β-葡聚糖糖基化對(duì)裸燕麥蛋白功能性質(zhì)及抗氧化活性的影響

楊志偉，蔣 琳

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

燕麥分為皮燕麥和裸燕麥兩種類型。我國(guó)主要種植裸燕麥，占燕麥總產(chǎn)量的90%以上。燕麥的蛋白質(zhì)含量約為12%～20%[1]，是所有谷物中最高的，其中球蛋白的含量占蛋白質(zhì)含量的近80%[2]。裸燕麥蛋白（naked oat protein isolate，OPI）的氨基酸組成平衡，生物價(jià)為78.7[3]，符合FAO/WHO推薦的營(yíng)養(yǎng)模式。但裸燕麥蛋白溶解性較差，而起泡性和乳化性作為蛋白質(zhì)重要功能性質(zhì)，在食品生產(chǎn)開(kāi)發(fā)利用中的要求也較高[4]。

β-葡聚糖是一種由葡萄糖單元組成的多糖，主要來(lái)源于谷物、食用菌和酵母，具有降血糖、降低血脂、提高免疫力等生物活性[5]。近年來(lái)，β-葡聚糖在醫(yī)藥、功能性食品、功能性配料等健康產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中有了較多的應(yīng)用[6]，但在蛋白質(zhì)糖基化研究中應(yīng)用較少。蛋白質(zhì)糖基化是一種基于美拉德反應(yīng)機(jī)理的化學(xué)修飾方法，是蛋白質(zhì)氨基與還原糖羰基的縮合反應(yīng)。有研究表明糖基化反應(yīng)能使蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性等功能有明顯改善[7]，此外，糖基化產(chǎn)物還具有抗氧化活性[8]。目前文獻(xiàn)未見(jiàn)OPI與β-葡聚糖糖基化改性的研究報(bào)導(dǎo)。

團(tuán)隊(duì)前期研究了超聲波輔助OPI/β-葡聚糖糖基化改性，得到了最佳工藝條件，接枝率為35.79%[9]。本文制備 OPI/β-葡聚糖糖基化復(fù)合物（OPI/β-glucan conjugates，G-OPI），對(duì)不同 pH 環(huán)境下 G-OPI的溶解性、乳化性和起泡性進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)利用SDSPAGE凝膠電泳觀察糖基化過(guò)程中復(fù)合物的生成情況，并通過(guò)內(nèi)源熒光光譜、紅外光譜和圓二色譜技術(shù)分析糖基化改性作用機(jī)理，最后比較了糖基化前后樣品的抗氧化活性。本研究可以提高OPI在食品工業(yè)中的加工適應(yīng)性，為實(shí)際生產(chǎn)使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裸燕麥 本地市售；燕麥β-葡聚糖（≥98%）西安千葉草生物科技公司；ABTS、牛血清白蛋白（分析純）、考馬斯亮藍(lán) R-250、福林酚、廣譜蛋白Marker（11～180 kDa） 北京索萊寶科技公司；硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、硫酸銅、過(guò)硫酸鉀、溴化鉀、氫氧化鈉（分析純） 成都金山化學(xué)試劑公司；酒石酸鉀鈉（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；水楊酸、鹽酸（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；DPPH、維生素C（分析純） 上海源葉生物科技公司；無(wú)水碳酸鈉（≥99.8%） 天津博迪化工公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純） 廣州市金華大化學(xué)試劑公司。

