NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲的生理響應(yīng)及主成分分析

孫 靜，楊 彤，張志豪，王建瑞，劉 宇

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東省食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264025）

鹽分脅迫是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的一種非生物脅迫，全世界20%的耕地和32%的灌溉農(nóng)業(yè)用地都受到了土壤鹽害的嚴(yán)重影響，造成了農(nóng)作物退化減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)[1]。土壤鹽漬化現(xiàn)已成為一個(gè)全球性的土地資源問(wèn)題，它遍及全球100多個(gè)國(guó)家[2]。此外，由于降水量少，地表水分蒸發(fā)量高，海水灌溉等原因，鹽堿地面積正以每年10%的速度增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2050年，50%以上的耕地會(huì)被土壤鹽漬化破壞[3]。我國(guó)黃河三角洲地區(qū)的鹽堿地面積高達(dá)47.6萬(wàn)公頃，分布廣泛、面積遼闊，并且類(lèi)型繁多，鹽的成分主要以氯化物為主，占80%以上，陽(yáng)離子以鈉為主，是重要的后備土地資源[4]。

羊肚菌Morehellaspp.，屬于盤(pán)菌目 Pezizales，羊肚菌科Morchellaceae[5]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是中國(guó)四大名菌之一。羊肚菌中的蛋白質(zhì)和碳水化合物含量高、脂肪含量低[6-7]，含有豐富的人體必需氨基酸[8]、維生素[9]以及生物活性物質(zhì)，對(duì)人體健康極為有利[10]。羊肚菌風(fēng)味鮮美、肉質(zhì)脆嫩，因此被廣大食用菌愛(ài)好者和美食家所喜愛(ài)[11-12]。同時(shí)，羊肚菌還具有一定的藥用價(jià)值，可作為免疫刺激劑和抗腫瘤劑[13]。經(jīng)前期試驗(yàn)證明，羊肚菌具有良好的耐鹽性，在高鹽環(huán)境（NaCl＞500 mmol/L）下，菌絲仍能夠萌發(fā)，但長(zhǎng)勢(shì)緩慢。本研究團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道了鹽脅迫下不同時(shí)間內(nèi)六妹羊肚菌菌絲的胞內(nèi)外多糖、DPPH自由基以及菌絲顯微結(jié)構(gòu)等的變化情況[14]。

本研究以前期耐鹽菌株篩選試驗(yàn)中耐鹽性最強(qiáng)的六妹羊肚菌菌株為研究對(duì)象，測(cè)定NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲14個(gè)生理指標(biāo)的影響，并探討了對(duì)低、中、高NaCl脅迫具有指示性的生理指標(biāo)以及六妹羊肚菌的生理響應(yīng)，為羊肚菌屬的耐鹽性評(píng)價(jià)及耐鹽菌株的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六妹羊肚菌（M.sextelata） 由云南昆明植物研究所提供；PDA固體培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，維生素B11片；PDA液體培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，維生素B11片；葡萄糖分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；聚乙烯比咯烷酮 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；硫代巴比妥酸 上海山浦化工有限公司；其他試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海達(dá)平儀器有限公司；SW-CJ-IBU型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；OLYMPUS-BX61型全自動(dòng)金相顯微鏡 日本奧林巴斯集團(tuán)；SQP型千分級(jí)電子天平、A-14型高速離心機(jī) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DGX-943B-1型鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WY-250B型全溫型恒溫培養(yǎng)搖床 天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendorf型移液槍 德國(guó)漢堡艾本德生命科學(xué)公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MP515-02型高純水電導(dǎo)率儀、802型磁力攪拌器 上海三信儀表廠；BS-100型冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀 北京恒奧德儀器儀表有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 上海星堯科學(xué)儀器有限公司；BHC-1300IIB2型通風(fēng)櫥 上海精密儀器儀表有限公司；FL1936-G1型粉碎機(jī) 溫州福菱科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固體菌種制備 PDA固體培養(yǎng)基，分裝于500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，高壓0.12 MPa蒸汽滅菌后倒平板，每皿20 mL。待平板凝固后，在平板上接入活化的六妹羊肚菌菌種，在（22±1）℃條件下黑暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿平板后，作為菌種備用。

