超聲波輔助鱉甲脫鈣工藝優(yōu)化及其對膠原蛋白生化特征的影響

趙瓊瑜，胡 鑒，李彩燕，徐樹杰，宋 偉

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100）

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的一種重要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，具有保護(hù)機(jī)體和支撐器官的作用，廣泛存在于動物的骨骼、皮膚等組織中。膠原蛋白具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、微弱的抗原性、可吸收性和促進(jìn)細(xì)胞生長等特點(diǎn)，可作為功能物質(zhì)與營養(yǎng)成分廣泛應(yīng)用于功能性食品（如減少脂肪攝入、降血壓和美白抗衰等）與食品包裝（如腸衣、可食用膜和涂層等）中[1]。陸源性膠原蛋白因動物疾病及其價格過高、宗教信仰和一些人或者地區(qū)的風(fēng)俗習(xí)慣等原因，使得越來越多的人關(guān)注水產(chǎn)動物，水產(chǎn)動物源膠原蛋白被視為陸地動物源膠原蛋白的重要替代來源[2-3]。我國是水產(chǎn)大國，水產(chǎn)動物加工過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，其中包括骨頭、鱗片和皮等，這些副產(chǎn)物是膠原蛋白的重要來源[4-6]。然而，骨膠原蛋白與皮膠原蛋白具有明顯差異，骨骼中含有60%～70%左右的無機(jī)礦物質(zhì)，磷酸鈣和羥基磷灰石與膠原結(jié)合，形成堅(jiān)硬難溶的骨鹽沉積在膠原表面，因此骨源膠原蛋白提取前應(yīng)進(jìn)行脫鈣處理，脫鈣效果越好，越有利于獲得高提取率、高純度的骨膠原[7-9]。

骨源性材料的脫鈣方法主要采用酸法脫鈣、EDTA法脫鈣以及其他物理輔助脫鈣法（如微波輔助、電場輔助和超聲波輔助等）[9-10]。但是，酸法或EDTA法脫鈣時間較長，易造成原材料中膠原蛋白的流失，還會增加工業(yè)化生產(chǎn)成本[11]。超聲波輔助技術(shù)可通過空化效應(yīng)致使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的快速釋放、擴(kuò)散和溶解[12]。與傳統(tǒng)方法相比，超聲波輔助脫鈣技術(shù)具有耗時短、效率高、對有效成分結(jié)構(gòu)破壞小、處理溫度可控等特點(diǎn)，越來越受到廣泛關(guān)注[13]。近年來有學(xué)者采用超聲波輔助技術(shù)對骨源性材料進(jìn)行脫鈣處理，結(jié)果顯示超聲輔助脫鈣技術(shù)能縮短骨源性材料脫鈣的時間，進(jìn)而可減少膠原蛋白的溶出量，如李文鳳等[9]利用超聲波輔助脫除黃花魚魚鱗中的鈣，超聲處理65 min，脫鈣率高達(dá)99.18%，膠原蛋白損失率為4.08%；李明華等[14]輔以超聲波脫除龍蝦殼中的鈣，超聲處理90 min，脫鈣率高達(dá)93.85%；王梅英等[15]利用超聲波輔助鹽酸法脫除羅非魚魚鱗中的鈣，超聲處理56.82 min，脫鈣率達(dá)到92.43%。亦有學(xué)者研究了超聲處理對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明超聲處理對膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)沒有影響[12,16]。

中華鱉（Pelodiscus sinensis）是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)動物，因其肉鮮味美、營養(yǎng)豐富，屬于典型的低脂高蛋白食品[17]，此外，還含有多種礦物質(zhì)元素和不飽和脂肪酸，能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長和肝結(jié)締組織增生，提高血漿蛋白水平[17-18]。鱉甲為傳統(tǒng)常用中藥，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)鱉甲其對機(jī)體的抗氧化與增強(qiáng)免疫等具有良好的功效[19-20]，其來源于鱉科動物中華鱉的背甲，其含有豐富的膠原蛋白、鈣和磷等營養(yǎng)成分[21]。然而，鱉甲質(zhì)構(gòu)堅(jiān)硬，內(nèi)部的膠原蛋白由3條螺旋鏈纏繞而成，基質(zhì)附著羥基磷灰石，較難利用。本研究擬以中華鱉背甲為原料，鹽酸為脫鈣劑，結(jié)合超聲波輔助考察鹽酸濃度、溫度、時間、料液比、超聲工作時間和超聲功率等因素對鱉甲脫鈣效果的影響，并通過響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對鱉甲脫鈣工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，并對脫鈣處理后鱉甲膠原蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)特性解析，以期為鱉甲膠原蛋白的提取提供參考條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華鱉 購買于浙江省紹興市大畈水產(chǎn)專業(yè)合作社；碳酸鈣、鹽酸、濃硫酸、硫酸銅、硝酸、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、石油醚、檸檬酸、鈣紅指示劑、硫化鈉、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、對二甲氨基苯甲醛、氯胺T等 均為國產(chǎn)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 為超純水。

