四川泡菜中潛在益生性植物乳桿菌的篩選及安全性評價

史梅莓，伍亞龍 ，楊 愷，呂鵬軍，汪冬冬，唐 垚，王 勇2,，張其圣,,

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院有限公司，四川成都 611130；

2.四川益動源生物科技有限公司，四川眉山 620000；3.四川東坡中國泡菜產業(yè)技術研究院，四川眉山 620000）

國際益生菌和益生元科學協會將益生菌定義為一類活的微生物，當攝入足夠量時，可以為宿主帶來健康益處。據統計，2019年全球益生菌市場價值約400億歐元，近幾年我國益生菌市場平均年增速約15%，預計2022年我國益生菌市場規(guī)模接近900億元，擁有巨大的市場空間[1]。目前，研究表明益生菌具有多種益生作用，尤其是在調節(jié)胃腸道菌群、機體免疫力方面有了相對充實的理論基礎與臨床研究，其健康作用已被消費者普遍認可[2]。在未來，篩選并評價更多優(yōu)良功能菌株，開發(fā)差異化菌種以及特異性產品成為益生菌發(fā)展趨勢之一。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為人體腸道內的優(yōu)勢菌之一，大量研究表明具有調節(jié)腸道微生物菌群平衡、改善人體免疫力、拮抗致病菌感染、抗氧化性等多種功效[3-4]，在食品、醫(yī)療保健、飼料等領域被廣泛應用，國內外學者對其益生功能和臨床研究越來越深入。植物乳桿菌來源廣泛，研究人員從天然原料奶、傳統奶制品、泡菜、地方特色發(fā)酵飲料等[5-6]食品中分離篩選出具有某種功能特性的菌株。四川泡菜是我國典型的傳統發(fā)酵食品，以多代循環(huán)發(fā)酵工藝制作的典型四川泡菜，其新制泡菜會逐步演變?yōu)橐粋€穩(wěn)定的含有大量乳酸菌、酵母菌等微生物菌群結構單一和氨基酸、有機酸等底物穩(wěn)定的生態(tài)系統[7]，其中主導四川泡菜發(fā)酵的微生物主要是乳酸菌（93.89%），如植物乳桿菌、耐酸乳桿菌、短乳桿菌等[8]。研究表明分離自四川泡菜中的乳酸菌具有高產γ-氨基丁酸、良好的免疫活性、潤腸通便功能等特性，如朱珺等[9]研究發(fā)現分離自四川農家泡菜的植物乳桿菌581具有良好胃腸道環(huán)境耐受能力，具有潤腸通便功能和良好的發(fā)酵特性；彭燈水等[10]從四川泡菜中分離出一株植物乳桿菌LC-13，發(fā)現其具有較強的抗逆能力以及較好的益生菌潛力。因此，四川泡菜發(fā)酵后期以植物乳桿菌為主導的耐酸性優(yōu)勢菌[11]，非常值得挖掘。目前，多數研究主要是對四川泡菜中用于泡菜發(fā)酵功能菌的篩選[12]，而針對四川泡菜中可能存在的具有益生潛質的植物乳桿菌及其功能特性研究還遠遠不足。本研究對分離自傳統四川泡菜的114株植物乳桿菌進行耐酸、耐膽鹽初篩，通過對其篩選菌模擬胃腸液耐受能力、自聚性和共聚性、體外安全性等指標進行益生作用和安全性評價，以期為后續(xù)挖掘優(yōu)良功能性菌株以及益生菌產品的開發(fā)提供理論基礎和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

114株植物乳桿菌 為實驗室保藏菌種，分離自四川多代泡菜（編號PC開頭代表泡菜）；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG） 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院有限公司實驗室保藏；單增李斯特菌（Listeria monocytogenesCICC21633）、大腸埃希氏菌（Escherichia coliCICC10305）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCICC23926） 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉 成都市科隆化學品有限公司；胰蛋白酶（1:250）、胃蛋白酶（1:3000）、哥倫比亞血瓊脂平板 生工生物工程（上海）股份有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（10種） 杭州微生物試劑有限公司；牛膽鹽（膽酸含量≥60%）、四環(huán)素、氨芐青霉素鈉等 上海源葉生物科技有限公司。