1.2.2 液體菌種制備 PDA液體培養(yǎng)基，分裝于500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，高壓0.12 MPa蒸汽滅菌，冷卻后接入已活化的六妹羊肚菌菌種，放入搖床，22 ℃，170 r/min，培養(yǎng)2.5 d。待三角瓶?jī)?nèi)搖出均勻一致的雪花狀菌絲球，停止培養(yǎng)。

1.2.3 鹽脅迫培養(yǎng) 本研究參考了多種作物[15-16]、其他植物[17-20]、菌根真菌[21-22]等，并結(jié)合前期試驗(yàn)中羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)，設(shè)置NaCl濃度梯度為：0、100、200、300、400和 500 mmol/L。配制不同NaCl濃度的PDA固體培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)。在平板中央打孔接入生長(zhǎng)狀態(tài)相同的六妹羊肚菌菌種，在（22±1）℃條件下黑暗培養(yǎng)，每隔12 h劃線一次，至其中一個(gè)平板菌絲長(zhǎng)滿平板后，停止劃線，測(cè)量數(shù)據(jù)。

配制不同 NaCl濃度（0、100、200、300、400和500 mmol/L）的PDA液體培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)2.5 d的液體菌種分別定量接入不同處理的液體培養(yǎng)基中，接種量為液體培養(yǎng)基的10%。放入搖床，22 ℃，170 r/min，培養(yǎng) 5 d后，用140目尼龍紗過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，分別取樣測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 生長(zhǎng)速度及抑制率測(cè)定 以開(kāi)始培養(yǎng)為起點(diǎn)，采用劃線法標(biāo)記菌絲長(zhǎng)度（菌絲長(zhǎng)度=菌落直徑-菌餅直徑），在平板選取任意測(cè)量位置，按順時(shí)針旋轉(zhuǎn)60°的方法，每個(gè)平板共劃線3次，每12 h記錄一次。計(jì)算不同NaCl處理對(duì)六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度和抑制率的影響。

菌絲生長(zhǎng)速度：

式中：V是菌落平均生長(zhǎng)速度，mm/h；D是菌落最終真實(shí)直徑，mm；T是平板長(zhǎng)滿的時(shí)間，h[23]。

生長(zhǎng)抑制率：

式中：P是不同鹽濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率；V1是對(duì)照菌絲生長(zhǎng)速度；V2是不同鹽濃度處理菌絲生長(zhǎng)速度[24]。

1.2.4.2 菌絲顯微結(jié)構(gòu) 使用金相顯微鏡，放大1000倍，觀察菌絲形態(tài)。

1.2.4.3 生物量測(cè)定 同1.2.3中液體培養(yǎng)5 d后，過(guò)濾，用蒸餾水將菌絲表面鹽離子洗凈。用千分級(jí)電子天平稱量菌絲鮮重，并記錄。稱重后，放入53 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，每隔12 h拿出稱重，直至三次稱重，重量不變，停止烘干，取出后按照鮮重稱取方法稱量干重。計(jì)算不同NaCl處理對(duì)六妹羊肚菌菌絲鮮重含水量的影響。

鮮重含水量：

式中：Wc是菌絲鮮重含水量，%；Wf是菌絲鮮重，g；Wd是菌絲干重，g。

1.2.4.4 質(zhì)膜透性測(cè)定 使用高純水電導(dǎo)率儀測(cè)定電解質(zhì)的電導(dǎo)率[25]。

1.2.4.5 丙二醛含量測(cè)定 采用硫代巴比妥酸（TBA）方法[26]。

1.2.4.6 滲透壓測(cè)定 采用冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀測(cè)定數(shù)值，為i×C的值，單位是mOsm/L，并根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。

菌絲細(xì)胞滲透壓：ψs=-R×T×i×C

式中：ψs為細(xì)胞滲透勢(shì)；R為氣體常數(shù)，R=0.0083（MPa·L·mol-1·K-1）；T 為熱力學(xué)溫度，單位 K，即273+t，t為實(shí)驗(yàn)溫度，℃；i為解離常數(shù)，蔗糖為1，NaCl為1.8；C為等滲溶液的質(zhì)量摩爾濃度，mol/L。