MA35型水分測定儀 賽多利斯公司；KD-310型全自動凱氏定氮儀 OPSIS公司；Soxtec Avanti 2050 脂肪分析儀 FOSS公司； BF51894JC-1型馬弗爐 Thermo Scientific Fisher公司；Spectrometer MPA型傅里葉紅外掃描儀 BRUKER OPTICS 公司；L8900型全自動氨基酸分析儀 HITACH公司；ME204型電子分析天平、S220-K型pH計(jì) 梅特勒公司；ALPHA 2-4 LD plus型冷凍干燥機(jī) Christ公司；Cary-100型紫外分光光度計(jì) 安捷倫公司；BPG-9140A型精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒公司；JY92-ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、Scientz-10大型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LYNX6000型落地大容量離心機(jī) Thermo Scientific Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中華鱉背甲基本成分分析 中華鱉宰殺后，迅速剝離其背甲，精細(xì)剔除肉后，用鍘刀將其鍘成塊，裝入樣品袋中，于-20 ℃冰箱中冷凍處理2 h，通過大型凍肉絞肉機(jī)粉碎，將粉碎后樣品置于大型冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，凍干樣品通過粉碎機(jī)短時粉碎并用16目篩子過篩，收集到樣品袋中密封，于4 ℃低溫環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

按照國標(biāo)的方法測定鱉甲基本成分。水分含量測定參考GB 5009.3-2016中105 ℃干燥恒重法（取冷凍干燥之前樣品）；粗蛋白含量測定參考GB 5009.5-2016自動凱氏定氮法；粗脂肪含量測定參考GB 5009.6-2016索氏抽提法；灰分含量測定參考GB 5009.4-2016中550 ℃馬弗爐干灰化法；總鈣含量的測定參考GB 5009.92-2016中EDTA 滴定法。

1.2.2 超聲輔助法中華鱉背甲脫鈣工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 精確稱取一定量的鱉甲粉樣品，將其置于玻璃套杯中，加入一定量的脫鈣劑，將超聲變幅桿插入溶液中，通過高低溫恒溫水浴循環(huán)槽精確控溫進(jìn)行超聲脫鈣處理。超聲脫鈣處理結(jié)束后，樣品溶液在10000 r/min下離心25 min，收集上清液，取上清液檢測其鈣含量和膠原蛋白含量。具體操作參考李文鳳[9]等和王梅英[15]等方法并略作修改。以鹽酸作為脫鈣劑，初設(shè)條件為：鹽酸濃度為0.6 mol/L、料液比1:35 g:mL、脫鈣溫度25 ℃、脫鈣時間60 min、超聲功率150 W、超聲間隙60 s/30 s（其中60 s為超聲工作時間，30 s為停歇時間）。在初設(shè)條件的基礎(chǔ)上探究鹽酸濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g:mL）、脫鈣溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）、脫鈣時間（30、45、60、75、90、105、120 min）、超聲間隙工作時間（10、20、30、40、50、60、70、80 s）、超聲功率（45、90、135、180、225 W）等因素對中華鱉背甲中鈣脫除效率的影響。鈣含量檢測采用EDTA絡(luò)合測定法[22]，膠原蛋白含量檢測采用羥脯氨酸測定法[23]。以脫鈣率和膠原蛋白遷出率為評價指標(biāo)，探究各因素對中華鱉背甲脫鈣和膠原蛋白遷出的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化脫鈣工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和顯著性差異分析從酸濃度、脫鈣溫度、脫鈣時間、料液比、超聲功率和超聲間隙工作時間等6個因素中篩選出影響脫鈣效果較顯著的5個因素（A-鹽酸濃度、B-溫度、C-料液比、D-時間、E-超聲功率）作為試驗(yàn)因子，采用 Design-Expert軟件設(shè)計(jì) Box-Behnken 試驗(yàn)條件，以脫鈣率和膠原蛋白遷出率為評價指標(biāo)，每組平行3次，取平均值，優(yōu)化鱉甲脫鈣工藝。因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)中試驗(yàn)因素水平代碼Table 1 Codes and levels of test factors in Box-Behnken design

