湖南不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒風(fēng)味成分比較分析

肖 何，王蓉蓉，陳夢娟，王馨瑤，尹含靚，劉 洋，蔣立文,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

剁辣椒又名剁辣子、壇子辣椒，是湖南的特色嗜好性調(diào)味品。家庭發(fā)酵剁椒基本上就是將新鮮辣椒采摘后清洗、晾干表面水分、去把去蒂后，斬拌成為一定大小片型，加入一定比例的食鹽、白酒拌勻后入陶瓷壇，厭氧發(fā)酵1年以上?？沙鰤词?，湖南很多家庭一般都會加工供自作自食用，也可以作佐料食用[1-2]，如剁椒魚頭、炊煙時代小炒黃牛肉等湘菜餐桌爆品，形成了較好的市場效應(yīng)。剁辣椒盡管已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化，但經(jīng)過高鹽腌漬，脫鹽、調(diào)味、殺菌處理后剁辣椒風(fēng)味的保真性差，所以很多餐飲企業(yè)自己采用陶瓷壇控制一定鹽度發(fā)酵成為特殊“壇香”的剁辣椒，用于配料使用。

以風(fēng)味物質(zhì)來評價剁辣椒品質(zhì)備受學(xué)者的關(guān)注，現(xiàn)已有不少關(guān)于辣椒風(fēng)味的報道，陸寬等[3]發(fā)現(xiàn)不同辣椒品種發(fā)酵后的風(fēng)味能夠明顯被GC-MS技術(shù)區(qū)分，張毅等[4]對市售剁辣椒進行研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量較高，吳凱等[5]對不同鹽度腌漬辣椒的風(fēng)味物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)低鹽腌漬的辣椒中，揮發(fā)性成分少，高鹽腌漬的辣椒揮發(fā)性成分較多，香氣成分高。風(fēng)味是影響消費者購買行為的重要評判指標[6]，風(fēng)味的影響因素很多，如辣椒原料、發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝等。風(fēng)味物質(zhì)的測定有很多種方法，如氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、紅外光譜法等[7]，頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）[8-10]是目前產(chǎn)品風(fēng)味成分分析最常用的方法，因其具有操作方便快捷、方法靈敏度高、選擇性與重復(fù)性好等特點，能實現(xiàn)多組分混合物的定性、定量分析，較好的反映食品中揮發(fā)性物質(zhì)的基本組成[11]，在發(fā)酵食品揮發(fā)性香氣成分測定中具有顯著的優(yōu)勢。

自然發(fā)酵的剁辣椒具有濃郁的香氣且美味可口、健胃消食，因而倍受人們青睞。湖南是辣椒種植、加工的重點產(chǎn)區(qū)之一，其中邵陽（原為寶慶）自古以來就是辣椒種植加工基地，安化樂安和東坪也有辣椒加工的傳統(tǒng)，洪江、瀏陽都有辣椒基地和種植辣椒的歷史，寧鄉(xiāng)的特色辣椒本地有名。因此，本研究以采自湖南本地這6個不同地區(qū)的特色農(nóng)家剁辣椒為研究對象，比較分析其理化指標、有機酸、揮發(fā)性成分的差異，為建立剁辣椒香氣成分數(shù)據(jù)庫提供理論基礎(chǔ)，為保障特色發(fā)酵辣椒風(fēng)味提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

剁辣椒 湖南6個不同地區(qū)的農(nóng)家古法發(fā)酵，樣品來自安化、懷化、邵陽、寧鄉(xiāng)、瀏陽地區(qū)，除懷化的剁辣椒加入少量的面油外，其余均不加油發(fā)酵，分別命名為：安化樂安（LA）、安化東坪（DP）、懷化洪江（HJ）、邵陽（SY）、寧鄉(xiāng)（NX）、瀏陽（LY）。氯化鈉、鉻酸鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、硝酸銀、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酚酞 分析純，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；甲醇、磷酸 色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；二辛醇、草酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸 色譜純，上海源葉生物科技有限公司；C7～C30正構(gòu)烷烴 美國Supelco公司。

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Waters e2695Alliance超高效液相色譜儀 美國沃特世公司；HMS-901C磁力加熱攪拌器深圳博大精科生物科技有限公司；CP114電子天平 奧豪斯儀器有限公司；KQ3200E超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；FE20K pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集和預(yù)處理 所有剁辣椒樣品均為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶采用新鮮成熟辣椒制作，發(fā)酵周期均在5～6個月，每個樣品取樣5瓶，郵寄回實驗室放4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 總酸的測定 參照GB 12456-2021《食品中總酸的測定》[11]。