TLE204E分析天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；數(shù)顯pH計(jì) 上海雷磁儀器公司；HH-S6恒溫水浴鍋、HJ-3控溫磁力攪拌器 江蘇金怡儀器科技公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 濟(jì)寧市奧波超聲電氣公司；T25高速分散均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；Beta 2-8 LSCplus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；TECAN酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；722N可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；Nicolet iS10傅立葉變換紅外光儀 美國(guó)熱電公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國(guó) BIO-RAD公司；M0S-450圓二色譜儀 法國(guó)CBIO-LOGIC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 G-OPI樣品制備 裸燕麥提取OPI后，在-80 ℃條件下冷凍干燥24 h后備用。精準(zhǔn)稱取適量的OPI，溶于 pH3、5、7、9、11的磷酸鹽緩沖液（濃度為1%）中配制1%濃度的OPI溶液。按照質(zhì)量比β-葡聚糖:OPI為2:1加入β-葡聚糖，溫度75 ℃下磁力攪拌30 min混合均勻后，用0.5% HCl和0.5%NaOH溶液調(diào)整pH[9]。將混合液放置于超聲儀中制備G-OPI，條件如下：超聲功率240 W，溫度75 ℃，反應(yīng)90 min。反應(yīng)后冰浴冷卻，5000 r/min離心25 min，收集一部分上清液于4 ℃冰箱冷藏備用，其余-80 ℃條件下冷凍干燥24 h后備用。測(cè)定所得G-OPI樣品的接枝率[9]，按 pH3～11各為 33.58%±1.69%、 34.12%±1.19%、 35.62%±2.7%、 38.83%±0.83%、48.9%±8.38%。另同樣程序制備但未經(jīng)超聲處理的樣品作為β-葡聚糖/OPI混合物實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 溶解度的測(cè)定 稱取一定量的OPI，溶于pH3、5、7、9、11的緩沖溶液中，磁力攪拌 30 min，制成1% OPI溶液，此組為OPI實(shí)驗(yàn)組。按照1.2.1中制備出G-OPI樣品的上清液為G-OPI實(shí)驗(yàn)組。用福林酚法測(cè)定糖基化反應(yīng)前后蛋白質(zhì)含量，用于計(jì)算溶解性[10]。

1.2.3 起泡特性的測(cè)定 稱取0.5 g OPI，分別配制pH3、5、7、9、11，濃度 1% 的 OPI溶液 50 mL，磁力攪拌30 min，同樣程序制備G-OPI溶液。50 mL為溶液初始體積V；樣品10000 r/min均質(zhì)2 min，將溶液移至量筒中，記錄溶液總體積V0；溶液靜置30 min后，記錄體積V30。按下式計(jì)算起泡性和起泡穩(wěn)定性。

1.2.4 乳化特性的測(cè)定 取不同pH的1%濃度OPI溶液、G-OPI溶液 5000 r/min離心，各取上清液15 mL，加入5 mL大豆油，均質(zhì)機(jī)10000 r/min均質(zhì)2 min后，取50 μL混合溶液至5 mL 0.1%的SDS溶液中，立即在可見(jiàn)分光光度計(jì)500 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)0。待混合溶液靜置15 min再次測(cè)吸光值A(chǔ)T[7]。按下式計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中：100為稀釋倍數(shù)；2.303為轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.002為蛋白質(zhì)濃度，g/mL；0.25為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)。

式中：15為靜置時(shí)間，min。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析 稱取一定量的OPI、G-OPI凍干樣品（1.2.1 中 pH7 制備），用超純水配制濃度為2 mg/mL的樣品溶液，8000 r/min離心。參照張穎等[11]方法進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。電泳后將凝膠板放入染色液中振蕩染色1 h，用洗脫液脫色，成像處理。

1.2.6 內(nèi)源熒光光譜分析 稱取一定量的OPI，pH7的磷酸鹽緩沖溶液配制成1%的OPI溶液，以糖/蛋白為2:1加入β-葡聚糖，磁力攪拌混合。在超聲功率240 W，溫度60、70、80、90 ℃下分別反應(yīng)75 min，冰浴結(jié)束反應(yīng)，5000 r/min離心25 min，取上清液。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定不同溫度處理的OPI及G-OPI的熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍300～550 nm，狹縫寬度5 nm[12]。

1.2.7 傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜分析 準(zhǔn)備一定量的溴化鉀放入烘箱中，80 ℃ 烘 3 h。精準(zhǔn)稱取 2 mg OPI、G-OPI和β-葡聚糖/OPI混合物樣品（1.2.1中pH7制備，下同），以1:100比例加入溴化鉀進(jìn)行研磨，充分混合成粉末狀，壓制成薄片。以溴化鉀為空白對(duì)照，再用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行400～4000 cm-1的全波段掃描[13]，分析圖譜。