1.2.3 鈣脫除率的測定 鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：參考侯風(fēng)萍等[22]方法，略作修改。分別精確吸取0、1、2、3、4、5 mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液加入到不同的100 mL三角燒瓶中，分別加入一定量的蒸餾水定容至10 mL，隨后用膠頭滴管滴加1滴硫化鈉溶液（10 g/L），加入0.10 mL檸檬酸鈉溶液（0.05 mol/L），然后加入氫氧化鉀（1.25 mol/L）調(diào)節(jié) pH 為 12～13 之間，后加 3～5滴鈣紅指示劑，立即用EDTA溶液滴定，直至瓶中溶液由紫紅色變成亮藍(lán)色為止，分別記錄所消耗的EDTA溶液的體積。以鈣離子濃度為縱坐標(biāo)，EDTA消耗體積為橫坐標(biāo)，繪制鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程如下：y=0.0447x-0.0038，R2=0.9963，其中 x 為鈣離子濃度（mg/mL），y 為 EDTA 消耗體積（mL）。

鈣脫除率的計(jì)算：分別精確吸取1.0 mL脫鈣溶液加入到100 mL三角燒瓶中，用EDTA絡(luò)合滴定法進(jìn)行鈣含量測定，平行滴定三組，記錄所消耗的EDTA溶液的體積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出溶液中鈣的含量。計(jì)算鱉甲中鈣的脫鈣率公式：

1.2.4 膠原蛋白遷出率的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：參考陸劍鋒等[23]的方法，并略作改動。精確吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（6.40 μg/mL）分別置于 10 mL 具塞比色管中，再分別依次加入蒸餾水 2.50、2.00、1.50、1.00、0.50、0.00 mL，然后再分別依次加入2 mL異丙醇，1 mL氯胺T氧化劑，搖勻，放置4 min。最后分別依次加入2 mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑（1 g/mL），加塞搖勻，于60 ℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫，于560 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為： y=0.1488x+0.0002，式中：x為羥脯氨酸濃度μg/mL；y為560 nm處的吸光值，變異系數(shù)R2= 0.9995。

膠原蛋白遷出率的計(jì)算：參考陸劍鋒等[23]的方法，并略作修改。精確吸取3 mL脫鈣液于10 mL安瓿瓶中，加入3 mL濃度為12 mol/L的鹽酸，氮吹后封口。在110 ℃烘箱中水解24 h，水解液冷卻后過濾，水解液用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4～6，用蒸餾水定容至25 mL。取上述溶液2.5 mL加入2 mL異丙醇和1 mL氯胺T氧化劑，搖勻，放置4 min，然后加入2 mL顯色劑，搖勻后60 ℃水浴20 min，冷卻后于560 nm處測吸光值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出羥脯氨酸濃度。計(jì)算脫鈣液中膠原蛋白的遷出率公式：

式中：11.1為膠原蛋白水解為羥脯氨酸的系數(shù)。

1.2.5 膠原蛋白的提取 超聲波輔助脫鈣處理后鱉甲膠原的提取：稱取一定量的鱉甲粉按照最優(yōu)超聲波輔助脫鈣工藝進(jìn)行脫鈣處理，用蒸餾水洗劑多次至pH為中性后，經(jīng)冷凍干燥后獲得脫鈣樣品。參考張強(qiáng)等[24]的方法，乙酸法提取鱉甲膠原蛋白。提取結(jié)束后，溶出液在 8000 r/min，4 ℃ 下離心 20 min，傾出上清液，將得到的上清液移入透析袋中，4 ℃環(huán)境下用蒸餾水透析3 d，每天更換透析水2～3次，透析后經(jīng)冷凍干燥。

1.2.6 鱉甲脫鈣處理后膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性分析SDS-PAGE分析：SDS-PAGE凝膠電泳參照張強(qiáng)等[24]方法進(jìn)行，稍作修改。分別精確稱取0.03 g經(jīng)脫鈣處理后制備獲得的鱉甲膠原蛋白和未脫鈣處理制備獲得的鱉甲膠原蛋白，分別溶于1 mL 0.05 mol/L乙酸溶液中，制成終濃度為30 mg/mL膠原蛋白溶解液。以體積比（1:4，V/V）與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，與蛋白Marker 一起上樣，在100 V的恒壓下進(jìn)行電泳，結(jié)束后膠在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1.5 h，隨后脫色過夜。最后脫色膠經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照和圖譜分析。