1.2.4.7 多糖含量測(cè)定 按黃玲玲[27]的方法測(cè)定菌絲的胞內(nèi)多糖含量。

1.2.4.8 可溶性蛋白含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定菌絲的可溶性蛋白含量[28]。

1.2.4.9 游離脯氨酸含量測(cè)定 采用磺基水楊酸比色法測(cè)定菌絲中的游離脯氨酸含量[29]。

1.2.4.10 抗氧化酶活性測(cè)定 SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法[30]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用3次重復(fù)的平均值。運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析（P＜0.05）、相關(guān)性分析和主成分分析，利用Waller-Duncan（W）法進(jìn)行樣本間差異顯著性檢驗(yàn)。通過(guò)Origin 2019b軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響

從菌絲外觀形態(tài)（圖1）可以看出，各處理組的菌絲直徑隨NaCl濃度升高明顯變細(xì)。如圖2，100～500 mmol/L NaCl濃度處理組均與對(duì)照組的菌絲直徑呈顯著性差異（P＜0.05）。其中，對(duì)照組菌絲直徑最大，為14.45 nm，鹽濃度在100～200 mmol/L處理組之間，菌絲直徑差異不大，分別為11.64、10.63 nm。隨鹽脅迫加深，菌絲逐漸變細(xì)。當(dāng)鹽濃度達(dá)到500 mmo/L時(shí)，菌絲相比對(duì)照組細(xì)了62.42%。

圖1 不同濃度NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Microstructure of M.sextelata mycelia under different concentrations of NaCl stress

圖2 不同濃度NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲直徑變化Fig.2 Changes of mycelia diameter of M.sextelata under different concentrations of NaCl stress

從圖3可以看出，隨著NaCl濃度的增加，六妹羊肚菌菌絲均能夠萌發(fā)，但菌落直徑逐漸變小且菌絲逐漸稀疏。如圖4，菌絲生長(zhǎng)速度與鹽濃度呈負(fù)相關(guān)，而且抑制率與鹽濃度呈正相關(guān)。鹽濃度在0～200 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，菌絲的平均生長(zhǎng)速度分別為0.58、0.46、0.34 cm/h，各處理組生長(zhǎng)速度差異顯著（P＜0.05）。300～400 mmol/L NaCl處理，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較慢，平均生長(zhǎng)速度分別為0.28和0.13 cm/h，生長(zhǎng)抑制率分別為51.32%、76.98%，各處理組生長(zhǎng)速度差異顯著（P＜0.05），其抑制率顯著性情況與生長(zhǎng)速度基本一致。當(dāng)500 mmol/L NaCl處理時(shí)，菌絲稀疏且長(zhǎng)勢(shì)弱，生長(zhǎng)抑制率達(dá)到85.89%，與400 mmol/L差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同濃度NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)情況Fig.3 Mycelial growth of M.sextelata under different concentrations of NaCl stress

圖4 不同濃度NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NaCl stress on M.sextelata mycelial growth

由表1可知，六妹羊肚菌菌絲鮮重和干重隨著鹽脅迫濃度的增加，整體呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，NaCl濃度為100～500 mmol/L時(shí)，各處理組菌絲鮮重和干重均顯著降低（P＜0.05）。其中，0～300 mmol/L時(shí)，各處理組菌絲鮮重和干重之間呈顯著性差異（P＜0.05），300～500 mmol/L 時(shí)，菌絲鮮重和干重受鹽脅迫影響相差不大。菌絲鮮重含水量隨鹽濃度遞增，呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L時(shí)，菌絲鮮重含水量達(dá)到最大值，為95.79%。鹽濃度達(dá)到500 mmol/L時(shí)，菌絲鮮重含水量與對(duì)照組相比，下降了4.23%。

表1 不同濃度NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲生物量的影響Table 1 Effects of different concentrations of NaCl stress on the mycelial biomass of M.sextelata

