天水大紅袍花椒籽黑色素的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性分析

盧利平，雷佳欣，楊 琦，洪金瑤，高丹丹, ，臧榮鑫

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730030）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科花椒屬植物，常用作調(diào)味香料[1-3]，花椒籽作為花椒生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，占其總質(zhì)量的60%左右[4]。黑色素廣泛分布于動植物中，是酚類物質(zhì)的氧化和聚合過程中產(chǎn)生的一類黑色和棕色高分子化合物的統(tǒng)稱[5]，是一種普遍存在于動植物及微生物中的保護(hù)性色素[6]。我國種植的花椒籽種皮中含有大量的天然黑色素[7]，研究表明，花椒籽黑色素是優(yōu)良的天然抗氧化劑，具有提升人體免疫力、保護(hù)神經(jīng)以及清除自由基等多種作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果相當(dāng)顯著，可作為生物保鮮劑進(jìn)行開發(fā)，對人體健康作用重要[8-9]，因而對生產(chǎn)生活中具有巨大的開發(fā)價值和應(yīng)用潛力。

目前，國內(nèi)外的研究者大多是針對黑芝麻[10]、牡丹籽[11-12]、山杏種皮[13]、山杏核殼[14]、香蕉皮[15]中黑色素進(jìn)行研究，為開發(fā)功能食品添加劑、醫(yī)藥和美妝產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)，同時也為工業(yè)化生產(chǎn)推廣提供了可能性?；ń纷押谏氐难芯恐饕性诠に囂崛『彤a(chǎn)品制備等方面[16-18]，楊秀芳等[19]優(yōu)化花椒籽中黑色素的提取工藝，在料液比為1:20 g/mL、NaOH濃度為1.3 mol/L、提取溫度為90 ℃、提取時間為1 h的條件下，花椒籽種皮黑色素的提取率達(dá)到8.63%。天水大紅袍花椒作為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢花椒品種，產(chǎn)量大，花椒籽是主要的副產(chǎn)物，但關(guān)于天水大紅袍花椒籽黑色素的提取與檢測未見報道，資源利用率利用率不高，大紅袍花椒籽的潛在附加值未被發(fā)掘。

因此，本文以天水大紅袍花椒籽為原料，考察NaOH 濃度、提取溫度、料液比、提取時間四個因素對天水 大紅袍花椒籽黑色素得率的影響，以下簡稱花椒籽黑 色素，響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件并對其抗氧化性進(jìn)行評 價，以期為天水大紅袍花椒籽黑色素的進(jìn)一步綜合開 發(fā)與利用提供理論支撐，拓寬山區(qū)椒農(nóng)的經(jīng)濟(jì)來源， 并助力夯實(shí)脫貧攻堅(jiān)工作成效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大紅袍花椒籽（DahongpaoZanthoxylum bungeanumseeds） 采購自甘肅省天水市甘谷縣花椒交易市場；氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、丙酮、石油醚、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水（均為分析純）、VC蘭州市奧科生物技術(shù)有限公司。

XS-04多功能粉碎機(jī) 上海兆申科技有限公司；Dor Yang DA型電子分析天平 渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；752N紫外-可見光分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋、PH-010A恒溫干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花椒籽黑色素提取工藝流程 大紅袍花椒籽干燥→粉碎過篩→脫脂處理→超聲提取→離心→黑色素提取液

1.2.2 花椒籽的預(yù)處理 花椒籽去除葉、梗等雜質(zhì)后清洗烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩進(jìn)行篩選?；ń纷逊勰┌戳弦罕?:3 g/mL加入石油醚，抽提過夜，過濾后風(fēng)干，4 ℃低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 提取溶劑的選擇 參考李榮等[18]的實(shí)驗(yàn)方案，并加以改良，分別稱取0.10 g花椒籽粉末于5個三角瓶中，分別加入蒸餾水、丙酮、無水乙醇、0.1 mol/L的NaOH溶液、1 mol/L的鹽酸溶液，60 ℃水浴浸提8 h，料液比采用1:50 g/mL。過濾后，濾液以4000 r/min離心30 min，去除沉淀。靜置，觀察上清液顏色，在438 nm處測定吸光度，確定最佳提取溶劑。

