腐乳中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與生物胺的相關(guān)性分析

王維亞，劉玉婷，萬漢坤，駱 瑜，林智超，劉 杰，李金林

（1.南昌市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，南昌市食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330012；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022）

腐乳是以大豆為主要原料，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵工藝制作而成的一種傳統(tǒng)食品，其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富[1]，是人們餐桌上的一道美食。在腐乳發(fā)酵過程中，大豆中的蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉等大分子物質(zhì)在微生物分泌的各種酶類作用下分解成游離氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)[2]，促進(jìn)了有效成分的吸收利用，同時(shí)，也產(chǎn)生了多種抗氧化、抗誘變等生物活性因子[3-4]。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中普遍存在生物胺，尤其是原料富含蛋白質(zhì)的豆豉、臭豆腐、腐乳[5-7]，奶酪和發(fā)酵香腸等[8-9]，主要通過微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于對(duì)應(yīng)的氨基酸而產(chǎn)生。生物胺會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響，高濃度的生物胺會(huì)引起惡心、頭痛、血壓變化等不適癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)對(duì)心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆的損害[10]。腐乳中常見的生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺[11]，某些市售腐乳中生物胺含量超過了1000 mg/kg[12]，有文獻(xiàn)報(bào)道[13]食用生物胺含量超過1000 mg/kg的食品可能對(duì)健康產(chǎn)生不利影響。發(fā)酵食品的原輔料、制作工藝以及環(huán)境中的微生物是影響其生物胺種類和含量的主要因素[14]。腐乳半開放式的發(fā)酵條件和漫長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間給其體系帶來了大量環(huán)境中的微生物[15]，其中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物對(duì)生物胺形成起著重要作用。因此，通過分析腐乳中微生物群落結(jié)構(gòu)，有助于了解生物胺形成機(jī)理。

以往對(duì)腐乳中生物胺的研究主要集中在生物胺的含量測(cè)定[16]以及產(chǎn)胺菌株的分離鑒定[17]方面，關(guān)于腐乳中微生物群落結(jié)構(gòu)與生物胺含量的相關(guān)性研究報(bào)道較少。因此，本文以不同生物胺含量的腐乳為研究對(duì)象，測(cè)定腐乳中的pH、總酸、氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)，通過Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，解析腐乳的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，對(duì)理化性質(zhì)和微生物多樣性進(jìn)行相關(guān)性分析，探究生物胺與微生物菌群之間的關(guān)系，為評(píng)價(jià)腐乳質(zhì)量安全和從微生物角度闡明生物胺的形成機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6種腐乳 市售，產(chǎn)地均為江西，根據(jù)課題組前期對(duì)其生物胺含量的測(cè)定結(jié)果[18]將其分成高生物胺和低生物胺組別（以生物胺含量1000 mg/kg作為標(biāo)準(zhǔn)[13]），樣品具體信息見表1；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醛溶液 分析純，西隴化工股份有限公司；DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)系列試劑 北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；Axy Prep DNA Gel Extraction Kit 美國(guó)Axygen公司。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

S220型多參數(shù)測(cè)試儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；MIKRO 220R型微量超高速冷凍離心機(jī) Andreas Hettich公司；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀 美國(guó)ABI公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)美國(guó)Promega公司；MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 使用DNA提取試劑盒提取腐乳樣品的基因組DNA，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增 16S rDNA 基因的V3～V4可變區(qū)[19]。熱循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)27次后，72 ℃延伸10 min。

1.2.2 高通量測(cè)序 參考陶康等[20]的方法，使用Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后采用藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣品的測(cè)序量進(jìn)行混合。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制備測(cè)序文庫，使用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2.3 理化指標(biāo)測(cè)定 pH的測(cè)定：參照劉振鋒[21]的方法進(jìn)行制樣后測(cè)定。取5.0 g腐乳樣品于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水后用均質(zhì)器均質(zhì)，然后在4 ℃下5000 r/min離心25 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，用pH計(jì)測(cè)定。

