青天葵多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其抗氧化活性分析

李哲明，謝集照，羅 迪，武鑫鐸，何詩(shī)能，邱 莉

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021）

青天葵為蘭科植物毛唇芋蘭Nervilia fordii（Hance） Schltr.的塊莖和全草，別名獨(dú)葉蓮、珍珠草、獨(dú)腳蓮、珍珠葉等，主要分布于廣東、廣西、云南、四川等地[1-2]。在東南亞地區(qū)和我國(guó)兩廣地區(qū)，青天葵全草為民間習(xí)用的涼茶藥材之一，也常與瘦肉燉湯食用，是嶺南地區(qū)常用的具有清熱潤(rùn)肺止咳、解毒散瘀止痛的藥食兩用的藥材[3-4]。目前，研究者已從青天葵全草中分離得到黃酮[5-6]、萜類(lèi)[7]、氨基酸和揮發(fā)油等一些小分子化合物。相關(guān)藥理學(xué)研究證實(shí)這些化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等活性[8]。

多糖又稱為多聚糖，由多個(gè)單糖或單糖衍生物經(jīng)過(guò)聚合生成的聚合度大于10的大分子化合物，主要分為植物多糖、動(dòng)物多糖及微生物多糖[9]。植物多糖由于在增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎作用等方面具有良好的應(yīng)用前景及來(lái)源廣與無(wú)毒副作用的特性，越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外研究者們的興趣[10]。多糖的藥理活性與多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)如分子量、單糖組成、取代基種類(lèi)和數(shù)目、支化度等有關(guān)，還與多糖的空間高級(jí)結(jié)構(gòu)以及多糖的溶解度等多種因素有關(guān)。當(dāng)多糖任一構(gòu)成因素發(fā)生變化時(shí)，其藥理活性可能會(huì)相應(yīng)改變。

本課題組在前期研究中，采用水提醇沉法獲得青天葵多糖，通過(guò)DEAE-52和葡聚糖凝膠G-100層析柱分離純化了7個(gè)多糖組份。截至目前，本課題組已經(jīng)報(bào)道了兩個(gè)青天葵均一多糖（NFP-A4和NFP-1）的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)表征及其免疫調(diào)節(jié)活性[11-12]。研究結(jié)果表明，這兩個(gè)均一多糖無(wú)論分子量、單糖組成、取代基種類(lèi)，還是藥理活性都存在較大差異，體現(xiàn)了青天葵多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性的多樣性。因此，本文繼續(xù)研究第三個(gè)多糖組分NFP-2的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)表征，以及測(cè)定NFP-2對(duì)DPPH、羥基、ABTS陽(yáng)離子、超氧陰離子等自由基的清除能力，為豐富青天葵多糖結(jié)構(gòu)和活性探討提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青天葵全草 廣西一心醫(yī)藥有限公司（產(chǎn)地為廣西）；單糖標(biāo)品（氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖） 美國(guó)Sigma公司；DEAE-52纖維素 上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠 Pharmacia Biotech公司；透析袋（分子截留量3500 Da） 美國(guó)Viskase公司；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LC-20A高效液相色譜儀、mini-1240紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司；PerkinElmer One FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司；FD-1A-50型冷凍干燥器 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDL-4型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SpectraMaxPlus384型連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；CQ 50型超聲波水浴 上海超聲波儀器廠；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青天葵總多糖樣品的制備 取青天葵干燥全草，粉碎，過(guò)24目篩，得到粗粉。取800 g青天葵粉末，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃減壓濃縮。用無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)濃縮液至含乙醇量至80%，4 ℃冰箱靜置24 h，離心，丟棄上清液，取沉淀；沉淀溶于適量去離子水中，Sevag 法 [氯仿:正丁醇=5:1（v/v）]除去游離蛋白，離心，取上清液，重復(fù)5次，冷凍干燥得到青天葵總多糖[13]。