1.2.8 圓二色譜分析 稱取一定量的OPI、G-OPI，用pH7的 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制成0.5 mg/mL樣品溶液，利用圓二色譜儀進(jìn)行測(cè)定。樣品比色皿光徑1 mm，分辨率為 1 nm，掃描范圍190～250 nm，掃描速度60 nm/min，譜帶寬度0.5 nm。

1.2.9 DPPH·清除活性的測(cè)定 OPI組、G-OPI組和β-葡聚糖/OPI混合物組樣品各用蒸餾水配制成濃度為 0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/mL的溶液。選取0.01 mg/mL的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。參照Chaiittianan等[14]的方法，取2 mL不同濃度的樣液與2 mL DPPH溶液加入離心管充分混合，室溫下避光反應(yīng) 30 min，8000 g離心 10 min，用移液槍吸取200 μL反應(yīng)溶液加入96孔板中，于517 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)。

式中：A1為待測(cè)樣品溶液+DPPH溶液的吸光度；A0為蒸餾水+DPPH溶液的吸光度。

1.2.10 ABTS+·清除活性的測(cè)定 各組樣品溶液濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/mL。選取0.01 mg/mL的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。參照Z(yǔ)uo等[15]的方法，取50 μL樣液加入96孔板中，再加入150 μL ABTS溶液，室溫下靜置1 h，于734 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)。

式中：A1為待測(cè)樣品溶液+ABTS溶液的吸光度；A0為蒸餾水+ABTS溶液的吸光度。

1.2.11 羥基自由基（·OH）清除活性的測(cè)定 各組樣品溶液濃度為 0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL溶液。選取5 mg/mL的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。參照Pan等[16]的方法，取200 μL反應(yīng)溶液加入96孔板中，于536 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)。

式中：A1為待測(cè)樣品溶液+FeSO4溶液+H2O2溶液+水楊酸溶液；A0為蒸餾水+FeSO4溶液+H2O2溶液+水楊酸溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，所有測(cè)定重復(fù)3次。數(shù)據(jù)初處理和圖像制作采用Origin 8.0，差異顯著性分析（LSD法）采用SPSS 20.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)OPI和G-OPI溶解性的影響

由圖1可知，在pH3～11范圍內(nèi)，OPI在pH5時(shí)溶解度最低，這是因?yàn)镺PI的等電點(diǎn)在pH5附近。OPI與β-葡聚糖糖基化反應(yīng)提高了G-OPI在pH5、7、9、11條件下的溶解度（P＜0.05），特別是在 pH5時(shí)，糖基化后的溶解度由4%±0.03%提高至12.25%±0.02%（P＜0.05），較 OPI溶解度提高了 3.06倍。這是因?yàn)镺PI與β-葡聚糖共價(jià)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子中引入了親水性羥基，使得蛋白質(zhì)與水分子的親和力增加，進(jìn)而使得蛋白的溶解度升高。各G-OPI樣品的接枝率隨pH升高而增大，G-OPI的溶解度也隨著增大，但OPI在堿性區(qū)域的溶解度也增加了，這可能與強(qiáng)堿環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。Yu等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，糖基化反應(yīng)過(guò)程會(huì)使得溶液的pH下降，但pH下降的幅度在0.3～0.6之間，在一個(gè)pH單位內(nèi)，影響不大。此外，糖基化影響蛋白質(zhì)表面電荷，zeta電位值升高較大[18]，蛋白分子的靜電斥力增大，減少了聚集的發(fā)生。同時(shí)，β-葡聚糖的空間位阻作用使得部分蛋白質(zhì)無(wú)法聚集沉淀，使得蛋白溶解度增大[19]。

圖1 不同pH條件下糖基化反應(yīng)前后裸燕麥蛋白質(zhì)的溶解度Fig.1 Solubility of naked oat protein before and after glycosylation at different pH conditions

