超高壓均質(zhì)制備大豆多肽納米乳及其粒徑和穩(wěn)定性分析

呂沛宣，廖永紅，周曉宏,

（1.北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 100081；

2.北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

納米乳液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的膠體分散體系，由互不相溶的兩相液體組成，其中一相在乳化劑的作用下形成小液滴分散到另一種液體中，液滴直徑通常小于200 nm[1-2]。乳液的許多特性，如穩(wěn)定性、流變性、外觀、顏色、質(zhì)地和保質(zhì)期等都取決于粒徑和分布[3]。液滴的布朗運(yùn)動(dòng)速率與其粒徑呈負(fù)相關(guān)，納米乳由于粒徑較小，布朗運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)可使納米乳液的小液滴克服重力實(shí)現(xiàn)均勻分布[4]，因此，納米乳液較常規(guī)乳液有著穩(wěn)定性好、光學(xué)透明度高及被包封物質(zhì)生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。許多最新的研究致力于納米乳液的制備、表征和利用作為親脂性物質(zhì)的包封和遞送系統(tǒng)[6-7]。

乳化劑對(duì)于納米乳的形成和穩(wěn)定至關(guān)重要，人們對(duì)飲食健康的關(guān)注使食品行業(yè)強(qiáng)調(diào)食品添加劑的“天然、營養(yǎng)、多功能”[8]，以天然成分代替合成成分和植物來源代替動(dòng)物來源成為趨勢(shì)。在天然植物乳化劑中，大豆蛋白因其營養(yǎng)價(jià)值高、成本低已被廣泛報(bào)道，但作為乳化劑主要應(yīng)用于高稠度乳劑如肉糜食品，在稀乳液中的應(yīng)用非常有限[9-10]，主要原因之一是許多商業(yè)大豆蛋白產(chǎn)品的溶解性和分散性差，從而降低了乳化能力[11]。與大豆蛋白相比，大豆多肽分子量更低，分子延展性更強(qiáng)，對(duì)油水界面的吸附更快，具有更好的溶解性和乳化性[12-13]，此外，大豆蛋白經(jīng)酶解后可釋放一些具有特殊生理活性的肽，如抗氧化肽[14]、抗高血壓肽[15]和降膽固醇肽[16]等，因此，可以應(yīng)用于功能食品。然而大豆多肽乳化劑研究鮮有報(bào)道，更未見市場(chǎng)應(yīng)用。

納米乳的形成需要外加能量，根據(jù)能量的多少分為低能乳化法和高能乳化法。相變溫度法、相變組分法等低能法多依賴于乳化劑和乳液組分的性質(zhì)，一般不適合工業(yè)化生產(chǎn)。高壓均質(zhì)化、高壓微射流和超聲破碎等高能法為制備納米級(jí)液滴提供了克服界面能壘所需的機(jī)械能，可用于大規(guī)模的商業(yè)食品加工。其中超高壓均質(zhì)是一種應(yīng)用于流體處理的新技術(shù)，可有效減小液滴尺寸，增強(qiáng)乳液的物理和氧化穩(wěn)定性[17-18]，并且對(duì)營養(yǎng)價(jià)值和感官特性的影響最小[19]，然而尚未有關(guān)于超高壓均質(zhì)技術(shù)用于制備大豆多肽納米乳的報(bào)道。

因此，本研究的主要目的集中在兩個(gè)方面：超高壓均質(zhì)技術(shù)制備大豆多肽納米乳液的影響因素分析并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件以制備穩(wěn)定的小粒徑乳液；納米乳的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和微觀形貌表征。研究為多肽乳化劑在食品中的應(yīng)用及多肽納米乳的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白（純度≥90%） 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶（6.4×105U/mL）諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；酪蛋白 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；金龍魚大豆油 益海嘉里食品營銷有限公司；ProClean 950抑菌防腐劑 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