2.2 NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲膜透性的影響

從圖5可以看出，隨著鹽脅迫程度加深，六妹羊肚菌菌絲電導(dǎo)率呈逐漸上升趨勢(shì)，鹽濃度在100～500 mmol/L范圍之間時(shí)，各處理組電導(dǎo)率與對(duì)照組均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），電導(dǎo)率最高達(dá)到310.87 ms/cm。而隨培養(yǎng)基鹽濃度升高，菌絲中丙二醛含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在鹽濃度為200 mmol/L時(shí)，丙二醛含量出現(xiàn)最大值，達(dá)到0.033 μmol/g，與對(duì)照組呈顯著性差異（P＜0.05）。鹽濃度在300～500 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，各處理組之間差異不顯著，但與對(duì)照組呈顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同濃度NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲膜系統(tǒng)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl stress on the mycelial membrane system of M.sextelata

2.3 NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲生理指標(biāo)的影響

由圖6可以看出，六妹羊肚菌菌絲胞內(nèi)滲透壓隨鹽濃度脅迫加深呈逐漸上升的趨勢(shì)，對(duì)照組滲透壓僅為0.06 MPa，當(dāng)鹽濃度為100 mmol/L時(shí)，胞內(nèi)滲透壓與對(duì)照組相比，升高了4.5倍，為0.33 MPa，與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。鹽濃度在 100～200 mmol/L之間時(shí)，滲透壓呈顯著差異（P＜0.05）。鹽濃度在300～500 mmol/L范圍之內(nèi)時(shí)，各處理組之間滲透壓具有顯著差異，且與對(duì)照組分別呈顯著性差異（P＜0.05），滲透壓最高達(dá)到 2.53 MPa。

圖6 不同濃度NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲生理指標(biāo)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NaCl stress on mycelial physiological indices of M.sextelata

鹽脅迫下羊肚菌菌絲中的可溶性多糖作為有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以緩解鹽脅迫對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制。隨液體培養(yǎng)基鹽濃度增加，菌絲內(nèi)可溶性多糖含量明顯降低。其中，100～200 mmol/L/時(shí)，可溶性多糖含量減幅顯著，分別為14.99、9.63 g/L，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），而鹽濃度在 200～500 mmol/L 之間時(shí)，各處理組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），各處理組之間未達(dá)到顯著性差異（P＞0.05）。

不同濃度的鹽處理對(duì)羊肚菌菌絲可溶性蛋白含量的影響不同。鹽濃度為0～500 mmol/L范圍之間時(shí)，各處理組差異不大，呈先上升后下降的趨勢(shì)。鹽濃度為400 mmol/L時(shí)，菌絲可溶性蛋白出現(xiàn)最大值，為41.90 mg/g，與對(duì)照組相比增加了23.67%。

隨著鹽脅迫的加深，菌絲內(nèi)游離脯氨酸的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。100～300 mmol/L之間時(shí)，脯氨酸含量與對(duì)照組相比，漲幅明顯，分別增長(zhǎng)了61.44%、273.11%、434.31%。300～500 mmol/L之間時(shí)，游離脯氨酸含量逐漸下降，菌絲生長(zhǎng)受到抑制。

2.4 NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲抗氧化酶的影響

如圖7，隨著鹽脅迫程度的加深，菌絲中抗氧化酶系活性呈先升后降的趨勢(shì)。超氧化物歧化酶（SOD）活性在300 mmol/L時(shí)，達(dá)到最高值，與對(duì)照組相比，增長(zhǎng)了8.72%。過(guò)氧化物酶（POD）活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性在鹽濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)最高值，分別比對(duì)照組升高22.28%、114.93%。當(dāng)鹽脅迫繼續(xù)加深后，菌絲上述酶活性均不同程度降低。

圖7 不同濃度NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲酶系統(tǒng)的影響Fig.7 Effects of different concentrations of NaCl stress on the mycelial enzyme system of M.sextelata

2.5 NaCl脅迫下生理指標(biāo)的相關(guān)性分析和主成分分析

通過(guò)SPSS 19.0軟件對(duì)上述測(cè)得的六妹羊肚菌菌絲在NaCl脅迫下的14個(gè)生理指標(biāo)利用相關(guān)性分析和主成分分析進(jìn)行綜合分析。

從相關(guān)性分析（表2）可以看出：菌絲生長(zhǎng)抑制率與生長(zhǎng)速度、菌絲鮮重與干重均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性均與鮮重呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；胞內(nèi)多糖含量則與菌絲干重呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；過(guò)氧化物酶（POD）活性與丙二醛呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性與丙二醛（MDA）和過(guò)氧化物酶（POD）活性均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

