甲醇，洗脫液流速為2.5 BV/h，洗脫劑用量為80 mL。得到試劑后用高效液像色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析。

根據(jù)韓陽(yáng)陽(yáng)等[21]的方法以及儀器實(shí)際出峰效果最終確定的液相色譜條件和質(zhì)譜條件如下：

液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，0.5 pm）；流動(dòng)相 C：0.1%的甲酸水（v/v），流動(dòng)相 D：乙腈；流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?～7 min，90% C，10% D；7～15 min，80%～65% C，20%～35% D；15～20 min，65%～0 C，35%～100% D；20～22 min，0～90% C，100%～10% D；22～25 min，90% C，10% D；總黃酮物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)為308 nm。

質(zhì)譜條件：采用正離子模式，電噴霧離子源，干燥器溫度400 ℃，離子源溫度120 ℃，干燥氣流速度10 L/min，噴霧氣壓力50 psi，毛細(xì)管裂解電壓3.5 kV，錐孔電壓40 V，全離子掃描，質(zhì)量數(shù)掃描范圍：m/z 100～1200。

1.2.3 總黃酮物質(zhì)組分及其含量測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用甲醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。按濃度梯度吸取配置好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL容量瓶中定容，配置成溶度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的溶液。使用移液槍吸取1.5 mL，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，液相色譜和質(zhì)譜條件如1.2.2。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下：y=3684.1x-2690.4，R2=0.9988。

1.2.3.2 樣品中總黃酮各成分含量測(cè)定 根據(jù)1.2.2測(cè)定出的液相色譜圖，以峰面積為因變量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到溶液中各成分的濃度，再根據(jù)下式計(jì)算出木槿花干粉中總黃酮各成分的含量：

木槿花干粉總黃酮（各成分）含量M=c×v/w

式中：c是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測(cè)物質(zhì)濃度；v是溶液的體積；w是冷凍干燥粉的重量。

1.2.4 總黃酮含量測(cè)定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用70%乙醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液放入25 mL容量瓶中，各加入1.25 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，靜置6 min后分別加入1.25 mL 10%的硝酸鋁溶液，靜置6 min后分別加入10 mL 4%的氫氧化鈉溶液，用70%乙醇定容至25 mL，搖勻后反應(yīng)15 min。使用分光光度計(jì)，在510 nm處測(cè)得吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。y=8.7543x+0.0156，R2=0.998。樣品中總黃酮含量以蘆丁含量計(jì)算。

1.2.4.2 樣品中總黃酮含量測(cè)定 取1.2.1制得的待測(cè)液 2.5 mL置于 25 mL容量瓶中，按照 1.2.4.1進(jìn)行，平行測(cè)定3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到溶液中總黃酮濃度。根據(jù)1.2.3.2中木槿花干粉總黃酮含量的計(jì)算公式計(jì)算總黃酮含量。

1.2.5 木槿花抗氧化差異研究 本研究的抗氧化性實(shí)驗(yàn)是在付磊[22]和孫澤飛[19]的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上調(diào)整完成的。具體實(shí)驗(yàn)過程如下。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 對(duì)照組為1 mL甲醇與3 mL溶度為0.04 mg/mL的DPPH溶液混合，避光反應(yīng)30 min后在517 nm處的吸光度，記為A1；取1 mL提取液與3 mL溶度為0.04 mg/mL的DPPH溶液混合，搖勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)定樣品吸光值，記為A2；1 mL提取液與3 mL甲醇溶液混合，避光反應(yīng)30 min后在517 nm處的吸光值，記為A3。每個(gè)試樣平行測(cè)定3次。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：DPPH自由基清除率（%）=[A1-（A2-A3）/A1]×100

根據(jù)Trolox對(duì)DPPH自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的DPPH自由基清除能力利用Trolox濃度折算成Trolox當(dāng)量。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 對(duì)照組為0.1 mL甲醇溶液與3.9 mL溶度為7 mmol/L的ABTS溶液混合，避光反應(yīng)8 min后，在732 nm處的吸光值，記為 Ac。取0.1 mL提取液與 3.9 mL溶度為7 mmol/L的ABTS溶液混合，避光反應(yīng)8 min后，在732 nm處的吸光值，記為As；將0.1 mL提取液與3.9 mL甲醇混合，避光反應(yīng)8 min后，在732 nm處的吸光值，記為Ao。每個(gè)試樣平行測(cè)定3次。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式為：ABTS+自由基清除率（%）=[Ac-（As-Ao）/Ac]×100