HR-6B高速勻漿機(jī) 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；UV-9600紫外/可見分光光度計(jì) 北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；EmulsiFlexC3超高壓納米均質(zhì)機(jī) 加拿大Avestin公司；納米粒度及zeta電位分析儀 ZS90英國馬爾文公司；Cypher VRS多功能單分子力譜儀 英國牛津儀器集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆多肽乳化劑的酶法制備 大豆分離蛋白按11%（w/v）分散于去離子水中，1 mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，添加2%（v/w）底物濃度的堿性蛋白酶酶解8 h后100 ℃水浴加熱滅酶10 min獲得大豆多肽分散液，凱氏定氮法[20]確定多肽質(zhì)量濃度為90 mg/mL，甲醛滴定法[21]測(cè)得水解度為17%，4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 納米乳液制備 使用高速勻漿機(jī)將稀釋到所需質(zhì)量濃度的多肽分散液和大豆油以97:3（v/v）的比例在23000 r/min下預(yù)混2 min得到粗乳液，然后將粗乳液立即轉(zhuǎn)移到超高壓均質(zhì)機(jī)中，在不同的均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)下制備大豆多肽納米乳液。

1.2.3 乳液粒徑和分布測(cè)試 使用納米粒度分析儀測(cè)定大豆多肽納米乳液的平均粒徑和分布，用去離子水將大豆多肽納米乳液稀釋100倍，以避免多重光散射效應(yīng)。參數(shù)設(shè)定：分散相折射率設(shè)置為RI-1.450，連續(xù)相折射率設(shè)置為RI-1.330，測(cè)定乳液平均粒徑和多分散性指數(shù)（particle distribution index，PDI）。

1.2.4 物理穩(wěn)定性測(cè)定 離心穩(wěn)定性常數(shù)（Ke）是確定納米乳液物理穩(wěn)定性的最常用指標(biāo)之一，Ke值越低，納米乳液的物理穩(wěn)定性越好。按照Li等[22]的方法，將納米乳液用去離子水稀釋100倍，在離心機(jī)中以2000 g離心20 min，從離心管底部取5 mL樣品并用渦旋混合器混合5 s，利用分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣品在500 nm波長處的吸光度。Ke值計(jì)算公式如下：

式中：A0和A分別為稀釋的納米乳離心前后的吸光度值。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 多肽質(zhì)量濃度對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響 取 194 mL質(zhì)量濃度分別為 5、10、30、60和90 mg/mL的大豆多肽分散液與6 mL豆油制備粗乳液，然后以60 MPa的壓力均質(zhì)3次，測(cè)定乳液粒徑、PDI和Ke值。

1.2.5.2 均質(zhì)壓力對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響取194 mL稀釋到10 mg/mL的大豆多肽分散液與6 mL豆油制備粗乳液，分別以0、60、120和180 MPa的壓力循環(huán)均質(zhì)3次，測(cè)定乳液粒徑、PDI和Ke值。

1.2.5.3 循環(huán)次數(shù)對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響取194 mL稀釋到10 mg/mL的大豆多肽分散液與6 mL豆油制備粗乳液，以60 MPa的壓力分別循環(huán)均質(zhì)1、3、5、7和9次，測(cè)定乳液粒徑、PDI和Ke值。

1.2.6 正交試驗(yàn) 為優(yōu)化大豆多肽納米乳的制備工藝，以納米乳的平均粒徑和Ke為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了3因素3水平的正交試驗(yàn)，如表1所示。

表1 大豆多肽納米乳超高壓制備工藝正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design for optimization of SPIH nanoemulsion prepared by UHPH

1.2.7 原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）表征納米乳形貌 通過Cypher VRS多功能單分子力譜儀觀察樣品的形貌，使用Gwyddion軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析。樣品用蒸餾水稀釋100倍，在云母片上滴加5 μL至自然干燥，將樣品固定在金屬板上并以輕敲模式觀察，驅(qū)動(dòng)頻率設(shè)置為300 kHz，掃描頻率設(shè)置為1.0 Hz。