1.2.4 花椒籽黑色素的提取工藝 參考楊秀芳等[19]的實(shí)驗(yàn)方案，稱取2.00 g大紅袍花椒籽粉末于離心管中，根據(jù)一定料液比加入NaOH溶劑，在在超聲頻率40 kHz，一定溫度條件下，提取一定時間。提取結(jié)束后，浸提液 4000 r/min離心 30 min，取上清液，加入適量稀鹽酸溶液調(diào)pH至2.0，靜止沉淀3 h，4000 r/min再次離心30 min，過濾收集沉淀，用蒸餾水沖洗后烘干至恒重，即為花椒籽黑色素，4 ℃保存。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 參考石長春等[20]的實(shí)驗(yàn)方法，采用改良的堿溶酸沉法，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)提取大紅袍花椒籽中黑色素，每個水平重復(fù)三次。固定料液比1:20 g/mL，提取溫度 45 ℃，提取時間 2 h，提取2次，考察 NaOH 濃度（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mol/L）對花椒籽黑色素得率的影響；固定NaOH濃度1.2 mol/L，提取溫度45 ℃，提取時間2 h，提取2次，考察料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）對花椒籽黑色素得率的影響；固定NaOH濃度1.2 mol/L，料液比 1:25 g/mL，提取時間 2 h，提取2 次，考察提取溫度（45、50、55、60、65 ℃）對花椒籽黑色素得率的影響；固定NaOH濃度1.2 mol/L，料液比1:25 g/mL，提取溫度55 ℃，提取2次，考察提取時間（1、1.5、2.0、2.5、3 h）對花椒籽黑色素得率的影響；固定NaOH濃度1.2 mol/L，料液比1:25 g/mL，提取溫度55 ℃，提取時間2 h，考察提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對花椒籽黑色素得率的影響；每個水平重復(fù)三次。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、NaOH 濃度（D）為自變量 X，大紅袍花椒籽黑色素得率為因變量Y，使用DesignExpert設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化大紅袍花椒籽黑色素的提取工藝，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 花椒籽黑色素提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Response surface experimental design for extraction of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

1.2.7 花椒籽黑色素體外抗氧化活性分析

1.2.7.1 ·OH清除率的測定 參照王國良等[21]的方法，測定花椒籽黑色素對·OH的清除活性。

1.2.7.2 DPPH 自由基清除率的測定 參照Saiga等[22]的方法，測定花椒籽黑色素對DPPH·的清除活性。

1.2.7.3 ABTS+自由基清除率的測定 參照劉鑫等[23]的方法，測定花椒籽黑色素對ABTS+自由基的清除活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Office Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Origin 2019b繪圖，Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

參考Ma等[24]的方法，鹽酸、無水乙醇、丙酮三種有機(jī)溶劑作為常規(guī)提取試劑，在物質(zhì)浸提方面有較好的效果，此處用來進(jìn)行黑色素的提取，尋找最優(yōu)的提取試劑。

由表2可知，黑色素在蒸餾水、鹽酸溶液、無水乙醇和丙酮中幾乎不溶解，NaOH溶液提取花椒籽黑色素，得到淺棕色溶液，且吸光度0.263明顯高于其它溶劑，因此，實(shí)驗(yàn)中選用NaOH溶液作為提取溶劑。

表2 提取溶劑對花椒籽黑色素提取的影響Table 2 Effect of extraction solvent on extraction of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaOH濃度對花椒籽黑色素得率的影響 由圖1A可知，隨NaOH濃度的提高，總花椒籽黑色素得率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，當(dāng)NaOH濃度達(dá)到1.2 mol/L時，花椒籽黑色素得率最高，達(dá)到5.87%。NaOH濃度大于1.2 mol/L時，花椒籽黑色素得率開始下降。由此可見在一定范圍內(nèi)，提高NaOH溶液的濃度有利于黑色素的提取。但NaOH溶液濃度過高時可能會提取出其他物質(zhì)，其他物質(zhì)與黑色素發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致黑色素含量下降[25-26]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律，在Box-Behnken中心組試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，NaOH濃度選取0.9～1.5 mol/L。

2.2.2 料液比對花椒籽黑色素得率的影響 由圖1B可知，隨著料液比從1:15 g/mL增加到1:25 g/mL，花椒籽黑色素的得率逐漸增大，但料液比從1:25 g/mL增加到1:35 g/mL時，花椒籽黑色素的得率呈下降趨勢，這是因?yàn)檫m當(dāng)增加提取劑的量有利于黑色素在提取液中的溶解，從而降低黑色素的損失率，此后由于溶劑的增加，會生成一定量的雜質(zhì)，而這些生成的雜質(zhì)會與黑色素反應(yīng)，使黑色素的提取率下降[27]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律，在Box-Behnken中心組試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，料液比選取1:20～1:25 g/mL。

