喹啉銅在柑橘中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、消解動(dòng)態(tài)及膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

陳顯柳，王素茹，陳博鈺，謝德芳

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571101）

喹啉銅是一種廣譜、高效、低殘留的喹啉類(lèi)保護(hù)性低毒殺菌劑，屬有機(jī)銅鰲合物。喹啉銅噴施后可在植物表面形成一層嚴(yán)密的保護(hù)藥膜，藥膜緩慢釋放銅離子，銅離子被病菌萌發(fā)的孢子吸收，達(dá)到一定濃度時(shí)，可殺死孢子細(xì)胞，起到殺菌作用，從而有效抑制病菌的萌發(fā)和侵入[1-2]。喹啉銅廣譜高效，同時(shí)具有喹啉和銅鹽的作用，因而在我國(guó)柑橘種植過(guò)程得到廣泛的應(yīng)用[3]。但是如果過(guò)量使用喹啉銅，不僅會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)導(dǎo)致銅離子在生物體內(nèi)富集，進(jìn)而對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅[4]。Wang等[5]研究表明當(dāng)喹啉銅超過(guò)一定劑量濃度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育缺陷的概率增加和行為發(fā)生改變。我國(guó)已經(jīng)制定了蘋(píng)果、葡萄、楊梅、荔枝中喹啉銅的最大殘留限量，但尚未制定柑橘中喹啉銅的最大殘留限量[6]。

目前檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中喹啉銅殘留量的方法主要有液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-11]和液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法[12]。徐小軍等[7]采用高效液相色譜法研究了喹啉銅在枇杷中的消解動(dòng)態(tài)，其半衰期為3.4～4.6 d。Li等[1]采用高效液相色譜法研究了喹啉銅在梨中的殘留及消解動(dòng)態(tài)，其半衰期為6.8～9.7 d。鄭振山等[12]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究了喹啉銅在馬鈴薯中的殘留及消解動(dòng)態(tài)，其半衰期為8.89～11.1 d，最終殘留量均小于0.10 mg/kg。常培培等[8]使用超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器研究了喹啉銅在西瓜和土壤中殘留及消解動(dòng)態(tài)，其半衰期為1.1～2.3 d。柑橘是世界第一大類(lèi)水果，柑橘皮經(jīng)過(guò)干燥處理后可制成陳皮作為中藥使用，是老百姓餐桌上常見(jiàn)的水果，其食用的安全性備受關(guān)注[13-14]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于喹啉銅在柑橘中的殘留及消解動(dòng)態(tài)研究較少[15]，未見(jiàn)33.5%喹啉銅懸浮劑在柑橘中殘留、消解動(dòng)態(tài)及膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)的研究報(bào)道。同時(shí)柑橘樣品基質(zhì)復(fù)雜，儲(chǔ)藏過(guò)程中可能影響到喹啉銅的降解[16]。因此研究喹啉銅在柑橘中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、消解動(dòng)態(tài)及膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

本研究通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定柑橘中喹啉銅的殘留量，通過(guò)對(duì)海南、江西兩地田間試驗(yàn)樣品的檢測(cè)分析，評(píng)估了柑橘中喹啉銅的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、消解動(dòng)態(tài)及膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)，為規(guī)范33.5%喹啉銅懸浮劑在柑橘生產(chǎn)中的安全使用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品 質(zhì)量100 mg，純度99.8%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；33.5%喹啉銅懸浮劑 質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.5%，浙江天豐生物科學(xué)有限公司；乙腈 色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；三氟乙酸色譜純，阿拉丁試劑上海有限公司；石墨化炭黑填料（GCB） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氯化鈉分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

Waters e2695高效液相色譜儀（配有2489紫外檢測(cè)器） 美國(guó)沃特世公司；CR22N高速離心機(jī) 日本HITACHI公司；Milli-Q超純水器 德國(guó)Millipore公司；HT-200高速振蕩儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TTL-DCII氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海馳唐電子有限公司；L204電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱(chēng)取5.00 g柑橘全果或果肉樣品于50 mL離心管中，加入3 g氯化鈉，10 mL 0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液（v:v=1:9），渦旋5 min，150 W 超聲20 min，3800 r/min 離心5 min，重復(fù)提取步驟，合并上清液[9]。取5 mL上清液于10 mL離心管中，加入5 mg GCB填料凈化，渦旋2 min，3800 r/min離心5 min，取4 mL上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液（v:v=1:9）定容至1 mL。經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜法測(cè)定樣品中喹啉銅的質(zhì)量濃度，由外標(biāo)法進(jìn)行定性定量。