根據(jù)Trolox度ABTS+自由基清除能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的ABTS+自由基清除能力利用Trolox濃度折算成Trolox當(dāng)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

總黃酮成分采用Xcalibur3.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及鑒別，抗氧化分析采用SPSS 26進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 木槿花瓣總黃酮提取液的液相色譜結(jié)果

利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在308 nm波長(zhǎng)下對(duì)5種不同花色木槿花瓣中總黃酮成分進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果如下圖：

從圖1可知：‘紅心’木槿花瓣、‘紫色法國(guó)酒館’木槿花總黃酮提取液分別檢測(cè)出4個(gè)峰，推測(cè)這可能是4種物質(zhì)；‘紅色法國(guó)酒館’木槿花總黃酮提取液共檢測(cè)出6個(gè)峰，推測(cè)這可能是6種物質(zhì)；‘藍(lán)莓冰沙’木槿花總黃酮提取液共檢測(cè)出3種總黃酮成分，推測(cè)這可能是3種物質(zhì)；‘牡丹’木槿花總黃酮提取液共檢測(cè)出5種總黃酮成分，從左往右，依次編號(hào)。

圖1 木槿花瓣液相色譜分析Fig.1 HPLC analysis of petals of different varieties of Hibiscus syriacus

2.2 不同品種木槿花總黃酮質(zhì)譜結(jié)果分析

根據(jù)文獻(xiàn)[6,23]研究可知，黃酮類化合物若開始脫去質(zhì)量單位為162、146的碎片峰，可推測(cè)該物質(zhì)可能含有的是六碳糖基；若質(zhì)譜圖中首先脫去質(zhì)量單位為60、90、120的碎片峰，可推斷該物質(zhì)為六碳糖的碳苷類化合物；若是質(zhì)譜圖中只產(chǎn)生了脫去質(zhì)量單位60、90的碎片峰，沒有出現(xiàn)脫去120質(zhì)量單位的碎片峰，則可推斷該物質(zhì)為五碳糖的碳苷類化合物[24-25]。此外因黃酮種類多樣，存在同分異構(gòu)體或手性原子，母核脫去碎片峰的規(guī)律也極為相似，故本實(shí)驗(yàn)僅通過脫去方式與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，做出物質(zhì)的初步分析。

2.2.1 ‘紅心’木槿花總黃酮質(zhì)譜結(jié)果分析 由表1可知，1號(hào)峰保留時(shí)間為13.18 min，其分子離子峰[M+H]+為 m/z 595.16，在二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)的 m/z 433.1的碎片離子是由分子離子峰m/z 595.16失去一分子質(zhì)量單位為162的六碳糖所得，由此可以判斷該物質(zhì)中存在六碳糖；m/z 313.07是[M+H-162-120]+，即分子中還含有一個(gè)與苷元以碳苷鍵連接的六碳糖基，該結(jié)果與黃采姣[7]研究該化合物可能是芹菜素-C-二葡萄糖苷相一致。2號(hào)峰為保留時(shí)間為13.94 min，其分子離子峰 [M+H]+為 m/z 681.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 561.12的碎片離子是分子離子峰m/z 681.16失去一分子質(zhì)量單位120的一個(gè)與苷元以碳苷鍵連接的六碳糖基，但該物質(zhì)未能找到。3號(hào)峰保留時(shí)間為14.46 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 579.17，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 433.11的碎片離子，參照文獻(xiàn)[26]該化合物可能芹菜素-7-O-蕓香糖苷。4號(hào)峰保留時(shí)間為14.92 min，分子離子峰[M+H]+為m/z 433.11，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 415.10的碎片離子，該物質(zhì)可能是牡荊苷，該結(jié)果與劉賢青等[27]研究結(jié)果一致。