1.2.2 青天葵總多糖的分離純化 取青天葵總多糖20 g，加50 mL 60 ℃蒸餾水溶解后，然后在3500 r/min離心10 min，取上清液，緩慢滴加到活化且平衡后的DEAE-52層析柱上（φ3.6×45 cm），以蒸餾水、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.2 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。每梯度洗脫液的洗脫體積約為1000 mL，每管收集20 mL，隔管檢測(cè)490 nm（苯酚-硫酸顯色后）下的吸光度，繪制洗脫曲線。通過(guò)洗脫曲線選取最佳洗脫峰，收集洗脫峰處的洗脫液，濃縮，透析，冷凍干燥得到 7 個(gè)組分（DT-1～DT-7）。

取組分DT-2（0.9 g），加5 mL 60 ℃蒸餾水溶解后，3500 r/min離心 10 min，取上清液，滴加到Sephadex G-100葡聚糖凝膠色譜柱上（φ1.2×25 cm），100 mL洗脫，2 mL/管收集流份。隔管檢測(cè)490 nm（苯酚-硫酸顯色后）下的吸光度值，繪制洗脫曲線，收集峰尖部分溶液，濃縮，透析，冷凍干燥得到樣品（NFP-2）待分析。

1.2.3 青天葵多糖NFP-2的基本理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.3.1 NFP-2總糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[14]，分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液于10 mL具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，各加入1.0 mL的5%苯酚溶液，渦旋混勻，立即加入5 mL的濃硫酸，反應(yīng)20 min后，在490 nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

1.2.3.2 NFP-2蛋白含量測(cè)定 采用Lowry法[15]，分別吸取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的牛血清蛋白（BSA）對(duì)照品溶液于10 mL具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，各加入5 mL堿式碳酸銅溶液，混合均勻，置于室溫反應(yīng)10 min后，加入0.5 mL福林酚試劑并放置30 min，顯色后在650 nm處測(cè)定吸光度值。以BSA含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.2.3.3 NFP-2糖醛酸含量測(cè)定 采用硫酸-咔唑法[16]，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的半乳糖醛酸對(duì)照品溶液于10 mL具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，冰浴條件下各加入四硼酸鈉-硫酸溶液5 mL，渦旋混勻，置于恒溫水浴鍋中加熱煮沸20 min，取出后立即冰水冷卻至室溫，加入0.15%咔唑溶液，塞上塞子后，渦旋混勻，室溫下保持2 h后于523 nm下測(cè)定吸光度。以半乳糖醛酸含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖醛酸含量。

1.2.4 NFP-2分子質(zhì)量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[17]，利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatograph，HPGPC）測(cè)量均一多糖的分子質(zhì)量。色譜條件如下：TSKgel G4000PWxl凝膠柱（7.8×300 mm，10 μm）；流動(dòng)相 1 mL/min 三蒸水；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；示差折光檢測(cè)器。分別取10 μL 10 mg/mL系列Dextran標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液（分子質(zhì)量分別為70、150、270、410、500、1100、2000 kDa）注入高效液相色譜儀，繪制其分子量對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間（tR）的關(guān)系曲線。將等量多糖樣品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣，根據(jù)其保留時(shí)間和關(guān)系曲線計(jì)算多糖分子質(zhì)量。