1.2.2 儀器條件 色譜柱：SunFire?C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.1% 三氟乙酸水溶液和乙腈，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，流速 1.0 mL/min，等梯度洗脫 v（0.1% 三氟乙酸水）:v（乙腈）=9:1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.2.3 添加回收試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在柑橘全果和果肉的空白樣品中設(shè)立喹啉銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2、2、5 mg/kg的添加水平，每個(gè)添加水平設(shè)5個(gè)平行，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，按照1.2.1方法進(jìn)行樣品前處理，在以上儀器條件下，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定質(zhì)量濃度，并計(jì)算回收率。

1.2.4 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)則[17]，進(jìn)行喹啉銅在柑橘中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)，取樣分析時(shí)間為0、30、60、90、180 d。稱(chēng)取5.00 g柑橘全果空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，往樣品中添加喹啉銅，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為2 mg/kg，共10個(gè)試驗(yàn)樣品，于2 h內(nèi)儲(chǔ)藏于-20 ℃冰柜內(nèi)。每次取樣測(cè)定儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品2個(gè)、柑橘全果空白對(duì)照樣品1個(gè)、添加水平為5 mg/kg的柑橘全果質(zhì)控樣品2個(gè)，通過(guò)1.2.1的分析方法測(cè)定試驗(yàn)樣品中的喹啉銅質(zhì)量濃度。根據(jù)式（1）計(jì)算柑橘全果樣品儲(chǔ)藏過(guò)程中喹啉銅殘留的降解率[17]。

式中：C為1.2.3中試驗(yàn)樣品喹啉銅的初始?xì)埩袅浚╩g/kg）；Ci為樣品保存i天后，樣品中喹啉銅的殘留量（mg/kg）；Di為樣品保存i天后，樣品中喹啉銅降解率（%）。當(dāng)Di＜30%，表明農(nóng)藥在樣品中儲(chǔ)藏i天穩(wěn)定，反之，則不穩(wěn)定。

1.2.5 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則[18]及田間試驗(yàn)[19]要求，于2019年在海南省和江西省進(jìn)行了喹啉銅在柑橘中的規(guī)范殘留試驗(yàn)。每個(gè)地區(qū)的試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)試驗(yàn)小區(qū)和對(duì)照小區(qū)各1個(gè)，試驗(yàn)小區(qū)前后未施用過(guò)相同的農(nóng)藥，每個(gè)小區(qū)有4株柑橘樹(shù)，小區(qū)之間設(shè)有隔離區(qū)，周邊設(shè)有保護(hù)行。試驗(yàn)小區(qū)柑橘樹(shù)全株噴霧施藥33.5%喹啉銅懸浮劑3次，施藥劑量為 333.3 mg a.i./kg（1000 倍液），施藥間隔7 d。對(duì)照小區(qū)噴施清水。最終殘留試驗(yàn)樣品于最后一次施藥后20、30 d采集，殘留消解試驗(yàn)樣品于最后一次施藥后 2 h（0 d）、3、7、14、20、30 d 采集，空白小區(qū)樣品于0、30 d采集。每次采集獨(dú)立樣品2份，每份樣品隨機(jī)至少采集2 kg生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的柑橘果實(shí)，采集部位遍及樹(shù)體上中下部。樣品采收后沿縱向均勻地切成4瓣，分取不相鄰的2瓣，直接進(jìn)行勻漿，制備成柑橘全果樣品；或者去除橘皮后進(jìn)行勻漿，制備成柑橘果肉樣品。