2.2 pH對(duì)OPI和G-OPI起泡特性的影響

如圖2a所示，G-OPI在pH3～11范圍內(nèi)的起泡性都明顯高于OPI，在pH3時(shí)，G-OPI的起泡性由OPI的50%±4.67%提高至216.65%±4.74%，提高了4.32倍。在pH5時(shí)，樣品的起泡性最低，但G-OPI仍提高5倍，這與樣品溶解度的變化相似。在本實(shí)驗(yàn)中，裸燕麥蛋白糖基化改性引入親水性羥基，增加了蛋白的水溶性，這使得可溶性蛋白被起泡吸附以降低表面張力，使蛋白質(zhì)逐漸凝固在氣液界面間形成有一定剛性和彈性的薄膜。同時(shí)，裸燕麥蛋白與β-葡聚糖共價(jià)結(jié)合可以使蛋白質(zhì)有效地在汽/液界面進(jìn)行擴(kuò)散，液膜黏彈性增加，從而改善蛋白起泡性[20]。由圖2b可知，在堿性條件下，OPI的起泡穩(wěn)定性優(yōu)于G-OPI。在酸性條件下，當(dāng)pH3時(shí)，OPI的起泡穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于 G-OPI（P＜0.05），pH5 和 pH7 時(shí)，G-OPI起泡穩(wěn)定性較OPI更好（P＜0.05）。在接近蛋白等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的排斥力小[21]，局部環(huán)境下G-OPI濃度變大，有利于蛋白質(zhì)形成黏稠的薄膜，維持泡沫形狀，從而增加泡沫穩(wěn)定性。

圖2 不同pH條件下糖基化反應(yīng)前后裸燕麥蛋白質(zhì)起泡特性Fig.2 Foaming properties of naked oat protein before and after glycosylation at different pH conditions

2.3 pH對(duì)OPI和G-OPI乳化特性的影響

由圖3a可知，在 pH3和 pH7條件下，G-OPI與OPI的乳化性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在弱酸性pH5條件下，G-OPI和OPI的乳化性都是最低的，但G-OPI的乳化性為16.86±1.68 m2/g，較OPI的6.79±0.19 m2/g提升了2.48倍。在堿性條件下pH越大，樣品的乳化性質(zhì)越好，且G-OPI的乳化性都優(yōu)于OPI。這與陳世超[22]的研究結(jié)果相似。這是因?yàn)樵谌榛^(guò)程中，蛋白質(zhì)分子中的疏水殘基可以附著在油滴表面,而油滴旁的水分子可以被糖分子吸附，使蛋白質(zhì)溶液的表面張力降低，G-OPI表面的親水/疏水平衡有利于乳化性的提高[23]。

圖3 不同pH條件下糖基化反應(yīng)前后裸燕麥蛋白質(zhì)乳化特性Fig.3 Emulsifying properties of naked oat protein before and after glycosylation at different pH conditions

由圖3b所示，在pH5時(shí)，樣品乳化穩(wěn)定性為最大值，G-OPI乳化穩(wěn)定性為 373.93±7.5 min，較 OPI的144.55±8.89 min提高了2.59倍。pH5時(shí)蛋白溶解度低，OPI不易于形成乳化液，但OPI的疏水性基團(tuán)暴露較多，在已形成的乳化液油相與水相界面，疏水性基團(tuán)伸入油相。同時(shí)靜電斥力弱，使蛋白覆蓋在油滴表面形成了水油界面的另一相，降低了界面自由能，乳化穩(wěn)定性得到提高。β-葡聚糖為線性多糖[24]，在pH5時(shí)有可能產(chǎn)生酸降解[25]，得到低聚糖。低聚糖成為油水界面的又一個(gè)降低界面自由能的因素，使得乳化穩(wěn)定性大幅提高。而在pH3時(shí)，較強(qiáng)的酸環(huán)境產(chǎn)生的酸降解結(jié)果，不如pH5時(shí)利于提高乳化穩(wěn)定性。中性和堿性條件下，G-OPI的乳化穩(wěn)定性較原蛋白都有了一定提高（P＜0.05）。這是因?yàn)棣?葡聚糖的大分子所形成的空間位阻作用有助于在油滴周圍形成大分子穩(wěn)定膜，有效地阻止了油滴的聚集和乳化狀態(tài)的破壞[26]，同時(shí)，β-葡聚糖的加入增加了油/水體系中水的黏度，降低了油/水界面張力，從而提高了蛋白的乳化穩(wěn)定性[22]。