1.2.3 鹽分的測定 參照GB 5009.44-2016《食品中氯化物的測定》[12]。

1.2.4 有機酸含量的測定 參考GB 5009.157-2016《食品中有機酸的測定》[13]并稍作修改。

試樣制備：稱取1.50 g剁辣椒樣品（精確0.01 g）均勻試樣，放入50 mL塑料離心管中，向其中加入20 mL水后，在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)提取2 min，隨后經(jīng)4000 r/min離心5 min，取上層提取液至50 mL容量瓶中，殘留物再用20 mL水重復(fù)提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至刻度，樣品經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾，后用于注入高效液相色譜儀分析。

標準曲線制備：分別配制酒石酸質(zhì)量濃度為12500 μg/mL、蘋果酸 25000 μg/mL、乳酸25000 μg/mL、檸檬酸 25000 μg/mL、丁二酸 62500 μg/mL 和草酸500 μg/mL的標品溶液，用0.1%磷酸溶液分別將其稀釋 25、50、125、250、500倍，得到不同濃度的有機酸標準溶液，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾注入高效液相色譜儀分析。以有機酸濃度為橫坐標，色譜峰的面積為縱坐標繪制標準曲線。

色譜條件：色譜柱：Agilent TC-C18（2）250×4.6 mm 5 μm；流動相：0.1% 磷酸溶液:甲醇=97.5:2.5（v/v）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：210 nm。

1.2.5 揮發(fā)性成分的測定 參照Xu等[14]方法并稍作修改。

萃取方法：準確稱取2.5 g剁辣椒樣品置于15 mL頂空進樣瓶中，加入3 mL飽和NaCl溶液，再加入2-辛醇（8 μL，0.16 mg/mL），用密封墊封口，渦旋振蕩30 s。隨后將其放入70 ℃加熱塊中平衡15 min，使剁辣椒揮發(fā)性組分充分揮發(fā)。然后將SPME針插入萃取瓶中推出纖維頭，保持70 ℃頂空吸附40 min，隨后迅速將萃取頭插入GC進樣口，并推出纖維頭，250 ℃解吸5 min后進行數(shù)據(jù)采集。

GC-MS 條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為 He（99.999%）,流速 1 mL/min；進樣模式：不分流；進樣口溫度250 ℃；升溫條件：40 ℃保持 3 min，以 5 ℃/min升至 150 ℃，以 10 ℃/min升至250 ℃保持5 min。離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z33～500。

定性與定量分析：定性：用AMDIS對色譜圖進行自動解卷積，得到的峰質(zhì)譜圖與NIST文庫（NIST 2011）進行比較，在相同試驗條件下測得正構(gòu)烷烴標準品的保留時間，以此計算各色譜峰的保留指數(shù)，個別與文獻值比較，確定各個色譜峰對應(yīng)的化合物。保留指數(shù)計算公式如下：

式中：I為保留指數(shù)；n為碳數(shù)；ti為待測揮發(fā)性成分的保留時間，min；tn為具有n個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，min；tn+1為具有n+1個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

定量：采用內(nèi)標法。以剁辣椒樣品中不含有的揮發(fā)性物質(zhì)2-辛醇作為內(nèi)標，按下式計算含量：

1.2.6 OAV計算方法 對每種揮發(fā)性化合物進行定量后，查詢各揮發(fā)性物質(zhì)在水中的氣味閾值[15]，計算氣味活性值（odor activity value，OAV）。

式中：OAV為物質(zhì)該的香氣活性值；Ci為該化合物在剁辣椒樣中的含量，μg/kg；OTi為該組分在水中的氣味閾值，μg/kg。當(dāng)OAV≥1時，則認定該組分對剁辣椒香氣具有重要貢獻[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果采用平均值±標準差表示，采用SPSS Statistic 26進行單因素方差分析。運用Origin 2020繪制柱狀圖。主成分分析圖采用SMICA 13.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒鹽分和總酸的差異性分析

食鹽是剁辣椒制作過程控制發(fā)酵程度、抑制腐敗、形成風(fēng)味的重要物質(zhì)。由圖1可知，不同地區(qū)剁辣椒鹽度差異顯著（P＜0.05），其中SY剁辣椒鹽度最低，僅為4.51%，NX剁辣椒鹽分最高，為12.75%。酸度直接反映了剁辣椒坯中發(fā)酵程度，是影響其滋味口感的重要指標之一。不同地區(qū)剁辣椒總酸差異顯著（P＜0.05），其中 NX 剁辣椒總酸最低，為 3.70±0.10 g/kg，SY剁辣椒總酸最高，高達12.33±0.35 g/kg。從圖1中可以看出6個不同地區(qū)剁辣椒中鹽分與總酸呈負相關(guān)關(guān)系，可能是高鹽抑制了剁辣椒發(fā)酵過程中乳酸菌生長代謝，鹽度高總酸含量低[17]。