1.2.6 半衰期 采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程模型對(duì)殘留消解試驗(yàn)中獲得的柑橘中喹啉銅殘留量進(jìn)行分析擬合。喹啉銅在柑橘中的降解方程和半衰期[20-21]按照式（2）、式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：Ct為時(shí)間t時(shí)的喹啉銅殘留量（mg/kg）；C0為殘留消解試驗(yàn)0 d樣品中喹啉銅的初始?xì)埩袅浚╩g/kg）；k 為降解速率常數(shù)；T1/2為半衰期（D）。

1.2.7 慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 根據(jù)規(guī)范殘留試驗(yàn)中值和我國(guó)人群每人每天的柑橘消費(fèi)量計(jì)算喹啉銅的估算每日攝入量（estimated daily intake，EDI）（μg/kg·bw）。根據(jù)EDI與喹啉銅的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）的百分比得到喹啉銅的慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)概率（risk quotiety，RQ）（%）。計(jì)算公式如下[22-23]：

式中：STMR為喹啉銅在柑橘中的規(guī)范農(nóng)作物殘留試驗(yàn)中值（supervised trials median residue，STMR）（mg/kg）；FI為我國(guó)不同人群每人每天的柑橘消費(fèi)量（food intake，F(xiàn)I）（g/d），數(shù)據(jù)來(lái)源于《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報(bào)告》[24]；bw為我國(guó)普通人群的平均體重（body weight，bw）（kg）；ADI為喹啉銅每日允許攝入量（mg/kg·bw），我國(guó)規(guī)定喹啉銅的ADI為0.02 mg/kg bw[6]。當(dāng)RQ的值≤100%時(shí)，表示對(duì)普通人群健康產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)在可接受范圍之內(nèi)，數(shù)值越小，風(fēng)險(xiǎn)越低；當(dāng)RQ的值＞100%時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)在不可接受范圍，數(shù)值越大，風(fēng)險(xiǎn)越大。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行處理3次，采用Waters公司的液相色譜分析工作站Empower 3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)Excel 2016進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，通過(guò)Origin 2018進(jìn)行一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相稀釋并配制成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在以上的儀器條件下，通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。以喹啉銅質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明：在0.1～5.0 μg/mL的范圍內(nèi)，其線性方程為 y=125038x+1513，決定系數(shù)R2為0.9999，線性關(guān)系良好。在1.2.1的前處理及儀器條件下，以檢測(cè)器上的3倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定喹啉銅的檢出限（limit of detection，LOD）為 1 ng；喹啉銅在柑橘全果和果肉中的最低檢測(cè)濃度均為0.2 mg/kg，因此方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.2 mg/kg。添加回收試驗(yàn)結(jié)果如表1所示：在柑橘全果中，喹啉銅的平均回收率為89.3%～98.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.9%～3.7%；在柑橘果肉中，喹啉銅的平均回收率為92.6%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%～5.5%。方法的準(zhǔn)確度和精密度符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[18]規(guī)定的殘留分析方法要求。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白樣品及添加樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of oxine-copper standard solution, blank citrus samples and spiked Citrus samples

表1 喹啉銅在柑橘全果、果肉中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 1 Recoveries and relative standard deviations of oxine-copper in Citrus whole fruit and pulp (n=5)

2.2 喹啉銅在柑橘中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

由表2可以看出，喹啉銅添加水平為2 mg/kg的柑橘全果樣品隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，殘留量變化不大，降解速度緩慢。質(zhì)控樣品的回收率為97.4%～103.9%，整個(gè)儲(chǔ)藏試驗(yàn)期間喹啉銅的降解率為0～8.0%，未超過(guò)植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)則[17]規(guī)定的30%，因此喹啉銅在上述條件下，可以在柑橘中穩(wěn)定存在180 d以上。

表2 喹啉銅在柑橘全果樣品中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性（添加水平2 mg/kg）Table 2 Storage stability of oxine-copper in Citrus whole fruit(spiked level 2 mg/kg)

2.3 消解動(dòng)態(tài)