紫外全波長掃描（UV）分析：根據(jù)陸劍鋒等[23]方法，略作修改，取適量樣品溶解于0.05 mol/L乙酸溶液中制成15 mg/mL膠原溶液，以0.05 mol/L乙酸溶液作空白對照，樣品溶液在190～400 nm波長區(qū)間內(nèi)進(jìn)行掃描。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析：鱉甲膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜掃描參照Lebon等[25]方法進(jìn)行測定，取一定量的膠原蛋白凍干樣品（膠原蛋白如海綿狀），直接利用金剛石ATR探針在400～4000 cm-1區(qū)間內(nèi)對膠原樣品進(jìn)行吸收波譜掃描。

氨基酸組成分析：參考張強(qiáng)等[24]方法進(jìn)行，稍作修改。準(zhǔn)確稱取1 g樣品于25 mL具塞比色皿管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸、氮吹后封口，于烘箱中110 ℃消解24 h，過濾后用去離子水定容50 mL，取0.2 mL進(jìn)行氮吹直至吹干后，加入0.02 mol/L的鹽酸2 mL，用0.22 μm濾膜過濾于上樣瓶中，全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

圓二色性測定：參考張強(qiáng)等[24]方法進(jìn)行，稍作修改。取適量凍干后超聲輔助脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白質(zhì)溶解于0.05 mol/L乙酸溶液中，配制成10 mg/mL的膠原蛋白質(zhì)溶液，比色皿光徑為2 mm，分辨率1.0 nm，掃描速率100 nm/min，掃描3 次，測定190～250 nm 的圓二色光譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）；應(yīng)用Graphpad prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱉背甲基本成分分析

鱉背甲中測定的水分含量為34.98%±0.43%，干物質(zhì)含量為65.02%±1.06%。鱉背甲干物質(zhì)的營養(yǎng)成分如表2所示，粗蛋白的含量高達(dá)46.44%，脂肪比例為0.40%，灰分比例為48.53%（其中鈣含量為40.59%）?？梢婘M背甲中主要成分為蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，其含有的脂肪含量較低。因此要對鱉甲進(jìn)行有效的脫鈣。

表2 鱉甲干物質(zhì)基本成分± s，n=5）Table 2 Basic nutrients of dry matter of turtle carapace(± s, n=5)

表2 鱉甲干物質(zhì)基本成分± s，n=5）Table 2 Basic nutrients of dry matter of turtle carapace(± s, n=5)

成分 粗蛋白 粗脂肪 灰分含量（%） 46.44±0.86 0.40±0.06 48.53±0.08

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 鹽酸濃度對鱉甲脫鈣效果的影響 如圖1所示，鱉甲脫鈣率和膠原蛋白遷出率隨著鹽酸濃度的增大呈現(xiàn)上升的趨勢。鹽酸濃度在0.2～0.8 mol/L范圍內(nèi)，由于鹽酸濃度的增加，加快了鱉甲中鈣離子與鹽酸中氯離子的反應(yīng)[8]，可顯著增加鱉甲中可溶性鈣的脫除率（P＜0.05），鹽酸濃度為 0.8 mol/L 時，脫鈣率達(dá)到最大值，為60.81%。鹽酸濃度大于0.8 mol/L時，脫鈣率略微下降，但差異不顯著（P＞0.05），趨于平緩，可能是由于此時在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下，反應(yīng)已趨于平衡（飽和）狀態(tài)。這與劉閃等[26]、周如意等[27]和熊磊等[8]得到的數(shù)據(jù)趨勢是一致的，隨著鹽酸濃度增大，脫鈣率增大，后來增大速率減緩，趨于平衡。鱉甲、魚骨和魚鱗等骨源性材料中的鈣主要以羥基磷灰石的形式存在，羥基磷灰石的量是一定的，加入足夠多的鹽酸相互反應(yīng)，當(dāng)羥基磷灰石反應(yīng)基本完全，再增加鹽酸濃度也不能夠溶出更多的鈣[26]。鹽酸濃度為0.8 mol/L時，膠原蛋白遷出率為3.33%。此時，羥基磷灰石中大量鈣離子溶出，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松狀。在此之后，隨著鹽酸濃度的增加，鹽酸中氫離子和氯離子等介質(zhì)離子干擾其分子間的離子鍵，削弱疏水作用力和氫鍵力對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的緊合能力，使得肽鍵水解[28]，進(jìn)而促進(jìn)了膠原蛋白的溶出（P＜0.05）。因此選擇鹽酸濃度為0.8 mol/L較適。