表1 ‘紅心’木槿總黃酮成分分析Table 1 Analysis of total flavonoids in Hibiscus syriacus 'Red heart'

2.2.2 ‘紅色法國(guó)酒館’木槿花總黃酮質(zhì)譜結(jié)果分析由表2可知，1號(hào)峰的保留時(shí)間為12.22 min，其分子離子峰 [M+H]+為m/z 611.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)的m/z 449.11的碎片離子是分子離子峰m/z 611.16失去一分子質(zhì)量單位162的六碳糖，由此可以判斷該物質(zhì)中肯定存在六碳糖，該化合物可能是山奈酚-O-六碳糖-C六碳糖苷，該結(jié)果與黃采姣[7]研究結(jié)果一致。2號(hào)峰的保留時(shí)間為12.65 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 451.12，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 289.07的碎片離子，其碎片離子是分子離子峰m/z 451.12失去一分子質(zhì)量單位162的六碳糖，由此可以判斷該物質(zhì)中肯定存在六碳糖，該化合物可能是圣草酚-7-O-葡萄糖苷[28]。3號(hào)峰的保留時(shí)間為13.17 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 595.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 433.11、313.07的碎片離子，參照文獻(xiàn)[7]該化合物可能是芹菜素-C-二葡萄糖苷。4號(hào)峰的保留時(shí)間為13.90 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 697.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 287.05的碎片離子，該化合物可能是山奈酚-3-O-丙二酰葡萄糖苷-7-O葡萄糖苷[27]。5號(hào)峰的保留時(shí)間為16.36 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 449.11，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 287.05的碎片離子，參照文獻(xiàn)[27]該化合物可能是木犀草素-7-O-葡萄糖苷。6號(hào)峰的保留時(shí)間為17.03 min，其分子離子峰 [M+H]+為 m/z 579.13，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 331.08的碎片離子，該化合物可能是麥黃酮-O-丙二酰基-己糖苷，該結(jié)果與劉賢青等[27]研究結(jié)果一致。

表2 ‘紅色法國(guó)酒館’總黃酮成分分析Table 2 Analysis of total flavonoids in Hibiscus syriacus 'Red French Cabaret'

2.2.3 ‘紫色法國(guó)酒館’木槿花總黃酮質(zhì)譜分析 紫色法國(guó)酒館木槿花瓣類黃酮提取液共檢測(cè)出4種類黃酮成分。根據(jù)保留時(shí)間，液相色譜信息和質(zhì)譜信息進(jìn)行推測(cè)（表3）。1號(hào)峰保留時(shí)間為13.15 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 595.16，在二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z 433.1的碎片離子是由分子離子峰m/z 595.16失去一分子質(zhì)量單位為162的六碳糖所得，由此可以判斷該物質(zhì)中肯定存在六碳糖，m/z 313.07是[M+H-162-120]+，即分子中還含有一個(gè)與苷元以碳苷鍵連接的六碳糖基，該結(jié)果與黃采姣[7]研究該化合物可能是芹菜素-C-二葡萄糖苷相一致。2號(hào)峰為保留時(shí)間為13.94 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 681.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)的m/z 561.12的碎片離子是分子離子峰m/z 681.16失去一分子質(zhì)量單位為120的與苷元以碳苷鍵連接的六碳糖基，但該物質(zhì)未能找到。3號(hào)峰保留時(shí)間為14.46 min，其分子離子峰 [M+H]+為 m/z 579.17，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了 m/z 433.11碎片離子，參照文獻(xiàn)[26]該化合物可能芹菜素-7-O-蕓香糖苷。4號(hào)峰保留時(shí)間為14.92 min，分子離子峰[M+H]+為m/z 433.11，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 415.10的碎片離子，該物質(zhì)可能是牡荊苷，該結(jié)果與劉賢青等[27]研究結(jié)果一致。

表3 ‘紫色法國(guó)酒館’木槿總黃酮成分分析Table 3 Analysis of total flavonoids in Hibiscus syriacus 'Purple French Cabaret'