1.2.5 NFP-2單糖組成比例 稱取多糖樣品5 mg，加入10 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，油浴110 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入2 mL甲醇減壓蒸干，重復(fù)操作3次，以完全除去TFA。加入蒸餾水溶解樣品，取100 μL樣品溶液，置于1.5 mL的離心管中，然后參照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進(jìn)行衍生。反應(yīng)結(jié)束后，上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備高效液相色譜分析用。色譜條件如下：Inertsil ODS C-18柱（4.6 ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為 1.0 mL/min乙腈/磷酸鹽緩沖液（18:82，v/v）；檢測(cè)波長(zhǎng) 245 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10.0 μL。分別配制單糖（氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖）標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mg/mL，依照上述色譜方法分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積，可以確定多糖樣品中的單糖組成和計(jì)算摩爾百分比[17]。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取干燥的多糖樣品1～2 mg與200 mg溴化鉀研磨，壓制成透明的圓形薄片，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.7 剛果紅實(shí)驗(yàn) 取6份2 mg/mL的多糖溶液1.0 mL，分別加入3.0 mL 不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mol/L）的NaOH溶液，然后再加入0.5 mL蒸餾水和1.5 mL 0.2 mmol/L剛果紅溶液，渦旋混勻，靜置1 h，設(shè)定200～800 nm掃描范圍，記錄各濃度NaOH溶液的最大吸收波長(zhǎng)（λmax），空白對(duì)照組以蒸餾水替代多糖溶液[18]。

1.2.8 青天葵多糖的抗氧化活性

1.2.8.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[19]方法測(cè)定。首先，將ABTS粉末溶于2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液中生成 ABTS原液（7 mmol/L），然后在室溫下于避光靜置12 h后，用乙醇稀釋至0.2 mmol/L。取96孔板，相應(yīng)孔中加入180 μL ABTS溶液（0.2 mmol/L）與 20 μL 不同濃度的多糖溶液混合（0、0.2、0.5、1、2、4、8、10 mg/mL），混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，在734 nm處測(cè)定吸光度。

式中：A0為實(shí)驗(yàn)組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對(duì)照（以去離子水代替多糖溶液）。

1.2.8.2 羥基自由基清除率的測(cè)定 參照邵佳等[20]的方法測(cè)定。取96孔板，相應(yīng)孔中分別加入50 μL的不同濃度的青天葵多糖溶液（0、1、2、4、6、8、10 mg/mL），然后依次加4 mmol/L硫酸亞鐵溶液50 μL 及 4 mmol/L 過(guò)氧化氫溶液 50 μL，混勻，室溫反應(yīng)10 min，然后加入4 mmol/L水楊酸溶液50 μL，混勻，室溫反應(yīng)30 min，于510 nm處分別測(cè)定各孔吸光度，記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算多糖對(duì)羥基自由基的清除率，即公式為：

式中：A0為實(shí)驗(yàn)組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對(duì)照（以去離子水代替多糖溶液）。

1.2.8.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]方法測(cè)定。取96孔板，相應(yīng)孔中分別加入50 μL不同濃度的青天葵多糖溶液（0、0.5、1、2、4、8、10 mg/mL），再加入 100 μL 0.2 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度，測(cè)量3次。空白組以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率，按公式（1）計(jì)算：

式中：A0為實(shí)驗(yàn)組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對(duì)照（以去離子水代替多糖溶液）。

1.2.8.4 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[22]測(cè)定。取96孔板，相應(yīng)孔中加入 150 μL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH8.2），再分別加入30 μL不同濃度的青天葵多糖（0、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL），混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，然后加入30 μL的沒(méi)食子酸溶液（6 mmol/L），混勻，室溫避光反應(yīng) 3 min，最后加30 μL 8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。在325 nm處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以用30 μL蒸餾水取代沒(méi)食子酸溶液，其他步驟如上操作，測(cè)吸光度，計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。

式中：A0為實(shí)驗(yàn)組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對(duì)照（以去離子水代替多糖溶液）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青天葵多糖組分NFP-2的純化

青天葵總多糖過(guò)DEAE-52纖維素層析柱，經(jīng)蒸餾水、NaCl溶液梯度洗脫，洗脫曲線如圖1所示，按照洗脫峰收集組分，共收集7個(gè)流份（DT-1～DT-7），分別減壓濃縮、透析、凍干后進(jìn)一步純化。

圖1 青天葵多糖DT-2的DEAE-52纖維素柱層析圖Fig.1 Elution curve of DT-2 from DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatogram

將離子交換層析分離得到的DT-2溶于水進(jìn)一步分離純化，上樣于Sephadex G-100凝膠柱，洗脫曲線如圖2所示。收集峰尖部分，透析，濃縮，凍干后得到組分NFP-2進(jìn)行下一步分析。

圖2 青天葵多糖NFP-2的Sephadex G-100柱層析結(jié)果Fig.2 Elution curve of NFP-2 from Sephadex G-100 gel filtration chromatogram

2.2 青天葵多糖NFP-2的基本理化特性

多糖NFP-2易溶于熱水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)試劑，經(jīng)過(guò)測(cè)定其總糖含量為82.64%，糖醛酸含量為16.65%，蛋白質(zhì)含量為6.38%。

2.3 青天葵多糖NFP-2的分子量及單糖組成

HPGPC測(cè)定結(jié)果如圖3所示，色譜圖出現(xiàn)一個(gè)單峰，確認(rèn)NFP-2為單一組分，純度為92.12%。根據(jù)多糖NFP-2的色譜保留時(shí)間帶入標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量回歸曲線（lgMw=-0.3395Rt+8.4278，R2=0.9661），推算得到NFP-2的分子量為1150 kDa；經(jīng)酸水解、高效液相色譜分析其單糖組成，結(jié)果如圖4所示，主要由半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸，其摩爾比為21.27:13.21:5.26:3.02:2.82:1，并含有少量的木糖、葡萄糖醛酸。

圖3 青天葵多糖NFP-2的HPGPC色譜圖Fig.3 HPGPC chromatogram of NFP-2

圖4 基于PMP柱前衍生的青天葵多糖NFP-2（A）和標(biāo)準(zhǔn)品（B）的單糖液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of the PMP derivatives of NFP-2 hydrolysate sample （A） and standard monosaccharide mixture （B）

2.4 紅外光譜分析

NFP-2的紅外光譜圖如圖5所示，3401 cm-1處附近出現(xiàn)的強(qiáng)且寬的吸收峰歸屬于-OH的伸縮振動(dòng)峰，是糖類(lèi)的特征吸收峰，說(shuō)明青天葵多糖NFP-2具有分子間氫鍵[23]。2931 cm-1處則發(fā)現(xiàn)甲基-CH3或次甲基-CH2的C-H的伸縮振動(dòng)峰，是典型的多糖特征[24]，1400～1200 cm-1處出現(xiàn)C-H伸縮和變角振動(dòng)峰，可初步判定為糖類(lèi)化合物[25]。在1618 cm-1的-NH2和-NH3的特征吸收峰，說(shuō)明存在蛋白多糖峰[26]，與蛋白質(zhì)含量測(cè)定一致。1072 cm-1的吸收峰顯示多糖糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型[27]。894 cm-1處的弱峰為吡喃環(huán)的β-端差向異構(gòu)的C-H變角振動(dòng)產(chǎn)生的[28]。由此推測(cè)多糖NFP-2為β-吡喃型多糖[29]。

圖5 青天葵多糖NFP-2的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of NFP-2

2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

剛果紅實(shí)驗(yàn)是研究多糖分子構(gòu)象特性一種有效地方法。剛果紅可以與具有螺旋構(gòu)象的多糖分子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生的絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)與純剛果紅相比會(huì)發(fā)生紅移[30]。從圖6可知，與純剛果紅溶液的λmax相比，剛果紅-NFP-2多糖復(fù)合物的λmax發(fā)生紅移。當(dāng)添加不同濃度的NaOH溶液時(shí)，多糖的螺旋結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)不同程度的展開(kāi)，使復(fù)合物的λmax值減小，當(dāng)NaOH濃度為 0～0.4 mol/L時(shí)，復(fù)合物的λmax值發(fā)生變化。與純剛果紅溶液相比，NFP-2在各濃度的NaOH溶液中均無(wú)明顯紅移。因此，可以推斷NFP-2在水溶液中缺乏三股螺旋構(gòu)象。剛果紅分析法只是確定多糖構(gòu)象結(jié)構(gòu)的初步方法，還需要其他方法來(lái)確定多糖的確切結(jié)構(gòu)。