圖1 鹽酸濃度對鱉甲脫鈣效果的影響Fig.1 Effects of hydrochloric acid concentration on decalcification of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.2.2 料液比對鱉甲脫鈣效果的影響 如圖2所示，隨著料液比的增大，鱉甲脫鈣率和膠原蛋白遷出率呈現(xiàn)遞增的趨勢。料液比為1:10～1:40（g:mL）時可顯著增加鱉甲中可溶性鈣的脫除率（P＜0.05），可能是溶液體積增大，使得鱉甲樣品更加分散，增大了鹽酸與羥基磷灰石的接觸表面積，從而促進(jìn)脫鈣[9]。當(dāng)料液比1:40（g:mL）時，鱉甲脫鈣率達(dá)最大值，為61.07%，此時膠原蛋白的遷出率為4.75%。繼續(xù)增加鹽酸用量，增大料液比，脫鈣率呈下降趨勢，差異不顯著（P＞0.05），說明固液接觸已經(jīng)非常充分，液料比再增加，除了浪費(fèi)試劑外，也不利于產(chǎn)物的后期回收。這與劉閃等[26]和周如意等[27]在研究白鰱魚骨和草魚鱗脫鈣時所得到的試驗(yàn)結(jié)果趨勢是一致的，也在試驗(yàn)中得到了類似結(jié)論。在料液比為1:40（g:mL）之后，隨著液料比的提高鱉甲膠原蛋白與脫鈣劑充分接觸，鹽酸通過破壞蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵[29]，膠原蛋白從原料鱉甲中釋放使得遷出率顯著升高（P＜0.05）。故選擇料液比為1:40進(jìn)行脫鈣。

圖2 料液比對鱉甲脫鈣效果的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on decalcification of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.2.3 脫鈣溫度對鱉甲脫鈣效果的影響 如圖3所示，隨著超聲溫度的升高，鱉甲中鈣離子的脫除率和膠原蛋白的遷出率逐漸增大。隨著溫度的升高，鈣離子的溶出速度變大，脫鈣率增大，脫鈣溫度為25 ℃時達(dá)到最大值，脫鈣率為62.88%，此時膠原蛋白遷出率為4.01%。溫度繼續(xù)升高，脫鈣率不再增加，趨于平緩（P＞0.05），膠原蛋白遷出率則大幅上升（P＜0.05）。鹽酸是一種可揮發(fā)性酸，隨著溫度升高，鹽酸揮發(fā)速度變快，使實(shí)際鹽酸濃度降低，但溫度升高又可促進(jìn)鈣離子的運(yùn)動速率。因此，脫鈣率趨于平緩可能是因?yàn)殁}離子溶出速度變大（使脫鈣率變大）與鹽酸實(shí)際濃度變小（使脫鈣率變?。﹥蓚€獨(dú)立因素交互作用[30]。這與劉閃等[26]和周如意等[27]研究脫鈣溫度對白鰱魚骨和草魚鱗脫鈣效果的影響時所得到的試驗(yàn)結(jié)果趨勢是一致的。而此時，樣品結(jié)構(gòu)疏松，膠原蛋白隨著溫度的升高，加速了其運(yùn)動速率，減弱疏水作用力和氫鍵力對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的束縛能力，進(jìn)而促進(jìn)了膠原蛋白的溶出（P＜0.05）。因此，超聲脫鈣溫度確定為25 ℃。

圖3 脫鈣溫度對鱉甲脫鈣效果的影響Fig.3 Effects of decalcified temperature on decalcification of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.2.4 脫鈣時間對鱉甲脫鈣效果的影響 如圖4所示，隨著超聲時間的延長，鱉甲中鈣離子的脫除率和膠原蛋白遷出率呈現(xiàn)上升趨勢。超聲時間小于60 min時，脫鈣率隨著時間的變化明顯升高，說明鱉甲中的鈣溶出到與鹽酸反應(yīng)需要一定時間[26,30]。當(dāng)超聲時間為60 min時，脫鈣率達(dá)最高值，為62.85%，此時膠原蛋白的遷出率為3.83%。隨著浸泡時間的繼續(xù)增加（75～120 min），脫鈣率變化不顯著（P＞0.05），這可能是在進(jìn)行反應(yīng)的同時，鹽酸不斷的揮發(fā)出，導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)中鹽酸的實(shí)際濃度下降，不利于可溶性鈣的溶出[9]。而脫鈣時間的增長，促進(jìn)了脫鈣劑與樣品中膠原蛋白充分接觸，造成鹽鍵和席夫（Schiff）鍵的斷裂，從而引起含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原纖維和沒有交聯(lián)的膠原分子水解[31]，進(jìn)而導(dǎo)致膠原蛋白的溶出量顯著大幅增加（P＜0.05）。因此，超聲脫鈣時間確定為60 min。