2.2.4 ‘藍(lán)莓冰沙’木槿花總黃酮質(zhì)譜結(jié)果分析 由表4可知，1號(hào)峰的保留時(shí)間為13.17 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 595.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 433.11、313.0的碎片離子，參照文獻(xiàn)[7,29]該化合物可能是芹菜素-C-二葡萄糖苷。2號(hào)峰的保留時(shí)間為14.47 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 579.17，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 433.11的碎片離子，該化合物可能芹菜素-7-O-蕓香糖苷[7]。3號(hào)峰的保留時(shí)間為 14.90 min，其分子離子峰[M+H]+為 m/z 433.11，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 415.10的碎片離子，參照文獻(xiàn)[27]該物質(zhì)可能是牡荊苷。

表4 ‘藍(lán)莓冰沙’總黃酮成分分析Table 4 Analysis of total flavonoids in Hibiscus syriacus 'Blueberry Smoothie'

2.2.5 ‘牡丹’木槿花總黃酮質(zhì)譜分析 由表5可知，1號(hào)峰的保留時(shí)間為12.26 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 451.12，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 289.07的碎片離子，該物質(zhì)可能是圣草酚-7-O-葡萄糖苷[28]。2號(hào)峰的保留時(shí)間為13.21 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 595.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z433.11、313.07的碎片離子，該化合物可能是芹菜素-C-二葡萄糖苷[26]。3號(hào)峰的為保留時(shí)間為13.95 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 697.16，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 287.05的碎片離子，該化合物可能是山奈酚-3-O-丙二酰葡萄糖苷-7-O葡萄糖苷[27]。4號(hào)峰的為保留時(shí)間為16.43 min，其分子離子峰 [M+H]+為 m/z 449.10，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 287.05的碎片離子，其中m/z 449.10的碎片離子是分子離子峰m/z 287.05脫去一分子質(zhì)量單位162的六碳糖，可以判斷該物質(zhì)中肯定存在六碳糖，該化合物可能是木犀草素-7-O-葡萄糖苷[27]。5號(hào)峰的為保留時(shí)間為17.09 min，其分子離子峰[M+H]+為m/z 535.10，在二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)了m/z 287.05的碎片離子，該化合物可能是木犀草素-7-O-6’-丙二?；肴樘擒誟27]。

表5 ‘牡丹’木槿總黃酮成分分析Table 5 Analysis of total flavonoids in Hibiscus syriacus 'Paeoniflorus'

2.3 不同花色品種木槿總黃酮的組分及含量

通過液質(zhì)聯(lián)用對(duì)5種木槿的總黃酮成分和含量進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果如表6。由表6可知，不同品種木槿種黃酮類物質(zhì)在4～6種?！{(lán)莓冰沙’木槿花瓣中芹菜素-C-二葡萄糖糖苷含量最高，為945036 μg/g，是‘紅心’木槿含量的 7～9倍；‘紅色法國(guó)酒館’木槿花瓣中含有黃酮類物質(zhì)種類最多，總共達(dá)6種，其中含量最高的為芹菜素-C-二葡萄糖糖苷，其含量為43273.23 μg/g；‘紫色法國(guó)酒館’木槿花瓣和‘紅心’木槿花瓣所含黃酮類物質(zhì)的種類相同，其中含量最高的均為未知物質(zhì)，其含量分別為589026.29和580829.23 μg/g；‘牡丹’木槿花瓣中芹菜素-C-二葡萄糖苷含量最高，為35255.00 μg/g。研究表明，木槿中黃酮類物質(zhì)的含量較高且種類較多。