1.2.8 儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)試 通過測(cè)定納米乳在4 ℃下儲(chǔ)存0～56 d（每7 d測(cè)一次）的粒徑變化，考察其儲(chǔ)存穩(wěn)定性，設(shè)置不添加防腐劑和添加0.1% ProClean 950抑菌防腐劑兩組實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，圖表由Origin 2021軟件生成，使用SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析，確定數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆多肽質(zhì)量濃度對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響

納米乳液滴的形成與穩(wěn)定需要多肽吸附在油水界面并形成界面膜，多肽質(zhì)量濃度對(duì)乳液粒徑和分布的影響如圖1a所示，粒徑隨其濃度增加而逐漸增大，PDI則先降后升。多肽在油水界面上不同于傳統(tǒng)乳化劑的單層排布，而是由于分子間相互作用在“油核”外層形成網(wǎng)狀的“肽殼”結(jié)構(gòu)[23]，多肽濃度增加使得殼層增厚及液滴間的聚集，從而導(dǎo)致粒徑增大和分布變寬。同樣的也可以解釋Ke值隨多肽濃度增加而減小（圖1b），因?yàn)榻缑娴膶訝铍挠欣诰S持乳液穩(wěn)定性[24]，多肽濃度低時(shí)形成的界面膜抗性差導(dǎo)致離心時(shí)發(fā)生破乳，難以維持乳液穩(wěn)定，而高多肽濃度形成的液滴則可承受較大離心力。因此，對(duì)于多肽乳化劑濃度的選擇要兼顧粒徑和穩(wěn)定性兩個(gè)指標(biāo)。

圖1 多肽質(zhì)量濃度對(duì)納米乳粒徑和分布（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.1 Effects of SPIH concentration on nanoemulsion particle size, distribution (a) and stability (b)

2.2 均質(zhì)壓力對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響

均質(zhì)壓力是納米乳液制備的重要加工參數(shù)，如圖2所示，納米乳粒徑、PDI和Ke值均隨均質(zhì)壓力升高而先減小后增大。壓力由0到60 MPa，粒徑由672 nm降至 236 nm、PDI由 0.600降至 0.242、Ke值由66%降至22%，變化極顯著（P＜0.01），說明超高壓均質(zhì)處理是減小大豆多肽乳液粒徑、促使液滴均勻分布和提高穩(wěn)定性的有效手段。隨著壓力增大，均質(zhì)機(jī)產(chǎn)生的撞擊、剪切和空化效應(yīng)增強(qiáng)，油相被破碎成更小的液滴并增強(qiáng)表面活性劑在液滴表面的吸附[25]，小粒徑乳液通常有著較好的穩(wěn)定性，在120 MPa下粒徑和Ke值均出現(xiàn)最低點(diǎn)。然而當(dāng)壓力升至180 MPa，粒徑反而增大同時(shí)穩(wěn)定性降低（P＜0.05），在Wang等[26]的報(bào)道中也提到這一現(xiàn)象，推測(cè)是過度的均質(zhì)壓力造成小顆粒相互吸引和聚集。如果液滴碰撞速度較表面活性劑吸附速率更快，則新界面不會(huì)被完全覆蓋，從而導(dǎo)致聚結(jié)[27]。這意味著雖然乳化過程中的能量輸入增加了，但得到的乳狀液具有更大的粒徑，并非預(yù)期的更小的尺寸。

圖2 均質(zhì)壓力對(duì)納米乳粒徑和分布（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.2 Effects of homogenization pressure on nanoemulsion particle size, distribution (a) and stability (b)