除上述討論外，pH對(duì)OPI和G-OPI溶液乳化特性的影響，還可能與蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的酸堿性，在不同pH環(huán)境解離程度有關(guān)。多個(gè)基團(tuán)不同程度的解離，最終呈現(xiàn)的結(jié)果會(huì)影響到溶液微環(huán)境的酸堿性，表現(xiàn)出不同的乳化特性。這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

由圖4所示，G-OPI在P1處新增了條帶，這是因?yàn)樘腔男赃^(guò)程中，部分裸燕麥蛋白質(zhì)亞基經(jīng)過(guò)聚集產(chǎn)生了更大分子量的條帶。在電泳過(guò)程中，大分子量的蛋白無(wú)法通過(guò)濃縮膠與分離膠，最終聚集在P1位置。臧艷妮等[27]研究葡萄糖糖基化改性小麥面筋蛋白，電泳圖反映出糖基化改性后的蛋白新增了兩個(gè)條帶，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，在11～17 kDa處G-OPI的條帶減弱消失，這在一定程度上說(shuō)明小分子量的OPI更多地參與到了糖基化反應(yīng)中。穆利霞等[28]在研究阿拉伯膠-大豆分離蛋白接枝反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)接枝反應(yīng)后的蛋白電泳圖譜上的亞基條帶顏色較原蛋白的要淺得多，原因是在接枝反應(yīng)過(guò)程中自由氨基減少，導(dǎo)致考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)分子的顯色降低，條帶變淺，間接證明了蛋白與糖以共價(jià)鍵結(jié)合。

圖4 OPI和G-OPI的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of OPI and G-OPI

2.5 內(nèi)源熒光光譜分析

由圖5可以看出，OPI隨著環(huán)境溫度的升高，熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。G-OPI熒光強(qiáng)度的降低是因?yàn)闇囟鹊纳叽龠M(jìn)了糖基化反應(yīng)，而80 ℃時(shí)G-OPI熒光強(qiáng)度低于90 ℃的，可推測(cè)80 ℃的環(huán)境下糖基化反應(yīng)程度高于90 ℃的。β-葡聚糖的大分子性產(chǎn)生了某種程度的空間位阻作用，部分屏蔽了色氨酸殘基，使之熒光信號(hào)受到了削弱。夏琪娜[29]在葡萄糖糖基化改性酪蛋白研究中也報(bào)導(dǎo)了相似的結(jié)果，糖基化過(guò)程強(qiáng)化后蛋白熒光強(qiáng)度明顯降低。陳爽等[12]在研究VD3對(duì)大豆分離蛋白改性作用中，也發(fā)現(xiàn)蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，分析原因可能是VD3的存在導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)部色氨酸殘基被遮蔽而使蛋白熒光強(qiáng)度降低。在圖5中還可以看到GOPI的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了明顯紅移，這表明OPI在糖基化反應(yīng)過(guò)程中，自由氨基與多糖由羥基發(fā)生共價(jià)結(jié)合后產(chǎn)生了親水環(huán)境轉(zhuǎn)變[14]。因此，OPI的溶解性經(jīng)糖基化改性得到提高，同時(shí)乳化性和起泡性也得到一定改善。

圖5 OPI和G-OPI的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectrum of OPI and G-OPI

2.6 FTIR光譜分析

由已發(fā)表文獻(xiàn)的燕麥β-葡聚糖FTIR光譜圖[30]，對(duì)照?qǐng)D6中β-葡聚糖/OPI混合物和G-OPI光譜圖分析，一些區(qū)域的吸收峰顯示了β-葡聚糖的特征。在3410 cm-1附近對(duì)應(yīng)于O-H振動(dòng)、2920 cm-1附近對(duì)應(yīng)于C-H振動(dòng)、1040 cm-1附近對(duì)應(yīng)于吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)C-O、898 cm-1附近對(duì)應(yīng)于C-H的β-連接、611 cm-1附近對(duì)應(yīng)于糖分子中C-H角振動(dòng)。這些特征證實(shí)了燕麥β-葡聚糖在β-葡聚糖/OPI混合物和G-OPI樣品中的存在。