2.2.3 提取溫度對花椒籽黑色素得率的影響 由圖1C可知，隨著提取溫度的升高，花椒籽黑色素的得率逐漸上升，在提取溫度達(dá)到55 ℃時，花椒籽黑色素的提取率達(dá)到最高為6.35%，繼續(xù)升高溫度，花椒籽黑色素得率反而大幅度下降至5.17%。這是由于植物性黑色素作為一種抗氧化劑，具有較強(qiáng)還原性，在高溫下極易氧化變性，55 ℃后提取率急劇下降的原因可能是提取溫度過高導(dǎo)致部分黑色素氧化變性，結(jié)構(gòu)被破壞[28]。因此，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律，在Box-Behnken中心組試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，提取溫度選取 50～60 ℃。

2.2.4 提取時間對花椒籽黑色素得率的影響 由圖1D可知，提取時間1～2 h，花椒籽黑色素得率由5.68%上升至6.35%，在浸提時間達(dá)到2 h時，花椒籽黑色素得率最高，之后隨著提取時間的延長，花椒籽黑色素得率反而呈下降趨勢。由此可見在一定范圍內(nèi)，延長提取時間有利于花椒籽黑色素的提取。原因可能是在達(dá)到最佳提取時間后，繼續(xù)增加提取時間，花椒籽黑色素得率下降，而且會影響后續(xù)提純[29]。為了提高花椒籽黑色素得率，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律，在Box-Behnken中心組試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，提取時間選取 1.5～2.5 h。

2.2.5 提取次數(shù)對花椒籽黑色素得率的影響 如圖1E所示，在固定NaOH濃度1.2 mol/L，料液比1:25 g/mL，提取溫度55 ℃，提取時間2 h的條件下，隨著提取次數(shù)增加，大紅袍花椒籽黑色素得率上升0.04%后保持不變，可見黑色素得率基本不受提取次數(shù)的影響，這與徐文秀等[30]報道的運(yùn)城花椒籽黑色素的提取結(jié)果一致。原因可能是花椒籽黑色素在當(dāng)前濃度下的NaOH溶液中溶解度極高，一次浸提可以使花椒籽中的黑色素基本溶出，后續(xù)的多次浸提并不能使花椒籽黑色素的提取率大幅度提升。綜合考慮，選擇最佳提取次數(shù)為1次。

圖1 單因素對花椒籽黑色素的影響Fig.1 Effects of single factors on the yield of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化花椒籽黑色素提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過Design-Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)，以提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、NaOH濃度（D）為自變量，以花椒籽黑色素得率為響應(yīng)值，根據(jù)四因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)29個試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，其中3、7、13、15、27是中心試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Scheme and results of response surface design

2.3.2 模型的建立與顯著性分析 通過Design Expert 8.06軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到花椒籽黑色素提取液的提取溫度、提取時間、料液比、NaOH濃度四因子多項(xiàng)式擬合回歸方程為：

Y=7.46-1.03A-0.45B+0.062C-0.83D+0.63AB+0.24AC+0.91AD-0.14BC+0.55BD-1.06CD-2.76A2-2.49B2-2.04C2-2.09D2。

對二次方程進(jìn)行方差分析結(jié)果見表4。從表4的分析結(jié)果可以看出，A、B、D、AB、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2因素對花椒籽黑色素得率影響極顯著（P＜0.01），AC 影響顯著（P＜0.05），表明提取溫度、提取時間、NaOH濃度這3個因素對花椒籽黑色素得率的影響極顯著（P＜0.01），其中提取溫度和料液比的交互作用也會對花椒籽黑色素得率有顯著影響（P＜0.05）。由方差分析結(jié)果可知，整體模型的P＜0.0001，差異極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P值為0.0589，不顯著（P＞0.05），表明該模型的擬合度較好，可以用于天水大紅袍花椒籽黑色素得率理論值的進(jìn)一步預(yù)測。該模型的決定系數(shù)R2=0.9982和R2Adj=0.9961，表明預(yù)測值與真實(shí)值有較高的相關(guān)性且擬合度較好，而變異系數(shù)CV=3.71%，說明試驗(yàn)可操作性較強(qiáng)。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