2.3 循環(huán)次數(shù)對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響

循環(huán)次數(shù)與加工耗時(shí)密切相關(guān)，確定合理的循環(huán)次數(shù)有利于在最短時(shí)間內(nèi)獲得產(chǎn)品。由圖3可看出，大豆多肽納米乳的粒徑、PDI和Ke值在1～3次循環(huán)內(nèi)減小極顯著（P＜0.01），5次循環(huán)出現(xiàn)各項(xiàng)最小值，但隨后波動(dòng)性增加。少數(shù)循環(huán)時(shí)的粒徑減小、分布變均勻和穩(wěn)定性增強(qiáng)是由于超高壓均質(zhì)持續(xù)向乳液輸出克服表面張力形成小液滴的能量，但循環(huán)次數(shù)增加，液滴在較大壓力下持續(xù)碰撞和接觸可能發(fā)生聚集，造成粒徑增大和分布不均，同時(shí)對(duì)乳液穩(wěn)定也無益，這與耿宏慶等[28]采用高壓微射流制備乳液的結(jié)果一致。9次循環(huán)時(shí)各指標(biāo)較7次明顯下降推測(cè)是聚集體再次被分散，這可能是多肽乳化劑區(qū)別于傳統(tǒng)乳化劑的納米乳加工過程，王玙璇等[29]以卵磷脂為乳化劑采用高壓均質(zhì)法制備神經(jīng)酰胺納米乳，7次循環(huán)后粒徑無明顯變化。

圖3 循環(huán)次數(shù)對(duì)納米乳粒徑和分布（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.3 Effects of cycle number on nanoemulsion particle size,distribution (a) and stability (b)

2.4 大豆多肽納米乳超高壓制備工藝參數(shù)優(yōu)化

大豆多肽納米乳超高壓制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，根據(jù)極差（R）分析得到各因素對(duì)納米乳粒徑影響主次順序?yàn)锳＞C＞B，即多肽質(zhì)量濃度＞循環(huán)次數(shù)＞均質(zhì)壓力，最優(yōu)組合為A1B3C2；各因素對(duì)納米乳物理穩(wěn)定性影響主次順序?yàn)锳＞B＞C，即多肽質(zhì)量濃度＞均質(zhì)壓力＞循環(huán)次數(shù)，最優(yōu)組合為A3B3C2。兩指標(biāo)結(jié)果差異集中在多肽質(zhì)量濃度上，同時(shí)該因素也是最主要影響因素，為制備穩(wěn)定的小粒徑納米乳，運(yùn)用綜合平衡法確定綜合最佳工藝條件為A2B3C2，即多肽質(zhì)量濃度 20 mg/mL，均質(zhì)壓力 140 MPa，循環(huán)次數(shù)5次。按該方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，納米乳粒徑為178.8 nm，Ke值為7.37%。

表2 大豆多肽納米乳超高壓制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of SPIH nanoemulsion prepared by UHPH

2.5 大豆多肽納米乳液的表面形貌

在正交試驗(yàn)中多肽濃度是最主要的影響因素，為觀察納米乳微觀形貌并進(jìn)一步探究多肽濃度對(duì)納米乳粒徑的影響，采用AFM表征納米乳液的形貌和液滴分布，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置多肽濃度不同的兩組實(shí)驗(yàn)：在140 MPa和5次循環(huán)下分別制備了多肽質(zhì)量濃度為20和30 mg/mL的乳液，圖像如圖4所示。圖4a可以觀察到稀釋100倍的乳液液滴呈規(guī)整球狀均勻分布在云母片表面，偶有少量聚集，不算聚集體在內(nèi)，每測(cè)量面積（1×1 μm）的顆粒數(shù)為 67，Nano Measurer軟件計(jì)算的平均直徑僅為46.80 nm。根據(jù)瑞麗散射定律，團(tuán)聚體對(duì)小液滴有光強(qiáng)掩蔽作用，因此，推測(cè)SPIH納米乳液的實(shí)際液滴尺寸可能小于激光粒度儀測(cè)算值，Cheng等[23]也有同樣的猜測(cè)。圖4b中可明顯看到聚集現(xiàn)象多于圖4a，驗(yàn)證了多肽質(zhì)量濃度的增加導(dǎo)致液滴聚結(jié)的推測(cè)。此外，還發(fā)現(xiàn)液滴直徑遠(yuǎn)大于其高度，其原因可能是多肽構(gòu)成彈性界面膜，干燥后液滴在重力作用下從球形變成了“餅狀”。AFM圖像表明正交優(yōu)化條件制備的大豆多肽納米乳具有較小粒徑和均勻分布。