圖1 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒鹽分和總酸變化Fig.1 Changes of salt and total acid in farm chopped peppers in different regions

2.2 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒有機酸分析

有機酸是衡量剁辣椒風(fēng)味品質(zhì)的重要指標，不同的有機酸有不同的酸味特征，如草酸有刺激性酸味、蘋果酸有特殊愉快的酸味、檸檬酸具有溫和的酸味、乳酸的酸味柔和且有后酸味，丁二酸有豆醬類的風(fēng)味等。由表1可知，不同地區(qū)剁辣椒有機酸含量呈顯著差異（P＜0.05），其中DP剁辣椒有機酸含量最高為62.04±1.49 g/kg，LA剁辣椒有機酸含量最低，僅為34.51±1.00 g/kg。乳酸含量占比最大（34.76%），檸檬酸次之（25.60%）。原因是乳酸不僅能由糖酵解途徑產(chǎn)生，還可以直接由蘋果酸脫羧生成[18-19]，同時乳酸菌可通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生乳酸。SY剁辣椒乳酸含量最高為19.91±0.76 g/kg，且SY剁辣椒鹽分最低為4.51%；說明低鹽可能更有利于發(fā)酵產(chǎn)生乳酸；而NX剁辣椒乳酸含量也達到18.45±1.16 g/kg，但其鹽度最高12.75%，這可能與NX剁辣椒所用辣椒品種及發(fā)酵時間有關(guān)[20]。

表1 不同地區(qū)剁辣椒中有機酸的含量（g/kg）Table 1 Content of organic acids in chopped peppers in different regions (g/kg)

2.3 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒中揮發(fā)性香氣成分的測定

通過GC-MS法對6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒樣品揮發(fā)性香氣成分進行檢測，其總離子流色譜圖見圖2，各樣品檢出風(fēng)味成分見表2。

圖2 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in chopped peppers in different regions analyzed by GC-MS

由表2可知6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒揮發(fā)性物質(zhì)含量有明顯差異。采用GC-MS共檢測出97種揮發(fā)性物質(zhì)，可分為 6大類：醇（9種）、醛（5種）、烯類（14種）、酯（46種）、烷烴（15種）、其他（8種）。6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒分別檢測到數(shù)量及種類差別較大，最多 57 種（LA），最少 23 種（HJ）。其中 HJ剁辣椒總揮發(fā)性成分最高為（17.73 μg/g），其次是LA剁辣椒（16.83 μg/g）、LY 剁辣椒（16.79 μg/g）、NX 剁辣椒（12.73 μg/g）、SY 剁辣椒（10.87 μg/g）、DP 剁辣椒（3.32 μg/g）；其中酯類物質(zhì)含量占比分別為56.06%、40.52%、56.52%、45.80%、61.18%、42.47%，可以看出酯類是剁辣椒中含量最高且種類最為豐富的揮發(fā)性物質(zhì)[21-22]，這與歐陽晶等[23]的研究結(jié)果一致。

表2 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒樣品揮發(fā)性成分化學(xué)組成與含量Table 2 Chemical composition and content of volatile components in samples of chopped peppers from farmhouses in different regions

續(xù)表 2

續(xù)表 2

HJ剁辣椒揮發(fā)性成分種類最少，但酯類物質(zhì)占比高達56.06%，乙酸占比高達19.40%。原因可能是HJ剁辣椒中加入少量植物油影響了揮發(fā)性物質(zhì)的揮出，使得檢測到揮發(fā)性物質(zhì)種類少，而油脂在酸性環(huán)境下又能水解成甘油和脂肪酸，使得酯類物質(zhì)和乙酸含量高[24]。

6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒共有的揮發(fā)性物質(zhì)共有5種，分別為芳樟醇、苯乙醇、乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯，可以賦予剁辣椒花香及果香[25-26]。6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒揮發(fā)性成分差異較大可能是因為所用辣椒品種及地理位置和當(dāng)?shù)刈匀话l(fā)酵微生物差別等因素造成的[27]。