圖4 脫鈣時間對鱉甲脫鈣效果的影響Fig.4 Effects of decalcified time on decalcification of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.2.5 超聲間隙工作時間對鱉甲脫鈣效果的影響如圖5所示，鱉甲中鈣離子的脫除率和膠原蛋白遷出率隨著超聲間隙中超聲工作時間的增加而增大。其中超聲工作時間在10～30 s范圍內(nèi)，脫除率隨著超聲工作時間的延長而顯著增大（P＜0.05），超聲工作時間為30 s時，為61.88%，此時膠原蛋白遷出率為3.14%。而工作時間超過30 s后，脫鈣率變化不顯著（P＞0.05），這可能是因?yàn)槌暪ぷ鲿r間加長增強(qiáng)了超聲波的空化作用，會使得溫度有一定的升高，鹽酸不斷的揮發(fā)出，導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)中鹽酸的實(shí)際濃度下降，不利于可溶性鈣的溶出[32]；而隨著超聲工作時間的延長，增大了空化作用在爆破時產(chǎn)生的能量[33]，促進(jìn)了膠原蛋白的遷出。因此，超聲間隙工作時間確定為30 s。

圖5 超聲間隙工作時間對鱉甲脫鈣效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic gap working time on decalcification of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.2.6 超聲功率對鱉甲脫鈣效果的影響 如圖6所示，鱉甲中鈣離子的脫除率和膠原蛋白遷出率隨著超聲功率的增加而增大。超聲功率在45～135 W的范圍內(nèi)，脫除率隨著功率的增加而增大（P＜0.05），在135 W處達(dá)到最大，為63.01%，此時膠原蛋白遷出率為4.12%。表明超聲的空化效應(yīng)使得鱉甲中鈣離子更好的溶解于溶劑中。而超過135 W后，脫鈣率變化不顯著（P＞0.05），可能因?yàn)殁}離子在固液之間基本達(dá)到了平衡；而膠原蛋白的溶出量顯著（P＜0.05）增加后緩慢下降，這可能是因?yàn)槌暪β试龃髸沟脺囟扔幸欢ǖ纳?，加快了膠原蛋白的提取，而且超聲功率過大會破壞膠原蛋白分子的結(jié)構(gòu)，造成膠原蛋白分子的降解[17]。因此，超聲功率確定為135 W。

圖6 超聲功率對鱉甲脫鈣效果的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on decalcification of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)5因素3水平進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測定46組實(shí)驗(yàn)的脫鈣率和膠原蛋白遷出率，結(jié)果如表3所示

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken design matrix with experimental results

2.3.2 模型建立與顯著性分析 根據(jù)Design-expert 8.0.6軟件分析獲得相應(yīng)的二次響應(yīng)面回歸方程，脫鈣率（Y1）和膠原蛋白遷出率（Y2）的方程分別為：Y1=66.81+0.33A+0.48B+1.38C+0.42D+2.10E-0.76AB+0.52AC-0.32AD+0.69BC+0.51BD+0.61CD+0.98CE+0.75DE-2.19A2-2.42B2-2.73C2-1.71D2-2.50E2；Y2=2.90-0.30A-0.025B-0.24C-0.16D-0.83E+0.074AB+0.18AC-1.519E-003AD-0.13AE-0.080BC+0.24BD-0.087BE+0.13CD-0.072CE-0.28DE+1.15A2+0.89B2+0.96C2+0.76D2+0.69E2。