圖6 OPI、G-OPI和β-葡聚糖/OPI混合物的FTIR光譜圖Fig.6 FTIR spectrum of OPI, G-OPI and β-glucan/OPI mixture

從圖6中可以看出，與OPI相比，G-OPI在波數(shù)3700～3200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了明顯的吸收峰，這是游離-OH伸縮振動(dòng)引起的，表明OPI以共價(jià)鍵的方式與糖分子連接；同時(shí)，在波數(shù)1200～1000 cm-1范圍處，G-OPI出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰，這是由糖苷鍵CO-C振動(dòng)引起的，這兩個(gè)特征表明OPI發(fā)生了糖基化反應(yīng)引入糖分子[31]。而β-葡聚糖/OPI混合物在這兩個(gè)范圍的吸收峰特征與G-OPI差異明顯，說(shuō)明β-葡聚糖與OPI只是單純的物理混合，兩者沒(méi)有發(fā)生化學(xué)結(jié)合。趙城彬等[13]利用葡萄糖糖基化改性大豆分離蛋白，紅外光譜顯示大豆蛋白糖基化復(fù)合物在3700～3200和 1260～1000 cm-1處出現(xiàn)明顯吸收峰，與本文結(jié)果相似。張瑤[32]研究也發(fā)現(xiàn)，紅外光譜在3700～3200 cm-1范圍內(nèi)的-OH伸縮振動(dòng)峰變寬是由于糖基化反應(yīng)后葡聚糖分子以共價(jià)鍵形式與大豆分離蛋白結(jié)合引起。從圖6還可以看出，在波數(shù)1655、1539、1233 cm-1處，吸收峰表現(xiàn)出了不同程度的變化，這三個(gè)波數(shù)分別在酰胺i帶，酰胺ii帶和酰胺iii帶的波數(shù)范圍內(nèi)，表明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化。

2.7 圓二色譜分析

圓二色譜圖可以反映出蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象信息。從圖7中可以看出，與OPI相比，G-OPI的圓二色譜曲線發(fā)生了明顯變化，表明糖基化反應(yīng)改變了OPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)合圖6的分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變一方面是β-葡聚糖與蛋白的共價(jià)結(jié)合使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更舒展，進(jìn)而對(duì)蛋白的功能性質(zhì)起到了改善作用[27]。另一方面是因?yàn)楦邷丶俺曁幚硎沟玫鞍踪|(zhì)變性，張蓓[33]在測(cè)定燕麥蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的圓二色譜中發(fā)現(xiàn)，燕麥蛋白受熱使得二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋減少，蛋白質(zhì)的構(gòu)象由于熱變性的原因變得不規(guī)則，更為疏松。超聲處理糖基化，蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，使得分子結(jié)構(gòu)更松散[34]。

圖7 OPI和G-OPI的圓二色譜圖Fig.7 Circular dichroism spectrum of OPI and G-OPI

2.8 DPPH·清除活性分析

由圖8可知，隨著濃度升高，OPI和G-OPI的DPPH·清除率逐漸增大。其中，OPI在濃度 0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)DPPH·清除率增長(zhǎng)不明顯；當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，OPI清除能力為30.78%±2.96%，G-OPI的DPPH·清除率達(dá)到65.58%±1.13%，是OPI的2.13倍。同時(shí)，β-葡聚糖/OPI混合物具有一定抗氧化能力，但相同濃度時(shí)其對(duì)DPPH·的清除率均小于 OPI和 G-OPI。

圖8 OPI、G-OPI和 β-葡聚糖/OPI混合物DPPH·清除率Fig.8 DPPH radical scavenging capacity of OPI, G-OPI and β-glucan/OPI mixture

2.9 ABTS+·清除活性分析

由圖9 可以看出，OPI、G-OPI和β-葡聚糖/OPI混合物都具有清除ABTS+·的能力，呈現(xiàn)出劑量依賴性。在濃度為2.5 mg/mL時(shí)，G-OPI的ABTS+·清除率是OPI的2.09倍。當(dāng)G-OPI的濃度升高至5 mg/mL時(shí)，ABTS+·清除能力達(dá)到最大值95.29%±0.53%，而后增加趨于平緩。在相同濃度范圍內(nèi)，糖基化改性后的G-OPI的ABTS+·清除能力高于OPI與β-葡聚糖/OPI混合物。