圖4 納米乳稀釋100倍的AFM相位圖和形貌圖Fig.4 Phase image and morphology image of the nanoemulsion diluted 100 times

2.6 納米乳儲(chǔ)存穩(wěn)定性

儲(chǔ)存穩(wěn)定性關(guān)乎乳液的保質(zhì)期，記錄了正交最優(yōu)組合條件下制備的納米乳液在無防腐劑和有防腐劑兩種情況下，4 ℃下儲(chǔ)存56 d內(nèi)液滴尺寸的變化。圖5顯示添加防腐劑后，粒徑在56 d內(nèi)無顯著變化（P＞0.05），未添加防腐劑組乳液粒徑則不斷增大。乳液外觀可表征其宏觀穩(wěn)定性，添加防腐劑組在儲(chǔ)存過程中外觀無變化，對(duì)照組在變質(zhì)情況下僅底部出現(xiàn)一薄層乳析層（圖6）。相較于大豆蛋白納米乳在儲(chǔ)存期間粒徑不斷增大[30]，以及超聲制備的大豆多肽納米乳在28 d時(shí)粒徑發(fā)生顯著變化[13]，超高壓均質(zhì)制備的大豆多肽納米乳表現(xiàn)出更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，多肽在界面上形成的彈性膜可有效阻止油滴的橋接絮凝和聚結(jié)[31]。對(duì)照組液滴大小增加可能是多肽被微生物分解成氨基酸或短肽，其乳化性能較差[32]，且微生物活動(dòng)也對(duì)激光粒度測(cè)量產(chǎn)生影響，推測(cè)實(shí)際粒度小于測(cè)量值，可對(duì)應(yīng)其乳析層較薄現(xiàn)象。

圖5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)納米乳粒徑的影響Fig.5 Effect of storage time on nanoemulsion particle size

圖6 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)納米乳液外觀的影響Fig.6 Effect of storage time on appearance of nanoemulsions

3 結(jié)論

為開發(fā)大豆多肽作為食品乳化劑的應(yīng)用潛力，本研究以超高壓均質(zhì)技術(shù)為加工手段制備大豆多肽納米乳。探究了多肽質(zhì)量濃度、均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)單因素條件對(duì)納米乳平均粒徑、粒度分布和物理穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：多肽濃度增加導(dǎo)致粒徑增大和分布不均，但有利于乳液穩(wěn)定，這是因?yàn)槎嚯姆肿娱g存在相互作用，濃度增加時(shí)界面膜增厚同時(shí)發(fā)生聚集；各指標(biāo)隨均質(zhì)壓力增大先降低后升高，120 MPa時(shí)乳液粒徑最小最穩(wěn)定；少數(shù)循環(huán)可顯著降低粒徑、PDI和Ke值，5次循環(huán)最佳，多次循環(huán)后指標(biāo)波動(dòng)性變化。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素對(duì)粒徑影響順序?yàn)槎嚯馁|(zhì)量濃度＞循環(huán)次數(shù)＞均質(zhì)壓力，對(duì)乳液穩(wěn)定性影響順序?yàn)槎嚯馁|(zhì)量濃度＞均質(zhì)壓力＞循環(huán)次數(shù)，由于多肽質(zhì)量濃度對(duì)粒徑和穩(wěn)定性的影響相反，最終綜合平衡確定超高壓均質(zhì)技術(shù)制備大豆多肽納米乳的最佳工藝條件：20 mg/mL多肽質(zhì)量濃度，140 MPa均質(zhì)壓力和5次循環(huán)，在此條件下制備的納米乳液粒徑為178.8 nm，Ke=7.37%，可維持56 d的穩(wěn)定，AFM圖像顯示乳液液滴分布均勻，多肽界面為彈性膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)驗(yàn)證了多肽質(zhì)量濃度增加會(huì)導(dǎo)致液滴聚集。因此，大豆多肽是一種有潛力的食品乳化劑，超高壓均質(zhì)技術(shù)制備的大豆多肽納米乳也有望作為包封系統(tǒng)應(yīng)用于食品工業(yè)。