總酸（total acid，TA）和氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）的含量測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》第一法酸度計(jì)法。取5.0 g腐乳樣品于稱量瓶中，用50 mL 80 ℃左右的蒸餾水分?jǐn)?shù)次洗入燒杯中，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后過濾。吸取濾液10.0 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，計(jì)算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量。同時(shí)取水做試劑空白試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，采用SPSS Statistics V 19.0軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。生物信息分析使用UPARSE軟件，按照97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行可操作分類單元OTU（operational taxonomic units）聚類，并基于Silva（細(xì)菌）和Unite（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。通過Alpha多樣性分析腐乳樣品的細(xì)菌多樣性，通過R語言（version 3.3.1）工具繪制柱狀圖分析腐乳樣品的物種組成，采用R語言（version 3.3.1）stats包和 python的 scipy包中 wilcoxon秩和檢驗(yàn)的方法比較高生物胺和低生物胺腐乳組間主要差異菌屬，采用R語言（version 3.3.1）vegan包中CCA（典范對(duì)應(yīng)分析）分析腐乳細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性，采用R語言（version 3.3.1）（pheatmap package）相關(guān)性熱圖分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與生物胺之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和細(xì)菌Alpha多樣性分析

原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)雙端拼接、質(zhì)量控制、剔除嵌合體后共得到774860條優(yōu)化序列，平均序列長(zhǎng)度為426 bp。物種注釋結(jié)果為：38個(gè)門，113個(gè)綱，255個(gè)目，426個(gè)科，827個(gè)屬，1299個(gè)種和1777個(gè)OTU。

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標(biāo)中的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)表示樣品中細(xì)菌的多樣性和豐富度。由表2可以看出，LE樣品的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為3.59和386.40，均高于其他樣品，說明該樣品物種多樣性和豐富度最高；LF樣品的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為2.22和171.65，均低于其他樣品，說明該樣品的細(xì)菌豐富度和多樣性均為最低。另外，各樣品的Coverage指數(shù)均接近1，表明測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)是足夠的，即測(cè)序結(jié)果可以代表樣品中微生物的真實(shí)情況。

表2 腐乳樣品中細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha-diversity index of bacteria in sufu samples

2.2 腐乳樣品細(xì)菌群落組成分析

2.2.1 基于門分類水平的分析 腐乳樣品中不同細(xì)菌微生物在門水平上的相對(duì)豐度如圖1所示，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是所有6個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)菌門，這4個(gè)細(xì)菌門在腐乳樣品中的相對(duì)豐度之和均達(dá)到91%以上。在HA、HB、HC、LE和LF這5個(gè)樣品中，厚壁菌門相對(duì)豐度均超過61%，是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，這與徐瓊等[22]的報(bào)道一致。在樣品LD中變形菌門相對(duì)豐度為83%，超過厚壁菌門成為主要菌門。圖中Others為所有樣品中豐度占比均小于1%的物種之和。

圖1 腐乳樣品在細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria at phylum level in sufu samples

2.2.2 基于屬分類水平的分析 為更詳細(xì)地分析腐乳樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，確定屬水平上的細(xì)菌組成，圖2顯示了各樣品中的主要菌屬。圖中Others為所有樣品中豐度占比均小于10%的物種之和。從圖2可以發(fā)現(xiàn)不同樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬在種類及相對(duì)分布上有較大的差異。HA和HB樣品中優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）（30%、34%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（21%、16%）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）（23%、5%）；HC、LE和LF樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）（35%、17%、44%）；假單胞菌屬（Pseudomonas）主要存在于LD和LF樣品中，以25%的相對(duì)豐度成為L(zhǎng)D的優(yōu)勢(shì)菌屬，在LF中的相對(duì)豐度為12%；HC和LF中含有相對(duì)豐度為12%和16%的乳桿菌屬（Lactobacillus）；LE中含有相對(duì)豐度為17%的葡萄球菌屬（Staphylococcus）。

圖2 腐乳樣品在細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria at genus level in sufu samples