ESJ200-4A電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；XH-B旋渦混合器 江蘇天翎儀器有限公司；LDZF-75L-II立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BSP-150生化培養(yǎng)箱、GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FC型酶標儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐酸能力的測定 將活化2次后的114株植物乳桿菌分別以10%的接種量接種于pH2.0 MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2和4 h取發(fā)酵液稀釋至合適梯度后接種至MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后活菌計數，對照組為酸處理0 h的活菌數，計算植物乳桿菌的存活率。存活率計算公式如下：

1.2.2 耐膽鹽能力的測定 將活化后的114株植物乳桿菌分別以10%的接種量接種于含0.2 g/100 mL牛膽鹽的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1和3 h取發(fā)酵液稀釋至合適梯度后接種至MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后活菌計數，以未經膽鹽處理的MRS培養(yǎng)基菌落數為對照。

1.2.3 耐模擬胃腸液能力的測定 參考丁詩瑤等[13]的方法，模擬胃液的配制：用NaOH溶液將1 mol/L HCl溶液pH調至2.0，加入胃蛋白酶使其終濃度為1 g/100 mL，0.22 μm微孔濾膜除菌。模擬腸液的配制：用NaOH溶液將磷酸二氫鉀溶液pH調至6.8，加入胰蛋白酶使其終濃度為1 g/100 mL，磷酸二氫鉀溶液終濃度為0.68 g/100 mL，0.22 μm微孔濾膜除菌。

分別取13株菌的菌液0.5 mL加至4.5 mL模擬胃液或腸液中，在37 ℃靜置培養(yǎng)0和3 h取發(fā)酵液稀釋至合適梯度后接種至MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后活菌計數，計算植物乳桿菌的存活率，以鼠李糖乳桿菌GG為陽性對照。存活率計算公式如下：

1.2.4 自聚集能力和共聚性的測定 參考Behrooz等[14]的方法。將活化后的13株菌6000 r/min離心10 min，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液PBS清洗2次，重新懸浮于PBS中，調整細菌懸液濃度約為108CFU/mL，取菌懸液測定A620nm，記為A0。菌懸液37 ℃靜置培養(yǎng)5 h后取上清液，測定A620nm，記為A1。自聚集能力計算公式如下：

共聚性的測定：以大腸桿菌CICC10305、單增李斯特菌CICC21633對植物乳桿菌的共聚集能力進行評價。將植物乳桿菌與致病菌菌懸液等體積混合均勻，37 ℃靜置培養(yǎng)5 h后取上清液，測定A620nm。共聚性計算公式如下：

式中：A2、A3分別為植物乳桿菌、致病菌在0 h時的吸光值；A混為植物乳桿菌與致病菌混合液處理5 h的吸光值。

1.2.5 體外安全性評價

1.2.5.1 藥物敏感性 采用紙片擴散法（K-B法），將活化后的13株菌經適當的梯度稀釋（菌液濃度約為1×108CFU/mL），均勻地涂布于MRS平板上，用無菌鑷子將藥敏紙片均勻放置其上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。用標準敏感菌株金黃色葡萄球菌CICC23926作為質控菌，參照美國臨床實驗室標準化協會[15]對抗菌藥物敏感性的最小抑菌圈直徑大小來判定菌株的藥敏性。

1.2.5.2 菌株最小抑制濃度（MIC）的測定 采用宏量肉湯稀釋法測定各菌株MIC。取菌液加入10種抗生素溶液中（最終細菌濃度約為5×105CFU/mL），以不加抗生素的MRS液體培養(yǎng)基試管作為對照，混勻后測量各試管A620nm值。37 ℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察有無可見菌生長，并測定A620nm值。結果根據歐洲食品安全局（EFSA）的指南[16]、歐洲抗菌素敏感性試驗委員會（EUCAST）[17]、美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）頒布的標準中臨界值或耐藥折點進行判斷[15]。