綜上所述，此模型可以用來分析和預(yù)測天水大紅袍花椒籽黑色素得率的真實(shí)情況。由F值可知，各因素對天水大紅袍花椒籽黑色素得率的影響次序：A＞D＞B＞C，即提取溫度＞NaOH濃度＞提取時間＞料液比。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)曲面圖可以直觀反映提取溫度、提取時間、料液比、NaOH濃度對大紅袍花椒籽黑色素得率的影響。對比圖2～圖7，提取溫度、提取時間、NaOH濃度對大紅袍花椒籽黑色素得率的影響是顯著的，但料液比響應(yīng)面相對平緩，說明其對大紅袍花椒籽黑色素得率的影響最小。交互效應(yīng)強(qiáng)弱程度可以從投影面的等高線形狀中觀察，圓形為交互作用不顯著，橢圓則為交互作用顯著。從圖2、圖4、圖6、圖7中可以看出，AB、AD、BD、CD曲面傾斜度比較大，而且越是靠近曲面頂端，顏色越深，表示兩因素的交互作用顯著[31]；AC曲面傾斜度次之（圖3），表示提取溫度與料液比的交互作用比較顯著；BC等高線橢圓形狀不明顯（圖5），表明其交互作用不顯著，這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

圖2 提取溫度與提取時間對花椒籽黑色素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots of extraction temperature and extraction time on the yield of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

圖3 提取溫度與料液比對花椒籽黑色素得率得率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots of extraction temperature and solid-liquid ratio on the yield of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

圖4 提取溫度與NaOH濃度對花椒籽黑色素得率得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of extraction temperature and concentration of NaOH on the yield of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

圖5 提取時間與料液比對花椒籽黑色素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of extraction time and solidliquid ratio on the yield of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

圖6 提取時間與NaOH濃度對花椒籽黑色素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of extraction time and concentration of NaOH on the yield of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

2.4 最佳提取工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6.軟件對回歸方程進(jìn)行分析后，得到最佳工藝條件：NaOH濃度1.114 mol/L，溫度 58.75 ℃，料液比 1:23.32 g/mL，提取時間2.104 h，提取1次。此時花椒籽黑色素提取率的理論最大值為7.75%。考慮實(shí)際情況，將條件調(diào)整為：NaOH濃度 1.11 mol/L，提取溫度 59 ℃，料液比1:23 g/mL，提取時間2 h，提取1次。為進(jìn)一步確定響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，在調(diào)整后的工藝條件下做3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到天水大紅袍花椒籽黑色素得率為7.60%±0.05%。結(jié)果表明，經(jīng)過回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值的RSD值為0.66%，相較于楊秀芳等[19]所采用的工藝條件提取的黑色素得率低0.97%，但本實(shí)驗(yàn)所采用的NaOH濃度和提取溫度與此前研究相比也較低，對于黑色素的結(jié)構(gòu)破壞較小，可見采用響應(yīng)面法對天水大紅袍花椒籽黑色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化具有可行性。

2.5 抗氧化活性研究結(jié)果

結(jié)果如圖8A所示，花椒籽黑色素和VC對·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，質(zhì)量濃度在1.0 mg/mL時，花椒籽黑色素對·OH的清除率達(dá) 66.07%±0.96%，其 IC50為 0.71 mg/mL；如圖8B及圖8C所示，VC對DPPH·和ABTS+·的清除效果很好，而質(zhì)量濃度在1.0 mg/mL時，花椒籽黑色素對DPPH·和ABTS+·的清除率分別達(dá)到61.27%±0.97%、62.19%±0.83%，其IC50分別為0.67、0.63 mg/mL，略高于四川金陽花椒籽黑色素的抗氧化活性研究結(jié)果[32]。

圖8 花椒籽黑色素的體外抗氧化活性Fig.8 Antioxidant activity of melanin from Zanthoxylum bungeanum seeds

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析法相結(jié)合的方法，對天水大紅袍花椒籽黑色素進(jìn)行超聲輔助提取工藝優(yōu)化，研究了NaOH濃度、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)對于天水大紅袍花椒籽黑色素得率的影響，分析結(jié)果得到，NaOH濃度、提取溫度、提取時間對天水大紅袍花椒籽黑色素得率的影響極顯著（P＜0.01），料液比對天水大紅袍花椒籽黑色素得率的影響不顯著（P＞0.05），優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為：NaOH濃度1.11 mol/L，提取溫度59 ℃，料液比1:23 g/mL，提取時間2 h，提取1次。在此條件下，天水大紅袍花椒籽黑色素的得率7.60%±0.05%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天水大紅袍花椒籽黑色素對·OH、DPPH·以及 ABTS+·均具有良好的清除活性，是一種良好的天然抗氧化劑。日后的研究可以針對花椒籽黑色素的純化工藝，為天水大紅袍花椒籽黑色素的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論依據(jù)，拓寬山區(qū)椒農(nóng)的經(jīng)濟(jì)來源，并助力夯實(shí)脫貧攻堅(jiān)工作。