2.4 五個(gè)品種木槿花總黃酮提取液的抗氧化能力比較

2.4.1 DPPH自由基清除能力結(jié)果分析 根據(jù)Trolox對(duì)DPPH自由基清除能力，計(jì)算其抗氧化能力得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.9742x-0.0233，R2=0.999。這5個(gè)品種木槿花總黃酮提取液的抗氧化活性見表7。從表7中可看出，5種木槿花提取液間的DPPH自由基清除能力存在顯著性差異（P＜0.05）。這5個(gè)品種木槿花（每g干重）的清除DPPH自由基的能力分別等效于 35.51、49.13、50.28、49.99、49.34 mg Trolox/g。其抗氧化能力為‘紅色法國(guó)酒館’＞‘藍(lán)莓冰沙’＞‘牡丹’＞‘紫色法國(guó)酒館’＞‘紅心’木槿花。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力結(jié)果分析 根據(jù)Trolox對(duì)ABTS+自由基清除能力，計(jì)算其抗氧化能力得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.0654x-0.0618，R2=0.997。木槿花類黃酮物質(zhì)對(duì)ABTS+自由基清除能力弱于對(duì)DPPH自由基清除能力。在ABTS+自由基清除能力測(cè)定中，這五個(gè)品種木槿花（每g干重）的清除能力分別等效于 20.23、27.83、44.11、29.79、35.53 mg Trolox/g，5個(gè)品種木槿花的抗氧化能力為‘紅色法國(guó)酒館’＞‘牡丹’＞‘藍(lán)莓冰沙’＞‘紫色法國(guó)酒館’＞‘紅心’木槿花。

2.4.3 木槿花總黃酮含量和成分與自由基清除能力的相關(guān)性 研究表明[30-32]，不同植物的抗氧化能力與類黃酮（酚類物質(zhì)）之間存在一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用抗氧化活性檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。表8是5種不同顏色的木槿花總黃酮物質(zhì)含量和各成分與抗氧化活性之間相關(guān)性?？傸S酮含量與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力相關(guān)系數(shù)r分別為 0.935和 0.799（P＜0.01），代表著它們之間存在著極顯著的相關(guān)性，說(shuō)明木槿花抗氧化活性的主要作用因子之一是總黃酮。

表8 總黃酮與DPPH和ABTS+自由基清除能力的相關(guān)性Table 8 Correlation between total flavonoids and DPPH and ABTS free radical scavenging capacity

由表8可知DPPH自由基清除能力與牡荊苷呈顯著性負(fù)相關(guān)，結(jié)合表6和表7可知，牡荊苷含量在‘紅心’木槿中含量最高，其DPPH自由基清除能力越低；ABTS+自由基清除能力與山奈酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和麥黃酮-O-丙二?；?己糖苷呈顯著性正相關(guān)。僅‘紅色法國(guó)酒館’中含有這四種成分，所以其ABTS+自由基清除能力比其他品種強(qiáng)。結(jié)果表明，牡荊苷、山奈酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖和麥黃酮-O-丙二酰基-己糖苷是影響木槿抗氧化性的主要總黃酮成分。

3 結(jié)論

通過對(duì)5個(gè)品種的木槿花的總黃酮進(jìn)行鑒定，初步鑒定出9種物質(zhì)，分別為芹菜素-C-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-蕓香糖苷、牡荊苷、山奈酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-丙二酰葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、麥黃酮-O-丙二?；?己糖苷和木犀草素-7-O-6-丙二?；肴樘擒?。本研究測(cè)定了5個(gè)品種木槿花體外抗氧化性，‘紅心’、‘紫色法國(guó)酒館’、‘紅色法國(guó)酒館’、‘藍(lán)莓冰沙’和‘牡丹’五種木槿（mg/g）DPPH 自由基清除能力等效于 35.51、49.13、50.28、49.99、49.34 mg Trolox/g，ABTS+自由基清除能力等效于20.23、27.83、44.11、29.79、35.53 mg Trolox/g?？傮w而言，DPPH與ABTS這兩種體外抗氧化評(píng)價(jià)方法表現(xiàn)較為一致，在這5個(gè)品種的木槿花中‘紅色法國(guó)酒館’木槿花的抗氧化能力較強(qiáng)，‘紅心’木槿花的抗氧化能力較弱。在影響木槿花抗氧化能力的因素方面，總黃酮含量是影響木槿抗氧化性的主要因素；牡荊苷對(duì)木槿花的抗氧化能力呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，山奈酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖和麥黃酮-O-丙二?；?己糖苷對(duì)木槿花的抗氧化能力呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)，這些是影響木槿花抗氧化性的主要的總黃酮成分。