1.2.5.3 溶血性試驗 參考高熳熳等[18]的方法，將活化后的13株菌株劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否出現溶血現象。以金黃色葡萄球菌CICC23926作為陽性對照菌株。

1.3 數據處理

所有試驗均重復三次，數據結果用平均值±標準差表示。采用Excel 2019、Origin 2018軟件進行數據統計分析和繪制結果圖，SPSS Statistics 22軟件進行方差分析（ANOVA）和LED檢驗，以P＜0.05判斷為具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 耐酸能力

大部分人胃液pH在1.5～3.0，益生菌要在人體腸道內存活并增殖，必須具備一定的耐酸能力。本試驗初期以pH2.0的酸性環(huán)境下培養(yǎng)2和4 h作為篩選植物乳桿菌的條件，從114株菌中篩選得到13株具有一定耐酸能力的菌株（圖1）。13株菌培養(yǎng)2 h后存活率均高于 50%，PC05、PC06、PC08、PC09、PC94、PC97菌株在培養(yǎng)4 h后其存活率仍能達到80%以上。其中PC08菌株在培養(yǎng)4 h后存活率由54.57% 增加至 82.09%（P＜0.05），這與聶紫玉等[19]研究發(fā)現49株植物源乳酸菌在pH2.5 MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，其中的12株菌活菌數較0 h時增加的結果相似。趙山山等[20]從貴州家庭自制泡菜中分離出11株植物乳桿菌，經過pH2.0的酸溶液處理2 h后存活率均能達到87%以上。Giri等[21]從當地傳統的大米發(fā)酵飲料中篩選出植物乳桿菌L7，在pH2.0的條件下培養(yǎng)4 h其存活率可達89.87%。表明培養(yǎng)4 h后，6株植物乳桿菌存活率達到80%以上，這與其他研究報道具有較強的耐酸性的結果相似。

圖1 植物乳桿菌在pH2.0酸性條件下培養(yǎng)2、4 h的存活率Fig.1 Survival rate of L.plantarum under pH2.0 acidic conditions for 2 and 4 h

2.2 耐膽鹽能力

膽鹽可通過破壞菌體細胞膜和表面特性，影響胞內基質蛋白穩(wěn)定性、損傷DNA等，正常生理情況下，人小腸中膽鹽濃度約為0.03%～0.3%，設定膽鹽濃度為0.2 g/100 mL，評價植物乳桿菌的耐受能力。由表1可知，培養(yǎng)1 h時，整體活菌數量均下降，其中PC06、PC08、PC09菌株耐膽鹽短時能力偏強，其余菌株耐受能力較低。在培養(yǎng)3 h后，共8株菌具有長時耐受性，其中 PC05、PC06、PC100、PC104菌株活菌數能維持在6 lg CFU/mL以上，而其余5株菌無活菌檢出。表明13株菌中共有8株菌具有較強的耐膽鹽能力（PC05、PC06、PC94、PC97、PC100、PC104、PC105、PC108）。結果與一些報道相似，如周海柱等[22]從長春民間自制泡菜中篩選出4株植物乳桿菌，其中兩株菌在含0.2%牛膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后其活菌數能維持在108CFU/mL，而其余2株活菌數在105～106CFU/mL范圍內。不同菌株對膽鹽的耐受能力不同，這與其自身有關，有的菌株可以通過調控熱激蛋白調控系統的基因應對膽鹽脅迫導致的蛋白質過量、錯誤折疊等的不利影響、通過氨基酸代謝提高細胞膜穩(wěn)定性等適應和對抗膽鹽脅迫的機制和系統[23]。

表1 植物乳桿菌對0.2 g/100 mL牛膽鹽溶液耐受能力Table 1 Tolerance of L.plantarum to 0.2 g/100 mL bovine bile salt solution