由圖2可知，在江西和海南試驗(yàn)地的柑橘全果樣品中，當(dāng)天施藥后2 h，喹啉銅的原始沉積量分別為1.40和1.32 mg/kg。江西地樣品的初始沉積量高于海南地樣品，可能與施藥時(shí)風(fēng)速、器械和施藥操作的差異有關(guān)，同時(shí)不同地點(diǎn)作物的生長(zhǎng)狀況也會(huì)影響喹啉銅在柑橘上的附著量[25]。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的喹啉銅殘留量逐漸降低，施藥30 d后，江西地樣品中喹啉銅殘留量為0.32 mg/kg，降解率為77%，海南地樣品中喹啉銅殘留量低于LOQ，降解率超過(guò)85%。兩地柑橘全果樣品中喹啉銅的消解動(dòng)態(tài)均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：江西為Ct=1.33805e-0.046t，海南為 Ct=1.04925e-0.068t；決定系數(shù)（R2）分別為 0.9746和0.8694；半衰期分別為15.1 d和10.2 d，屬于易降解農(nóng)藥（T1/2＜30 d）。海南試驗(yàn)地柑橘中喹啉銅的降解速率更快，半衰期更短，這可能主要與試驗(yàn)期間海南試驗(yàn)地相比江西試驗(yàn)地的光照更強(qiáng)時(shí)間更長(zhǎng)，溫度更高，降雨更頻繁有關(guān)。柑橘中喹啉銅的殘留消解趨勢(shì)殘留見(jiàn)圖2。消解試驗(yàn)中柑橘果肉樣品中喹啉銅殘留量均低于定量限。

圖2 喹啉銅在柑橘全果樣品中的殘留消解趨勢(shì)Fig.2 Digestion curves of oxine-copper in whole fruit of Citrus samples

2.4 慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)最終殘留試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)柑橘?lài)娛┼~3次，末次施藥后20、30 d采集樣品進(jìn)行測(cè)定柑橘全果、果肉中喹啉銅殘留量，見(jiàn)表3。結(jié)果表明柑橘全果樣品藥后20和30 d的殘留試驗(yàn)中值（STMR）分別為0.42和0.25 mg/kg；柑橘果肉樣品中均未檢出喹啉銅殘留，其殘留試驗(yàn)中值（STMR）按照LOQ（0.2 mg/kg）計(jì)算。不同年齡段人群的平均體重和水果消費(fèi)量來(lái)自《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)和健康狀況調(diào)查報(bào)告》[24]。慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，藥后20和30 d柑橘全果樣品中喹啉銅的估算每日攝入量分別為 0.1872～1.4584 μg/kg·bw 和 0.1114～0.8681 μg/kg·bw，慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)概率分別為0.94%～7.29%和0.56%～4.34%；柑橘果肉中喹啉銅的估算每日攝入量為 0.0891～0.6945 μg/kg·bw，慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)概率為0.45%～3.47%。在柑橘上規(guī)范使用33.5%喹啉銅懸浮劑，對(duì)一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。雖然柑橘全果和果肉中的喹啉銅在不同人群中的慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)總體水平較低，但是由于體重較輕的緣故，兒童的風(fēng)險(xiǎn)水平要高于其他人群。

表3 喹啉銅在柑橘中的最終殘留Table 3 Final residue levels of oxine-copper in Citrus

表4 不同人群中喹啉銅的慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Table 4 Dietary exposure risk assessment of oxine-copper in different populations

3 結(jié)論

在-20 ℃的條件下儲(chǔ)藏180 d，柑橘全果樣品中喹啉銅的降解率低于10%，因此喹啉銅可以穩(wěn)定存在柑橘果實(shí)中。同時(shí)在海南和江西兩地進(jìn)行規(guī)范殘留試驗(yàn)，柑橘樹(shù)全株噴霧施藥33.5%喹啉銅懸浮劑3次，施藥劑量為 333.3 mg a.i./kg（1000 倍液），施藥間隔7 d，柑橘中喹啉銅的殘留量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，其消解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，半衰期為10.2～15.1 d。根據(jù)規(guī)范殘留試驗(yàn)中值與膳食攝入量進(jìn)行慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果表明，在柑橘上規(guī)范使用33.5%喹啉銅懸浮劑，我國(guó)不同人群柑橘中喹啉銅估算每日攝入量為 0.0891～1.4584 μg/kg·bw，其慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)小于10%，在可接受范圍內(nèi)，處于安全水平。