2.4 不同地區(qū)剁辣椒香氣活度值分析

采用OAV表征剁辣椒中各香氣化合物對主體香氣成分的貢獻，通過文獻查詢各揮發(fā)性物質(zhì)的閾值，通過各個揮發(fā)性物質(zhì)的濃度與感官閾值的比值計算OAV值。當(dāng)OAV值≥1時，可以認為該揮發(fā)性物質(zhì)對樣品的整體風(fēng)味具有貢獻作用[28]。從表3可以看出6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒OAV值≥1的共有28種，分別為芳樟醇、苯乙醇、異戊醇、苯乙醛、苯甲醛、月桂烯、反式-β-羅勒烯、苯乙烯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、異己酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、十一酸乙酯、十四烷、乙酸、2-正戊基呋喃、愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚。LA、DP、HJ、SY、NX、LY剁辣椒特征風(fēng)味物質(zhì)（OAV≥1）數(shù)量分別為 15、7、11、7、13、13種。異己酸乙酯具有曲香、菠蘿香型的香氣[29]，在LA、HJ、NX剁辣椒中OAV＞1000，且均為最高，是LA、HJ、NX剁辣椒主要香氣成分。異戊酸乙酯具有蘋果、桑子香氣[30]，在DP剁辣椒中OAV值為最高，是構(gòu)成DP剁辣椒的主要香氣成分。周曉媛等[26]在自然發(fā)酵剁辣椒中也檢測出了類似物質(zhì)。2-甲基丁酸乙酯具有水果香味，在LY剁辣椒中OAV值為最高，是構(gòu)成LY剁辣椒的主要香氣成分。乙酸乙酯具有清靈、微帶甜果香的酒香[31]，在SY剁辣椒中OAV值為最高，是構(gòu)成SY剁辣椒的主要香氣成分。6個剁辣椒樣品共有的5種揮發(fā)性物質(zhì)中有乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯3種物質(zhì)在樣品中OAV值均大于1，說明乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯可能是構(gòu)成發(fā)酵剁辣椒香氣的主要揮發(fā)性物質(zhì)。

表3 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒樣品主要揮發(fā)性成分的OAV值Table 3 OAVs of main volatile components in the samples of farm chopped peppers in different regions

2.5 不同地區(qū)剁辣椒香氣成分的主成分分析

應(yīng)用主成分分析對不同地區(qū)的農(nóng)家剁辣椒OAV值≥1的關(guān)鍵香氣成分進行分析，主成分得分圖以散點圖為基礎(chǔ)，每個點代表一個樣品，點之間的距離代表樣品之間特征差異的大小，得到圖3不同農(nóng)家剁辣椒的主要揮發(fā)性主成分得分圖。由圖3可以看出主成分PC1和主成分PC2的方差貢獻率分別為48.5%和28.8%，累計方差貢獻為77.3%，能夠反映剁辣椒樣本的主要特征[32]?？梢钥闯雠cHJ、LA、NX剁辣椒香氣成分比較相似，原因可能是3個樣品中都含有異己酸乙酯，而異己酸乙酯的閾值比很低，僅為0.01 g/kg，使得香氣活度值（OAV）極高。DP、LY剁辣椒香氣成分較相似；SY剁辣椒香氣成分則與其它樣品差異較大，可能與在其它樣品中OAV值較高的2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、異己酸乙酯等物質(zhì)都未在SY樣品中檢測中有關(guān)。

圖3 不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒揮發(fā)性組分主成分分析得分圖Fig.3 Principal component analysis scores of volatile components of farm chopped peppers in different regions

3 結(jié)論

對湖南6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒進行了基本理化指標和揮發(fā)性成分比較分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒鹽度、總酸和有機含量差異顯著（P＜0.05），且鹽分和總酸呈負相關(guān)。采用HS-SPME-GC-MS對6個不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒揮發(fā)性成分進行了檢測分析，測出97種揮發(fā)性物質(zhì)，可分為6大類：醇（9種）、醛（5種）、烯類（14種）、酯（46種）、烷烴（15種）、其他（8種），共有成分為5種，分別為芳樟醇、苯乙醇、乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯。結(jié)合OAV分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)農(nóng)家剁辣椒關(guān)鍵香氣成分存在差異，異己酸乙酯是LA、HJ、NX剁辣椒主要香氣成分，異戊酸乙酯是DP剁辣椒中主要香氣成分，2-甲基丁酸是LY剁辣椒的主要香氣成分，乙酸乙酯是SY剁辣椒主要香氣成分。HJ、LA、NX剁辣椒風(fēng)味相近，DP、LY剁辣椒風(fēng)味相近，SY剁辣椒則與其它樣品風(fēng)味差別較大，邵陽寶慶辣椒全國有名，其余地方均有一定的地方特色，加上辣椒品種多種多樣，環(huán)境不同微生物來源也有差異，所以盡管都是傳統(tǒng)工藝制作，但剁辣椒香氣成分差異較大，下一步將研究這幾種發(fā)酵辣椒微生物的差異，借此分析微生物與風(fēng)味的關(guān)聯(lián)性，為傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒風(fēng)味保真性研究奠定基礎(chǔ)。