2.3 耐模擬胃腸液能力

人體消化道中的胃蛋白酶和胰蛋白酶可以分解蛋白質，也會對微生物的生長具有一定的抑制作用。植物乳桿菌在人工模擬胃液和腸液的環(huán)境下其存活率如圖2所示，在模擬胃液中，3 h內菌株存活率均高于75%，其中4株菌存活率達到100%以上，表現出很強的耐受胃液能力。在模擬腸液中，共有9株菌存活率高于100%。鄭越等[24]同樣研究表明，6株不同來源的植物乳桿菌培養(yǎng)3 h時，在模擬胃液中的存活率均高于97%，4株菌在腸液中存活率能達到100%以上。說明13株菌對胃腸液均有一定的耐受能力，具有發(fā)揮益生功能的潛力。

圖2 植物乳桿菌對模擬胃腸液的耐受能力Fig.2 Tolerance of L.plantarum to simulated gastrointestinal fluid

2.4 自聚集能力和共聚性

益生菌要在宿主體內發(fā)揮作用必須在腸黏膜上皮細胞中發(fā)生黏附并進一步定植，有研究表明自聚性和共聚性較強的菌株，其與腸道上皮的黏附能力也較強[25]。由圖3可知，13株植物乳桿菌自聚集能力在23%～52%。其中，PC97、PC108菌株的自聚集能力達39.92%和51.09%，不同植物乳桿菌之間自聚集能力存在差異性，這與一些研究結果相似，李清等[26]研究分離自新疆酸馬奶、酸駝奶等的10株植物乳桿菌，其中自聚能力最強可達63.39%，5株菌的自聚集能力在20%～30%之間。有研究表明，培養(yǎng)時間即超過某一培養(yǎng)時間后菌株的自動聚集能力不會發(fā)生顯著性變化，菌體表面成分如碳水化合物、蛋白質與菌株的自動聚集能力也有一定的相關性[27]。

圖3 植物乳桿菌的聚集能力Fig.3 Aggregation ability of L.plantarum

由圖3可知，植物乳桿菌分別與致病菌大腸埃希氏菌、單增李斯特菌的共聚集能力存在差異，分別在16%～37%、10%～29%之間。與單增李斯特菌相比，13株植物乳桿菌對大腸埃希氏菌顯示出更高的共聚集能力。其中，PC108菌株與大腸埃希氏菌的共聚集值最高（36.66%）。有研究表明共聚集可能是干擾致病菌黏附上皮細胞的重要因素，在共聚集過程中，乳酸菌可以控制致病菌周圍的微環(huán)境，形成防止致病菌定植的屏障、增加分泌抑制物如細菌素濃度等[28]。

2.5 體外安全性評價

2.5.1 抗生素藥敏性 具有抗生素抗性基因的益生菌被食用后可能向人體內其他細菌或致病菌轉移其抗性基因，從而導致對人體健康的潛在風險，因此植物乳桿菌對抗生素的敏感性是體外安全性評價最重要的指標之一[29]。植物乳桿菌對10種抗生素的敏感性如表2所示，13株菌均對鏈霉素、萬古霉素以及諾氟沙星耐藥；對四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、紅霉素、氯霉素均為敏感；對青霉素（6/13，46.15%）敏感，（6/13，46.15%）中度敏感，其中 PC108 對青霉素耐藥；對慶大霉素（11/13，84.61%）耐藥，PC41 對慶大霉素中度敏感，PC108對慶大霉素耐藥。研究結果與許女等[30]研究中分離自傳統發(fā)酵食品的97株乳酸菌對鏈霉素、萬古霉素、慶大霉素耐藥性較強的結果相似。據報道，乳酸菌對氨基糖苷類抗生素（鏈霉素、慶大霉素）耐藥原因之一是產生的氨基糖苷類鈍化酶使此抗生素滅活[31]。綜合上述結果，13株菌對多種抗生素具有敏感性。

表2 13株植物乳桿菌的抑菌圈直徑（mm）及判定結果Table 2 Diameter of inhibition zone (mm) and judgment results of 13 strains of L.plantarum