為檢驗(yàn)回歸方程有效性并確定各因素對脫鈣率和膠原蛋白遷出率的影響程度，對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4、表5。所建立的方程模型相關(guān)性均極顯著 （P脫鈣率＜0.0001，P膠原蛋白遷出率＜0.0001），失擬項(xiàng)均不顯著（P脫鈣率=0.7297＞0.05，P膠原蛋白遷出率=0.1350＞0.05），表明該模型方程與實(shí)際擬合度較好。脫鈣率和膠原蛋白遷出率決定系數(shù)R2分別為0.9903和0.9988，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj分別為0.9838和0.9978，R2與R2adj非常接近，表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值吻合較好；此外，異系數(shù)CV值分別為0.47%和0.91%，數(shù)值很小，表明脫鈣率和膠原蛋白遷出率模型離散程度小。從各因素的P值可知，一次項(xiàng)中A、B、C、D、E等5個因素對脫鈣率和膠原蛋白遷出率均存在顯著性影響（P＜0.05），而其中5個因素對脫鈣率均存在極顯著影響（P＜0.01），除B外的其他4個因素對膠原蛋白遷出率均存在極顯著影響（P＜0.01）；二次項(xiàng)中 A2、B2、C2、D2、E2等 5 個因素均對脫鈣率和膠原蛋白遷出率曲面效應(yīng)影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)中，BC、BD、CD、CE、DE等組合因素對脫鈣率具有極顯著影響（P＜0.01），AD對脫鈣率存在顯著影響（P＜0.05），AE、BE 對脫鈣率影響均不顯著（P＞0.05），表明各因素對鱉甲脫鈣的影響不同，調(diào)整不同因素將達(dá)到不同脫鈣效果；AB、AC、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE等組合因素對膠原蛋白遷出率具有極顯著影響（P＜0.01），AD對膠原蛋白遷出率影響均不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可得，影響脫鈣率因素的主次順序?yàn)椋撼暪β剩‥）＞料液比（C）＞溫度（B）＞時間（D）＞鹽酸濃度（A）；影響鱉甲膠原蛋白遷出率的主次順序?yàn)椋撼暪β剩‥）＞鹽酸濃度（A）＞料液比（C）＞時間（D）＞溫度（B）。

表4 脫鈣率回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and significance test of regression model of decalcification rate

表5 膠原蛋白遷出率回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 5 Analysis of variance and significance test of regression model of collagen emigration rate

2.3.3 各因素間相互作用響應(yīng)面分析 二次回歸模型擬合的各因素之間交互作用對鱉甲脫鈣率影響的響應(yīng)曲面分析如圖7所示，各圖均開口向下，凸形曲面，三維曲面較陡，響應(yīng)值波動較大，表明AD、BC、BD、CD、CE、DE等組合因素之間的交互作用對鱉甲脫鈣的影響較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析一致。對鱉甲脫鈣過程中膠原蛋白遷出影響的響應(yīng)曲面分析如圖8所示，各圖均開口向上，凹形曲面，曲面越峭，都存在極值，表明 AB、AC、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE等組合因素之間的交互作用對鱉甲脫鈣的影響較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析一致。

圖7 各因素間交互作用對鱉甲脫鈣率的影響Fig.7 Interaction of various factors on the decalcification rate of ultrasound-assisted decalcification

2.3.4 最優(yōu)工藝條件確定與驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 通過Design-

Expert.8.06軟件對回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到最佳鱉甲脫鈣工藝條件為：鹽酸濃度0.811 mol/L、溫度25.254 ℃、料液比1:42.268（g:mL）、時間63.526 min、超聲功率143.668 W、脫鈣率為64.70%，膠原損失率為3.48%。結(jié)合實(shí)際操作，將條件調(diào)整為：鹽酸濃度 0.8 mol/L、溫度 25 ℃、料液比 1:40（g:mL）、時間60 min、超聲功率145 W、超聲間隙30 s/30 s，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，鱉甲脫鈣率為64.97%±1.03%，膠原蛋白遷出率為3.22%±0.84%，與預(yù)測值接近，說明該工藝準(zhǔn)確可行。

2.4 鱉甲膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性分析

2.4.1 紫外全波長掃描分析 膠原蛋白含有-CONH2、-COOH和-C=O等生色基團(tuán)，分子中的價電子吸收能量發(fā)生躍遷，可在220 nm 附近產(chǎn)生較強(qiáng)的紫外吸收[34]。圖9中超聲波輔助脫鈣處理與未脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白分別在212和211 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，峰形較為一致，主要是由肽鍵-C=O 的n→π*躍遷所貢獻(xiàn)，這是膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，說明超聲波處理后的膠原蛋白較好地保持了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。此外，膠原蛋白與大多數(shù)蛋白質(zhì)的區(qū)別在于幾乎不含色氨酸，因此，在280 nm處不會有紫外吸收峰的出現(xiàn)，可作為一種鑒定膠原蛋白純度的方法。圖中在275 nm處有微弱吸收峰，這可能與膠原蛋白中酪氨酸和苯丙氨酸的存在相關(guān)[29]。

