血管性認(rèn)知障礙的關(guān)鍵蛋白研究進(jìn)展

譚曉云，陳真

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是繼阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)后致老年認(rèn)知障礙的第二大常見病因。根據(jù)VCI的臨床特點(diǎn)，可將其分為卒中后癡呆、皮質(zhì)下缺血性血管性癡呆、多發(fā)梗死性癡呆和混合型癡呆，其危險(xiǎn)因素包括年齡、高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、糖尿病、心臟病、腦卒中、頸動(dòng)脈斑塊、吸煙[1]等。VCI患者腦內(nèi)發(fā)生的腦血管病變類型、程度和位置的不同，通常會(huì)使其出現(xiàn)不同程度的記憶、執(zhí)行功能缺陷和精神遲緩以及焦慮、抑郁等行為問題。

目前VCI的病理生理和發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明，VCI可能由多種機(jī)制和代謝途徑引起，其病理機(jī)制可能包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、毒性廢物的血管堆積、神經(jīng)血管解偶聯(lián)以及小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能受損等。對(duì)VCI中關(guān)鍵蛋白的尋找和研究，能夠?yàn)榕R床治療和藥物研發(fā)提供新思路和新靶點(diǎn)。本文就近期與VCI相關(guān)的關(guān)鍵蛋白研究狀況進(jìn)行綜述。

1 HMGB1

高遷移率族蛋白Box-1(HMGB1)是一種25 kDa的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，由215個(gè)氨基酸組成[2]。體細(xì)胞和免疫細(xì)胞均能夠向細(xì)胞外分泌HMGB1，在到達(dá)細(xì)胞外環(huán)境后，HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式(DAMP)蛋白，會(huì)與其受體Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，激活下游炎癥相關(guān)通路，表達(dá)包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥標(biāo)記物[3]，激活炎癥反應(yīng)。這些HMGB1相關(guān)通路在腦低灌注急性期的海馬中激活，同時(shí)可以觀察到海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中HMGB1釋放的顯著增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4-5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞模型中，黃芩苷(BAI)能夠通過介導(dǎo)上游信號(hào)SIRT1的激活，抑制HMGB1的釋放，同時(shí)通過減少HMGB1的核轉(zhuǎn)位，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)炎癥[6]。在建立永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻塞(BCCAO)模型3個(gè)月后的C57BL/6小鼠中，血清HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高，腦血流量降低，并伴有神經(jīng)元丟失和海馬萎縮的發(fā)生；且這種現(xiàn)象在雙側(cè)海馬內(nèi)注射HMGB1 CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒后，可以被逆轉(zhuǎn)，并恢復(fù)認(rèn)知功能[7]。因此，HMGB1可能在VCI的病理生理過程中起關(guān)鍵的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有神經(jīng)保護(hù)作用。抑制HMGB1信號(hào)能夠通過上調(diào)髓鞘堿性蛋白，促進(jìn)膽堿能傳遞，從而下調(diào)炎癥反應(yīng)[8]?？笻MGB1抗體(Ab)能夠抑制海馬區(qū)HMGB1的動(dòng)態(tài)變化，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活、促炎因子的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激，保持BBCAO模型大鼠血腦屏障的完整性[9]，對(duì)海馬神經(jīng)元的存活和認(rèn)知功能恢復(fù)產(chǎn)生長期的有利影響。

2 APOE

載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)是一種小分子分泌型糖蛋白，人類的APOE主要在肝臟和腦組織中合成，主要存在于血漿和各組織的乳糜微粒(CM)、低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)中，具有轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。APOE基因在普通人群中具有多態(tài)性，位于19號(hào)染色體，有3個(gè)等位基因分別為：APOE ε3(野生型)、APOE ε2、(變異型)和APOE ε4(變異型)，能夠組成6種表型。APOE ε2等位基因能夠降低膽固醇含量，減少β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集，減緩皮質(zhì)變薄，對(duì)認(rèn)知能力下降具有一定的保護(hù)作用[10]。APOE ε3等位基因是最常見的等位基因，基因頻率為79%。與APOE ε2相反，APOE ε4的一般作用是顯著升高體內(nèi)的總膽固醇濃度。APOE ε4與早期記憶能力下降、邊緣功能障礙、腦血流量減少、血腦屏障滲漏增加、脂質(zhì)代謝異常和神經(jīng)炎癥[11]等有關(guān)。APOE ε4能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)失調(diào)，導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展；還能夠擾亂巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，從而加劇全身炎癥[12]。因此，APOE ε4與動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化以及蛛網(wǎng)膜下腔出血等血管風(fēng)險(xiǎn)因素呈正相關(guān)。最近的研究表明，APOE ε4可能導(dǎo)致VCI的患病風(fēng)險(xiǎn)增加[13]。通過對(duì)VCI患者的臨床統(tǒng)計(jì)研究分析發(fā)現(xiàn)：VCI組的APOE ε4頻率均高于對(duì)照組，VCI組APOE ε4攜帶者的簡易智力狀況檢查法(mini-mental state examination,MMSE)評(píng)分低于同組非APOE ε4攜帶者[14]，表明APOE ε4等位基因與血管性癡呆患者的認(rèn)知功能相關(guān)，可能是VCI的危險(xiǎn)因素之一。