2.5.2 菌株最小抑制濃度（MIC） 采用宏量肉湯稀釋法進行體外藥敏試驗結果如表3所示，13株植物乳桿菌對紅霉素、氯霉素和青霉素表現出不同程度的耐藥性，對3種抗生素的耐藥率分別為紅霉素（12/13，92.31%）、氯霉素（5/13，38.46%）、青霉素（4/13，30.77%）。13株菌對氨芐西林、阿莫西林全部敏感，對鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素和諾氟沙星全部耐藥。所測菌株對抗生素耐藥率從高到低為鏈霉素=慶大霉素=四環(huán)素=萬古霉素=諾氟沙星＞紅霉素＞氯霉素＞青霉素＞氨芐西林=阿莫西林。13株菌耐藥性結果與很多研究報道大致相同，如李禤等[32]分離了8株不同來源的植物乳桿菌，對β-內酰胺類、大環(huán)內脂類、四環(huán)素類、氯霉素類抗生素敏感，對氨基糖苷類、糖肽類和喹諾酮類等抗生素有抗性。本實驗中13株菌對四環(huán)素表現為耐藥，這與Li等[33]研究四川泡菜中部分乳酸菌對四環(huán)素表現出較強的耐藥性結果基本一致。綜合上述結果，13株菌對鏈霉素、萬古霉素、諾氟沙星耐藥，對氨芐西林、阿莫西林敏感，K-B法和宏量肉湯稀釋法（MIC）兩種方法結果具有一致性，而對其他抗生素的敏感性兩種方法結果存在一定差異。

表3 13株植物乳桿菌對10種抗生素的MIC檢測結果Table 3 Minimum inhibitory concentrations of 13 L.plantarum strains when exposed to ten antibiotics

2.5.3 溶血性 WHO/FAO在《食品中益生菌評估指南》中建議，溶血性檢測是益生菌體外安全性評價中不可缺少的環(huán)節(jié)。具有溶血性的細菌在補體的作用下，抗原（紅血球）和抗體（溶血素）進行溶解反應，將抗體溶解，進而引發(fā)破壞紅血球，造成集體嚴重的溶血反應，進而導致敗血癥等疾病[34]。

以金黃色葡萄球菌CICC23926為對照菌株，檢測試驗中13株植物乳桿菌溶血性（圖4）。金黃色葡萄球菌菌落周圍出現透明溶血圈，即為溶血，對人體的致病力強。13株植物乳桿菌菌落周圍均沒有出現溶血圈，即不溶血，由此說明試驗菌種無溶血性，結果與一些研究所報道的其他植物乳桿菌未檢測出溶血現象一致[35]。

圖4 溶血試驗結果Fig.4 Results of hemolysis test

3 結論

本研究從分離自四川泡菜的114株植物乳桿菌中篩選出13株耐酸和耐膽鹽能力菌株，并對其潛在的益生作用和安全性進行了初步研究。結果表明，13株植物乳桿菌顯示出良好的人工胃腸道耐受能力和自聚能力，與大腸埃希氏菌的共聚集能力高于單增李斯特菌，均無溶血性；在抗生素藥敏性試驗中，對鏈霉素、萬古霉素以及諾氟沙星耐藥，對四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、紅霉素、氯霉素均為敏感，對青霉素和慶大霉素表現出不同程度的敏感；在測定菌株最小抑制濃度MIC中，所測菌株對抗生素耐藥率從高到低為鏈霉素=慶大霉素=四環(huán)素=萬古霉素=諾氟沙星＞紅霉素＞氯霉素＞青霉素＞氨芐西林=阿莫西林。綜上所述，13株植物乳桿菌在以不同指標評價時各有側重，可作為潛在的益生菌菌株應用于食品、動物飼料等領域，同時也說明四川泡菜這一天然益生菌資源寶庫非常值得挖掘。在下一步工作中，根據不同需求對表現好的菌株進行全基因組測序，挖掘重要性狀相關的功能基因，對其功能性進行進一步探究，以期為獲得優(yōu)良功能性菌株以及益生菌產品的開發(fā)奠定理論基礎。