2.4.2 SDS-PAGE 凝膠電泳分析 如圖10所示，超聲波輔助脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白與未脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白均含有3條明顯的肽鏈，即α1、α2、和β鏈，表明提取的膠原蛋白質(zhì)屬于典型的Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)。α1和α2鏈的相對分子質(zhì)量在100～135 kDa，二聚體β-鏈相對分子量在200 kDa左右，符合大多數(shù)水生膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征[23-24]。超聲波輔助脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白條帶比未脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白條帶更粗，存在部分彌散，推測可能是由于超聲輔助處理改變了膠原蛋白的部分分子結(jié)構(gòu)所致。所以超聲波輔助處理不影響膠原亞基的組成，可能對膠原的分子結(jié)構(gòu)有一定影響[13]。

2.4.3 傅里葉變換紅外光譜分析 如圖11所示，超聲波輔助脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白與未脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白均在酰胺I（特征吸收范圍為1600～1700 cm-1）、II（特征吸收范圍為 1500～1600 cm-1）、III（特征吸收范圍為 1200～1360 cm-1）以及 A（特征吸收范圍為3200～3400 cm-1）、B帶（特征吸收峰位于2920 cm-1附近）均可觀察到明顯的特征峰，均符合膠原蛋白質(zhì)的特征吸收峰，同時也說明所提膠原蛋白具有較完整的三螺旋結(jié)構(gòu)[34]。由于待測樣品為不經(jīng)過處理的凍干的膠原蛋白，而凍干樣品因膠原蛋白溶液濃度不一樣導(dǎo)致其單位體積致密度不一樣，因此，特征峰強(qiáng)度上存在差異。

圖11 鱉甲膠原蛋白傅里葉紅外掃描光譜Fig.11 Fourier transform infrared spectrum of collagen of carapace in Chinese soft-shelled turtle

2.4.4 氨基酸分析 超聲波輔助脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白與未脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白的氨基酸組成如表6所示，甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，約占28.0%；其次是亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸），約占21.0%；谷氨酸和丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高，分別約占9.0%和8.0%；幾乎不含或僅含少量的苯丙氨酸和半胱氨酸。符合膠原蛋白氨基酸組成的顯著特征，即含有大量的甘氨酸以及豐富的亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）等[17,24]。兩種膠原蛋白的氨基酸含量有一定差異，但差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，超聲輔助脫鈣處理對膠原蛋白的氨基酸組成無明顯影響[13]。

2.4.5 圓二色光譜分析 由圖12可以看出，超聲輔助脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白與未脫鈣處理的鱉甲膠原蛋白的特征圓二色光譜分別在222和221 nm 處出現(xiàn)正峰，分別在199和198 nm 處出現(xiàn)負(fù)峰。這些光譜數(shù)據(jù)表明膠原存在三重螺旋結(jié)構(gòu)，無α螺旋雙負(fù)峰吸收，主要表現(xiàn)為β折疊及無規(guī)卷曲的疊加吸收；正吸收峰與負(fù)吸收峰的比值（Rpn）分別為50.34和49.89，說明膠原蛋白的三重螺旋結(jié)構(gòu)完整[24,35]。

圖12 鱉甲酸溶性膠原蛋白圓二色光譜圖Fig.12 CD spectra of collagen of carapace in Chinese softshelled turtle

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以中華鱉背甲為原料，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助酸法脫除鱉甲中鈣的工藝，得最佳工藝為：鹽酸濃度0.8 mol/L、溫度25 ℃、料液比1:40（g:mL）、時間60 min、超聲功率145 W、超聲間隙30 s/30 s。在此條件下，脫鈣率和膠原蛋白回收率分別64.97%±1.03%和3.22%±0.84%。通過SDS-PAGE（亞基結(jié)構(gòu)為 [a1（I）]3）、紫外全波長掃描（210～215 nm處有特征吸收峰）和氨基酸分析（甘氨酸含量約28%，亞氨基酸含量約21%，半胱氨酸和色氨基酸極少量檢測到或未檢測到）表明，所提取的鱉甲膠原蛋白純度較高，符合I型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征；傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和圓二色光譜（CD）分析說明鱉甲膠原蛋白具有較為完成的三螺旋結(jié)構(gòu)。因此，超聲輔助酸法脫鈣處理對鱉甲膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性無明顯影響，而且對鱉甲膠原蛋白的損失極小，這為后續(xù)提取背甲膠原蛋白奠定了好的基礎(chǔ)。