圖6 青天葵多糖NFP-2與剛果紅復(fù)合物在不同濃度NaOH溶液中的λmax變化Fig.6 Changes in the absorption maximum λmax of NFP-2 vatious concentrations of sodilum hydrolysis complexed with Congo red

2.6 青天葵多糖NFP-2抗氧化活性分析

大量醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、神經(jīng)性疾病等多種疾病都與氧化脅迫有關(guān)。當(dāng)機(jī)體內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的活性氧、活性氮超出人體自身抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的范圍就會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害。許多外源性物質(zhì)如抗壞血酸、維生素E以及各種多酚物質(zhì)可以抵抗活性氧造成的危害[31]。各種食品、天然動(dòng)植物中富含這些物質(zhì)，是保護(hù)人體健康的重要來(lái)源。因此抗氧化能力是評(píng)價(jià)食品、藥品功效的一個(gè)重要指標(biāo)。

目前使用的抗氧化測(cè)定方法非常多，以清除自由基測(cè)定抗氧化能力的方法是目前最流行、使用最多的方法。根據(jù)自由基的種類(lèi)不同可以分為兩大類(lèi)：生物體中存在的自由基：超氧自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基等；人工合成的自由基。目前最常用的自由基清除測(cè)定方法有ABTS法、羥自由基清除能力、DPPH法和超氧自由基清除能力法。研究表明多糖產(chǎn)生抗氧化性的機(jī)制之一是多糖可以直接與自由基發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到抗氧化作用[30]。為了研究多糖NFP-2的抗氧化能力，本文選擇DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基測(cè)定NFP-2的清除自由基的能力。

從圖7A～圖7B中可知，NFP-2具有清除ABTS陽(yáng)離子自由基、羥基自由基的活性，并且清除能力在0.1～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，隨著濃度增大而增強(qiáng)。在0.1～10 mg/mL內(nèi)，NFP-2對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率從9.43%增強(qiáng)到35.44%；對(duì)羥基自由基的清除率從10.09%增強(qiáng)到57.55%，其IC50為7.95 mg/mL。從圖7C～圖7D可知，NFP-2對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除能力在設(shè)定濃度范圍內(nèi)無(wú)明顯的劑量依賴效應(yīng)。在質(zhì)量濃度20～120 μg/mL內(nèi)，NFP-2對(duì)DPPH自由基的清除能力較弱，始終維持在15%～17%；在質(zhì)量濃度0.5～20 μg/mL 內(nèi)，NFP-2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)，始終維持在60%左右。

圖7 青天葵多糖NFP-2抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of NFP-2

盡管多糖的自由基清除活性機(jī)制尚不完全明確，但相關(guān)研究表明，酸性多糖更易成為清除自由基的供氫劑，從而表現(xiàn)出更高的抗氧化活性[32]。由于NFP-2的糖醛酸含量較高，暴露的羧基參與了多糖與自由基的反應(yīng)，從而使NFP-2對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均達(dá)到50%以上。另外，在 5～20 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，NFP-2 的超氧陰離子自由基清除能力不存在濃度依賴性，表明NFP-2多糖的抗氧化活性并不是只受到單一因素影響，可能受到分子量、單糖組成、糖醛酸、取代基和鏈構(gòu)象等多種因素的影響。

3 結(jié)論

綜上所述，從青天葵藥材中分離純化得到一個(gè)分子量為1150 kDa的水溶性多糖組分NFP-2。NFP-2主要由半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸等單糖組成。結(jié)構(gòu)分析表明多糖的糖苷鍵為β-吡喃型，無(wú)三股螺旋結(jié)構(gòu)。抗氧化性評(píng)價(jià)表明NFP-2具有一定的自由基清除能力。這些結(jié)果將有助于青天葵多糖的進(jìn)一步研究。