腐乳發(fā)酵過程中雖然有優(yōu)勢(shì)菌種起主導(dǎo)作用，但由于自然發(fā)酵、多工序、開放式生產(chǎn)方式，實(shí)際上是一個(gè)多菌種混菌發(fā)酵過程，微生物主要來自于曲種和環(huán)境[23]。芽孢桿菌具有降解蛋白質(zhì)、產(chǎn)生抗生素抑制有害菌、能適應(yīng)極端環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，在發(fā)酵食品中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值[24]。魏斯氏菌能參與多種食品的發(fā)酵過程，對(duì)其風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，普遍存在于泡菜、白酒、醬油等食品中[25]。四聯(lián)球菌屬具有耐鹽、耐高滲透壓等特性，常作為優(yōu)勢(shì)菌存在于豆醬[26]、腐乳[22]、魚露[27]等發(fā)酵食品中，有研究表明嗜鹽四聯(lián)球菌會(huì)增加發(fā)酵產(chǎn)品中氨基酸、酯類、酸類等風(fēng)味物質(zhì)的含量[28]。假單胞菌是發(fā)酵食物中的典型腐敗菌，耐鹽的特性使其能夠存在于腐乳中。葡萄球菌屬多見于被污染的乳制品、淀粉類、魚蛋類食品中，其中多數(shù)為非致病菌，但少數(shù)可能會(huì)引發(fā)食源性疾病。

2.2.3 高生物胺和低生物胺組間主要差異菌屬的分析 PLS-DA（偏最小二乘判別分析）是一種常見的檢驗(yàn)樣本組間差異的方法。圖中樣品點(diǎn)的空間距離越接近，表示樣品的物種組成越相似，同理，各點(diǎn)之間距離越大，說明它們之間的菌群差異越大。對(duì)高生物胺含量樣品（H）與低生物胺含量樣品（L）中細(xì)菌屬進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果如圖3所示。所有樣品點(diǎn)均按H和L所代表的分組聚集，兩組樣品點(diǎn)能較好地區(qū)分開來，結(jié)合ANOSIM（相似性）分析，檢驗(yàn)組間差異顯著大于組內(nèi)差異（P＜0.05），說明H和L兩組樣品的組間微生物組成存在明顯差異。

圖3 高生物胺和低生物胺樣品的PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA analysis of high and low BA-producing samples

通過PLS-DA分析可知，H和L組樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯，為了進(jìn)一步分析不同樣品組中具體的差異微生物，采用wilcoxon秩和檢驗(yàn)的方法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。由圖4可見，芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、假單胞菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬是兩組間的主要差異菌屬，其中芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬顯著聚集于H組中，說明它們可能有利于生物胺的產(chǎn)生。假單胞菌屬主要存在于L組中，其對(duì)生物胺的形成沒有明顯促進(jìn)作用。

圖4 高生物胺和低生物胺樣品的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)Fig.4 Wilcoxon rank-sum test of high and low BA-producing samples

2.3 腐乳樣品理化指標(biāo)分析

各腐乳樣品的基本理化指標(biāo)（環(huán)境因子）如表3所示，部分樣品中 pH、總酸（TA）以及氨基酸態(tài)氮（AAN）都存在顯著差異（P＜0.05）。造成腐乳中各個(gè)指標(biāo)存在差異的原因主要是不同廠家的腐乳制作標(biāo)準(zhǔn)不同，其生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)工藝或是發(fā)酵原輔料都會(huì)影響終產(chǎn)品的質(zhì)量。pH、TA和AAN是表征腐乳品質(zhì)和成熟程度的關(guān)鍵指標(biāo)[29-31]，腐乳樣品的AAN含量范圍為0.62～0.86 g/100 g，pH變化范圍在5.62～6.37之間，低pH通常被認(rèn)為是保障發(fā)酵食品安全的一個(gè)重要因素[32]，而氨基酸態(tài)氮含量越高，腐乳的滋味越鮮美。

表3 腐乳樣品的理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indicators of sufu samples