圖9 OPI、G-OPI和 β-葡聚糖/OPI混合物ABTS+·清除率Fig.9 ABTS+· cation radical scavenging activity of OPI,G-OPI and β-glucan/OPI mixture

2.10 ·OH清除活性分析

過(guò)量的·OH能在人體內(nèi)造成體組織脂質(zhì)過(guò)氧化、核酸斷裂[35]，造成機(jī)體損壞產(chǎn)生疾病，使人體衰老。由圖10所示，OPI和 G-OPI都表現(xiàn)出清除·OH的能力，在濃度0.5 mg/mL條件下，G-OPI的·OH 清除率略高于 OPI（P＜0.05），隨著濃度升高，清除能力也逐漸增大，當(dāng)溶液濃度為5 mg/mL時(shí)，OPI的清除率為90.17%±0.46%，G-OPI的清除率為90.57%±0.05%，兩組數(shù)據(jù)相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。另外，從圖中看到β-葡聚糖/OPI混合物對(duì)·OH的清除能力較弱。

圖10 OPI、G-OPI和 β-葡聚糖/OPI混合物·OH 清除率Fig.10 Hydroxyl radical scavenging activity of OPI, G-OPI and β-glucan/OPI mixture

3 結(jié)論

裸燕麥蛋白與燕麥β-葡聚糖經(jīng)過(guò)超聲糖基化處理，可以改善原裸燕麥蛋白的一些功能性質(zhì)。在pH3、5、7、9、11的處理設(shè)定下，堿性條件內(nèi)復(fù)合物的接枝率比酸性和中性條件高。除了pH3的強(qiáng)酸條件，G-OPI的溶解性在各不同pH都比OPI高，最大在pH5時(shí)提高了3.06倍。G-OPI的起泡性在不同的pH均比OPI表現(xiàn)良好，但起泡穩(wěn)定性只在弱酸性 pH5和中性條件 pH7時(shí)比 OPI提高，在其他pH不如OPI。G-OPI在pH5和堿性條件下乳化性比OPI提高，pH5時(shí)為2.48倍；G-OPI乳化穩(wěn)定性在pH5和pH11時(shí)提高較大，pH5時(shí)達(dá)到2.59倍。SDS-PAGE凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，糖基化改性后有大分子物質(zhì)生成。經(jīng)過(guò)內(nèi)源熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)超聲處理時(shí)溫度的提高會(huì)促進(jìn)G-OPI的糖基化進(jìn)程，但80 ℃后會(huì)逆轉(zhuǎn)；而且糖基化反應(yīng)使得G-OPI結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，溶液體系向親水環(huán)境轉(zhuǎn)變。說(shuō)明G-OPI的溶解度提高，以及其他功能性質(zhì)的改善，源自于糖基化過(guò)程O(píng)PI引入了糖分子。G-OPI的FTIR光譜證明了β-葡聚糖與OPI的羥基共價(jià)結(jié)合，而且在酰胺帶區(qū)域的吸收峰值變化顯示蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了改變。而圓二色譜分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，β-葡聚糖與蛋白的共價(jià)結(jié)合使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更舒展，進(jìn)而對(duì)蛋白的功能性質(zhì)起到了改善作用。G-OPI的DPPH·和ABTS+·清除能力在相同濃度下均比OPI強(qiáng)，但·OH清除能力兩者差異不大。

論文研究結(jié)果得到了不同pH范圍G-OPI功能性質(zhì)特點(diǎn)，及抗氧化活性能力，對(duì)裸燕麥蛋白不同的產(chǎn)品形態(tài)開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論與實(shí)踐參考。今后可以在β-葡聚糖復(fù)合過(guò)程中OPI的具體結(jié)構(gòu)變化與功能性質(zhì)、生理活性機(jī)理關(guān)聯(lián)方面做進(jìn)一步研究。