表2 NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲各項(xiàng)生理指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation matrix of physiological indexes of M.sextelata mycelia under NaCl stress

從主成分分析得出的碎石圖（圖8），呈“先陡后緩”的趨勢(shì)，主成分特征值越大，趨勢(shì)越陡，說(shuō)明涵蓋信息越多。本研究中，前三個(gè)成分特征值均大于1，且累計(jì)貢獻(xiàn)率為96.611%（表4），能夠代表不同NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲96%的生理信息。因此，可用這3個(gè)主成分對(duì)六妹羊肚菌菌絲的14個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。

圖8 主成分分析碎石圖Fig.8 Crushed stone diagram of principal component analysis

從回歸因子得分（表3）可以看出：前3個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為66.237%、22.347%和8.027%。其中，NaCl濃度在0～100 mmol/L時(shí)，主成分1得分較高，NaCl濃度在100～200 mmol/L時(shí)，主成分2得分較高，NaCl濃度在200～400 mmol/L時(shí)，得分較高的是主成分3。根據(jù)主成分分析（表4）可以看出，主成分1中特征向量值較大的是生長(zhǎng)速度、菌絲直徑、干重、鮮重和胞內(nèi)多糖等指標(biāo)，主成分2中特征向量值較大的是丙二醛（MDA）、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性等指標(biāo)，主成分3中的特征向量值較大的是脯氨酸、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標(biāo)。

表3 NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲生理指標(biāo)的回歸因子得分Table 3 REGR factor scores of physiological indexes of M.sextelata mycelia under NaCl stress

表4 NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲生理指標(biāo)的主成分分析Table 4 Principal component analysis of physiological indexes of M.sextelata mycelia under NaCl stress

3 討論

3.1 六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

鹽脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲形態(tài)發(fā)育和生長(zhǎng)情況具有顯著影響。菌絲在鹽脅迫下，其新陳代謝與生長(zhǎng)速度都會(huì)受到一定程度的影響。本試驗(yàn)中，NaCl脅迫對(duì)六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，且菌絲逐漸變細(xì)，對(duì)其鮮重和干重及鮮重相對(duì)含水量也有顯著影響，并隨鹽濃度的遞增呈降低的趨勢(shì)。主要原因可能是在鹽脅迫下，菌絲吸收培養(yǎng)基中的Na+、Cl-增加，抑制了Ca2+、K+、NO3-吸收，而細(xì)胞為了維持正常功能的離子含量和離子平衡，必然會(huì)消耗生長(zhǎng)過(guò)程所需的部分能量，所以抑制了菌絲的生長(zhǎng)。菌絲內(nèi)營(yíng)養(yǎng)失衡，菌絲無(wú)法獲得營(yíng)養(yǎng)而長(zhǎng)勢(shì)減弱變細(xì)，使得菌絲鮮重下降，進(jìn)一步導(dǎo)致干重下降。而鹽脅迫為300～500 mmol/L處理組的菌絲鮮重和干重趨于平緩，說(shuō)明在高鹽脅迫下，離子平衡無(wú)法維持，隨著膜透性顯著提高，細(xì)胞膜受傷害程度愈加嚴(yán)重，生長(zhǎng)速度極其緩慢，使得各處理組相差不大。六妹羊肚菌菌絲在鹽脅迫下生長(zhǎng)變化與繩狀青霉菌[21]基本一致。