2.4 腐乳細(xì)菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性分析

典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）較好地描述了發(fā)酵體系中高豐度菌屬與環(huán)境因子以及各環(huán)境因子之間的相關(guān)性。圖中箭頭表示環(huán)境因子，箭頭的長(zhǎng)短可以解釋環(huán)境因子與物種的相關(guān)程度；物種與環(huán)境因子以及環(huán)境因子之間箭頭的夾角呈銳角代表正相關(guān)，呈鈍角代表負(fù)相關(guān)。由圖5中環(huán)境因子箭頭的長(zhǎng)度結(jié)合表4的數(shù)據(jù)可以看出，總生物胺和總酸含量顯著影響細(xì)菌群落組成（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為 0.533和 0.486；由圖5中物種與環(huán)境因子以及環(huán)境因子之間箭頭的夾角情況可以看出氨基酸態(tài)氮和pH與總生物胺顯示正相關(guān)性；芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬與總生物胺呈高度正相關(guān)；四聯(lián)球菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬與總生物胺呈負(fù)相關(guān)。

圖5 腐乳細(xì)菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of bacterial community and environmental factors of sufu samples

表4 細(xì)菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性數(shù)據(jù)Table 4 Correlation data of bacterial community and environmental factors

腐乳發(fā)酵過程滿足了產(chǎn)生生物胺的三個(gè)條件，分別是前體物質(zhì)（游離氨基酸）、生物催化劑（具備氨基酸脫羧功能的微生物）和適宜的低pH環(huán)境。首先，腐乳原料富含蛋白質(zhì)，經(jīng)酶解作用可形成大量游離氨基酸，滿足了形成生物胺的物質(zhì)條件，在圖中體現(xiàn)在氨基酸態(tài)氮含量與總生物胺的顯著正相關(guān)關(guān)系上。其次，發(fā)酵體系中高豐度的芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬有較強(qiáng)的產(chǎn)胺能力，這與李東蕊[33]研究結(jié)果相一致，其研究表明在發(fā)酵調(diào)味品豆瓣醬的釀造過程中總生物胺與芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬有一定的相關(guān)性，尤其是與芽孢桿菌屬關(guān)系密切。最后，腐乳發(fā)酵環(huán)境呈酸性，為生物胺的產(chǎn)生提供了有利條件，研究表明低pH環(huán)境更益于產(chǎn)胺微生物生成生物胺，在酸性環(huán)境中，具有氨基酸脫羧酶活性的微生物開啟應(yīng)激機(jī)制，通過脫羧作用產(chǎn)生堿性的生物胺，達(dá)到提高pH、抵御酸性環(huán)境的目的[34]。理論上，pH越低越利于生物胺的形成，但本次研究的腐乳中總生物胺與pH呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，可能是由于低pH會(huì)抑制部分生物胺產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.5 腐乳細(xì)菌群落與生物胺關(guān)聯(lián)分析

通過相關(guān)性熱圖可視化展示樣本中物種與環(huán)境因子之間的關(guān)系，評(píng)估細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與生物胺之間的相關(guān)性。如圖6所示，圖中顯示了相對(duì)豐度前20的菌屬與6種生物胺的關(guān)聯(lián)，熱圖中越接近紅色表示正相關(guān)性越強(qiáng)，越接近藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)性越高；左側(cè)和上側(cè)分別呈現(xiàn)物種和環(huán)境因子聚類樹。

圖6 腐乳細(xì)菌群落與生物胺之間的相關(guān)性熱圖Fig.6 Correlation heat map of bacterial community and BA of sufu samples

物種聚類將與生物胺呈正和負(fù)相關(guān)的菌屬分別聚集。有14個(gè)菌屬至少與一種生物胺具有相關(guān)性（P＜0.05），魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬與總生物胺和酪胺呈極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），這3類菌屬也是高低生物胺腐乳組間的主要差異菌屬。梁靜靜等[17]從市售腐乳中篩選出的產(chǎn)胺菌株均為芽孢桿菌屬；Takebe等[35]研究表明從日本豆腐醬中分離得到的魏斯氏菌均為生物胺產(chǎn)生菌；有學(xué)者[36]對(duì)來源于泡菜的45株魏斯氏菌進(jìn)行的篩查發(fā)現(xiàn)，38.2%的魏斯氏菌可產(chǎn)一種或多種生物胺，其組胺和酪胺的合成量最大。腸桿菌屬（Enterobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）與色胺和苯乙胺有顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。腸桿菌屬是發(fā)酵食品中常見的產(chǎn)胺菌，胡翠翠[37]從黃酒酒曲中分離得到的90株產(chǎn)胺菌中，44株為腸桿菌屬；歐文氏菌屬的產(chǎn)胺性能還未見報(bào)道。假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）與尸胺有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。假單胞菌與不動(dòng)桿菌是常見的腐敗菌，劉愛芳等[38]的研究發(fā)現(xiàn)接種了這兩類菌的冷藏金槍魚中能產(chǎn)生較高含量的尸胺。不動(dòng)桿菌屬、叢毛單胞菌屬與總生物胺和酪胺呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），因?yàn)槔野吩诟榭偵锇分姓急容^大，推測(cè)這些菌屬與酪胺的減少存在某種關(guān)聯(lián)。四聯(lián)球菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）與大部分生物胺顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），特別是與組胺的負(fù)相關(guān)性極顯著（P＜0.01）。四聯(lián)球菌對(duì)鹽的耐受性較強(qiáng)，廣泛存在于高鹽發(fā)酵食品中[39]，具有抑制組胺產(chǎn)生[40]、降解黃曲霉毒素B1的作用[41]；研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等均具有生物胺氧化酶活性，可以降解食品中的生物胺[42]。

腐乳中生物胺的含量與其自身的微生物體系有密切關(guān)聯(lián)。以往的研究表明，腐乳中生物胺的積累主要是由于芽孢菌、假單胞菌、乳桿菌等微生物氨基酸脫羧酶的轉(zhuǎn)化作用[43]，這與本研究的結(jié)果不完全一致。此次研究的腐乳樣品中芽孢桿菌屬是主要的產(chǎn)胺微生物，而假單胞菌屬和乳桿菌屬與生物胺的積累呈負(fù)相關(guān)性?？赡苁怯捎诓煌甑漠a(chǎn)氨基酸脫羧酶能力不同，相較于微生物的種類來說，其細(xì)菌菌株本身對(duì)于生物胺的形成有更大的影響[44]。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同生物胺含量的腐乳樣品細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，同時(shí)采用多元統(tǒng)計(jì)的分析方法了解微生物群落和生物胺之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，腐乳中的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門；優(yōu)勢(shì)菌屬包括芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、四聯(lián)球菌屬和假單胞菌屬。芽孢桿菌屬、魏斯氏菌、假單胞菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬是高低生物胺含量腐乳的組間主要差異菌屬?？偵锇泛涂偹岷匡@著影響細(xì)菌群落組成，氨基酸態(tài)氮和pH與總生物胺顯示正相關(guān)性。魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬豐度的增加與生物胺的產(chǎn)生具有顯著相關(guān)性；不動(dòng)桿菌屬、叢毛單胞菌屬和四聯(lián)球菌屬與生物胺呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

然而，氨基酸態(tài)氮體現(xiàn)的腐乳總游離氨基的含量，代表著營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，如果通過減少氨基酸態(tài)氮含量來控制生物胺會(huì)導(dǎo)致腐乳營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)降低，因此從營(yíng)養(yǎng)角度建議通過改善發(fā)酵環(huán)境（如pH、溫度和含鹽量）以及控制產(chǎn)胺微生物來達(dá)到抑制生物胺產(chǎn)生的目的。研究表明[45]，辣椒、生姜、大蒜和白酒具有一定的抑菌作用，能降低產(chǎn)品中生物胺的含量，可以在腐乳中適量添加這些輔料。另外，亦可通過篩選、優(yōu)化和改良低產(chǎn)胺菌株，培育出安全高效的發(fā)酵菌株來達(dá)到生產(chǎn)低生物胺腐乳。本研究為腐乳中生物胺的有效調(diào)控提供了方向，為提高腐乳產(chǎn)品品質(zhì)，傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級(jí)提供了科學(xué)依據(jù)。