3.2 六妹羊肚菌菌絲膜系統(tǒng)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

電導(dǎo)率是分析膜完整性的重要指標(biāo)。本研究中隨鹽脅迫加深，六妹羊肚菌菌絲的電導(dǎo)率逐漸升高?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)基中鹽濃度升高，菌絲吸收鹽離子，會(huì)造成細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而導(dǎo)致膜的透性變大，培養(yǎng)基中大量的Na+進(jìn)入菌絲細(xì)胞，細(xì)胞膜上結(jié)合的Ca2+被置換，使膜結(jié)合的Na+/Ca2+增加，膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞，功能也隨之改變。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的K+、Mg2+和有機(jī)質(zhì)外滲，使得電導(dǎo)率升高，說(shuō)明鹽對(duì)細(xì)胞膜透性產(chǎn)生影響，且濃度越高，對(duì)膜的破壞程度越大。而細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物是丙二醛，生物膜的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，最終引起菌絲細(xì)胞代謝紊亂[27]，其含量的高低反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度。本實(shí)驗(yàn)中，隨鹽濃度遞增，丙二醛呈上升趨勢(shì)，鹽濃度在200 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明低鹽濃度脅迫對(duì)菌絲傷害較小，自身防御體系能夠保護(hù)細(xì)胞。之后隨鹽濃度繼續(xù)升高，丙二醛逐漸下降，證明菌絲細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度加劇，潛在的保護(hù)膜不受損傷能力持續(xù)降低，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。這與濱海雀稗[27]、金盞菊[28]等研究結(jié)果相似。

3.3 六妹羊肚菌菌絲滲透系統(tǒng)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

滲透調(diào)節(jié)是機(jī)體對(duì)抗逆境脅迫最重要且最為有效的機(jī)制[31]。在一定滲透脅迫條件下，六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，導(dǎo)致滲透壓升高，使其在滲透壓的環(huán)境下仍能夠吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這就是菌絲進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，鹽濃度逐漸加深，造成菌絲細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子數(shù)量減少，而滲透勢(shì)具有“依數(shù)性”特點(diǎn)[32]，因此，滲透勢(shì)降低，最終造成滲透壓升高。隨著鹽濃度升高，可溶性多糖含量顯著下降，鹽濃度大于300 mmol/L時(shí)，可溶性多糖含量趨穩(wěn)，變化不大；而可溶性蛋白和脯氨酸含量呈先上升后下降趨勢(shì)，分別在400、300 mmol/L出現(xiàn)峰值。本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)此結(jié)果可能的原因是可溶性多糖、可溶性蛋白和脯氨酸都是六妹羊肚菌菌絲體內(nèi)重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量能夠影響菌絲細(xì)胞的保水能力，有利于六妹羊肚菌耐鹽性的提高。這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在鹽脅迫下，一方面，對(duì)細(xì)胞膜起保護(hù)作用；另一方面，菌絲為適應(yīng)鹽脅迫，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效利用，供應(yīng)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，以緩解鹽脅迫對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力。由此可見(jiàn)，六妹羊肚菌在一定鹽濃度范圍內(nèi)，能通過(guò)調(diào)節(jié)自身滲透系統(tǒng)來(lái)減輕鹽脅迫傷害，超過(guò)一定范圍，則生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)。這與紫花苜蓿[33]研究結(jié)果基本一致。

3.4 六妹羊肚菌菌絲酶系統(tǒng)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

在不同NaCl添加量的培養(yǎng)基中，菌絲細(xì)胞內(nèi)會(huì)因受到鹽環(huán)境的刺激而產(chǎn)生大量的活性氧自由基，使細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除難以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[34-35]。超氧化物歧化酶（SOD）作為菌絲體內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)之一，具有清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子的作用，而過(guò)氧化物酶（POD）則能夠清除超氧化物歧化酶（SOD）催化反應(yīng)的產(chǎn)物過(guò)氧化氫，從而使菌絲細(xì)胞免受過(guò)氧化氫的毒害。因此，六妹羊肚菌菌絲在鹽脅迫下需要靠超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)多余的自由基。本研究中，隨著培養(yǎng)基中鹽含量的不斷增加，六妹羊肚菌菌絲中的超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，分別在鹽濃度300和200 mmol/L時(shí)，活性達(dá)到最高值，隨之活性呈下降趨勢(shì)。可能的原因是在一定的濃度范圍內(nèi)，超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）可以清除菌絲細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的自由基，但隨著鹽濃度繼續(xù)增加，環(huán)境中大量Na+進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)多種功能被破壞，使生理代謝紊亂，抑制抗氧化酶活性，造成菌絲超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性下降，這與叢枝菌根真菌對(duì)田菁耐鹽性[36]研究結(jié)果相吻合。此外，Jakubowski等[37]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下酵母菌中抗氧化物質(zhì)含量增加，比如超氧化物歧化酶（SOD）的活力增加等，酵母菌在進(jìn)入穩(wěn)定期后會(huì)對(duì)氧化損傷的增強(qiáng)做出適應(yīng)性反應(yīng)，可解釋鹽脅迫下六妹羊肚菌菌絲中抗氧化酶的活性變化。過(guò)氧化氫酶（CAT）具有在鹽害脅迫條件下，延緩衰老的作用[38]，能夠?qū)⒊趸锲缁福⊿OD）等產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，是清除活性氧的關(guān)鍵[39]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著鹽脅迫加深，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在200 mmol/L時(shí)，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性達(dá)到最大值。說(shuō)明在鹽濃度小于200 mmol/L時(shí)，菌絲細(xì)胞內(nèi)通過(guò)產(chǎn)生大量的過(guò)氧化氫酶（CAT）來(lái)抵御逆境帶來(lái)的毒害，而在高鹽脅迫下，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性降低，菌絲進(jìn)入衰老期。

3.5 六妹羊肚菌菌絲對(duì)NaCl脅迫的綜合響應(yīng)

通過(guò)對(duì)本研究中測(cè)定的14個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析，可以得出：在不同鹽濃度下，發(fā)揮指示作用的生理指標(biāo)不同。在鹽濃度為0～100 mmol/L范圍之間時(shí)，六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中主要的指示性指標(biāo)是生長(zhǎng)速度、菌絲直徑、干重、鮮重和胞內(nèi)多糖，說(shuō)明在低鹽濃度脅迫時(shí)，對(duì)六妹羊肚菌菌絲的影響主要表現(xiàn)在菌絲的形態(tài)和生長(zhǎng)指標(biāo)，對(duì)菌絲生理指標(biāo)影響不大；在鹽濃度為100～200 mmol/L范圍之間時(shí)，主要的指示性指標(biāo)是丙二醛、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，說(shuō)明在中鹽濃度脅迫時(shí)，對(duì)六妹羊肚菌菌絲的影響主要表現(xiàn)在膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)，是因?yàn)辂}脅迫到達(dá)一定濃度時(shí)，菌絲細(xì)胞膜遭到破壞，為了抵抗不良環(huán)境，菌絲細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶表達(dá)量逐漸升高；在鹽濃度為200～400 mmol/L范圍之間時(shí)，主要的指示性指標(biāo)是脯氨酸、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）活性，說(shuō)明在高鹽濃度時(shí)，對(duì)六妹羊肚菌菌絲的影響主要是在滲透系統(tǒng)，是因?yàn)樵诟啕}脅迫時(shí)菌絲細(xì)胞膜被嚴(yán)重破壞，開(kāi)始使細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)離子大量外流，造成滲透壓升高。

4 結(jié)論

六妹羊肚菌菌絲體內(nèi)的各項(xiàng)生理指標(biāo)對(duì)鹽脅迫均有一定的響應(yīng)。鹽脅迫下六妹羊肚菌菌絲生長(zhǎng)抑制率、滲透壓和電導(dǎo)率持續(xù)升高，生長(zhǎng)速度、菌絲直徑、生物量和可溶性多糖顯著下降，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和抗氧化酶活性在一定鹽濃度脅迫下呈上升趨勢(shì)，隨著鹽濃度加深，生長(zhǎng)受到抑制，各項(xiàng)生理指標(biāo)開(kāi)始下降。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)六妹羊肚菌菌絲的14個(gè)生理指標(biāo)的主成分分析發(fā)現(xiàn)：在低NaCl濃度（0～100 mmol/L）脅迫時(shí)，生長(zhǎng)速度、菌絲直徑、干重、鮮重和胞內(nèi)多糖對(duì)六妹羊肚菌菌絲的指示性最強(qiáng)；在中 NaCl濃度（100～200 mmol/L）脅迫時(shí)，超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量對(duì)六妹羊肚菌菌絲的指示性最強(qiáng)；在高NaCl濃度（200～400 mmol/L）脅迫時(shí)，脯氨酸、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）活性對(duì)六妹羊肚菌菌絲的指示性最強(qiáng)。此外，本研究測(cè)定了六妹羊肚菌菌絲在鹽脅迫下各項(xiàng)生理指標(biāo)，開(kāi)展耐鹽基因的篩選和挖掘，是下一步研究的重點(diǎn)。