APOE ε4與神經(jīng)血管功能障礙有關(guān)，導(dǎo)致APOE ε4基因型個(gè)體在沒有其他血管危險(xiǎn)因素的情況下，更容易產(chǎn)生低灌注性的白質(zhì)損傷，從而導(dǎo)致局部缺氧和認(rèn)知損害。實(shí)驗(yàn)表明，在腦低灌注的條件下，與野生型(WT)和APOE ε3基因靶向替換(APOE ε3-TR)小鼠相比，APOE ε4-TR小鼠的腦血流量顯著下降，白質(zhì)缺氧和白質(zhì)損傷增加，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的認(rèn)知障礙[15]。APOE ε4還會(huì)導(dǎo)致異常的神經(jīng)血管偶聯(lián)，激活缺氧敏感通路，降低神經(jīng)元損傷的修復(fù)能力，致使攜帶者的血管脆弱性增加，血管反應(yīng)性受損[16]，從而增加了認(rèn)知障礙發(fā)生的可能性。在建立慢性腦低灌注(CCH)模型的APOE基因敲除(APOE-KO)小鼠中，能夠觀察到Aβ和tau蛋白的過度磷酸化，白質(zhì)膠質(zhì)增生以及膠質(zhì)細(xì)胞活化[17]，提示VCI的發(fā)病機(jī)制可能與tau蛋白以及神經(jīng)炎癥相關(guān)。

3 神經(jīng)營養(yǎng)因子

3.1 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) VEGF家族包括從VEGF-A到VEGF-E和胎盤生長因子共6個(gè)成員，在人體內(nèi)主要由腦星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)；VEGF受體主要分為VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3三類。VEGF-A是參與調(diào)節(jié)血管再生的主要成分，通過激活VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1)介導(dǎo)了大部分的下游血管生成和神經(jīng)再生修復(fù)效應(yīng)[18]。在成人腦中，VEGF被認(rèn)為能夠?qū)δX血管損傷后的神經(jīng)起修復(fù)作用，在VCI患者和VCI模型大鼠受損的腦組織中，均檢測(cè)到VEGF-A和VEGFR-2表達(dá)上調(diào)[19]。此外，研究表明VEGFR-2在老年人腦小動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，且VEGFR2的表達(dá)會(huì)隨著年齡的年齡增加而增強(qiáng)，因此VEGFR-2可能還介導(dǎo)了VEGF相關(guān)的腦血管的老化過程[20]。

作為血管活性物質(zhì)，VEGF除了能夠增加血管通透性以外，還能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)血管生長，從而改善缺血腦組織的血液供應(yīng)。隨著腦部缺血組織的血液供應(yīng)改善，神經(jīng)血管單位的原有結(jié)構(gòu)得以保留，神經(jīng)重構(gòu)減少。除此之外，VEGF還有促進(jìn)神經(jīng)元存活，刺激軸突生長，抗凋亡，促進(jìn)海馬的神經(jīng)元再生等功能。外源性VEGF已被確定為有效改善因急性或慢性局部腦缺血而受損的認(rèn)知功能的潛在治療方法[21]，但其中的機(jī)制還有待研究。近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物和療法，如中藥參麥湯、羥基紅花黃色素A和化瘀通絡(luò)針灸等，可以通過促進(jìn)VEGFR和VEGF-A的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，增加突觸可塑性，促進(jìn)腦循環(huán)的恢復(fù)和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的重建[22-23]；激活VEGF相關(guān)機(jī)制來保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧損傷，抵抗氧化應(yīng)激等有害過程的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞丟失，增加海馬區(qū)血管數(shù)量[22，24]，從而改善VCI模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的一氧化氮合酶(NOS)參與了骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)移植后VD大鼠的血管生成；且BMMNCs移植能夠提高永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞(2-VO)大鼠的VEGF水平以及p-Raf1和p-ERK(VEGFR2信號(hào)通路下游蛋白)的水平，增加血管密度，減少白質(zhì)損傷[25]，認(rèn)知功能改善。在慢性腦低灌注模型中，神經(jīng)元的損傷、凋亡和過度自噬增加了VEGF-mRNA的表達(dá)[26]，MDP能有效促進(jìn)VEGF-mRNA的進(jìn)一步表達(dá)[27]。VEGF表達(dá)的增加促進(jìn)了血管再生，同時(shí)抑制炎癥、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和膠質(zhì)增生，促進(jìn)海馬神經(jīng)血管單位恢復(fù)[21]，改善空間學(xué)習(xí)記憶能力。

3.2 胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1) IGF-1是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，對(duì)神經(jīng)發(fā)生、血管生成和正常的生長發(fā)育十分重要。在人類與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，循環(huán)中IGF-1濃度隨著年齡的增長而顯著降低，導(dǎo)致神經(jīng)血管解偶聯(lián)、微血管疏松、內(nèi)皮功能障礙和血腦屏障的破壞[28]，使認(rèn)知能力下降。IGF-1與其受體(IGF1R)結(jié)合后，通過控制神經(jīng)營養(yǎng)反應(yīng)和細(xì)胞信號(hào)發(fā)揮作用，主要激活PI3K/mTOR/AKT和MAPK/ERK兩條信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的葡萄糖攝取、能量代謝、活性氧代謝和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)[29]。在慢性腦灌注不足導(dǎo)致的血管性癡呆大鼠海馬中，檢測(cè)到IGF-1/IGF-1R信號(hào)表達(dá)下調(diào)[30]，表明IGF-1介導(dǎo)的信號(hào)通路可能與VCI的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。除了相關(guān)的信號(hào)通路，IGF-1還可增強(qiáng)海馬CA1區(qū)的興奮性突觸傳遞，通過誘導(dǎo)海馬區(qū)血管生成和神經(jīng)生成改善空間學(xué)習(xí)和記憶能力[30]。在一項(xiàng)平均時(shí)長為3.6年的隨訪研究中，通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：血清IGF-1濃度低與血管性癡呆風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，且在對(duì)多個(gè)協(xié)變量進(jìn)行調(diào)整后，這種相關(guān)性仍然十分顯著[31]，表明低血清IGF-1是向血管性癡呆轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)標(biāo)志。

研究表明，IGF-1在治療腦缺血中具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用，外周注射IGF-1可以透過血腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用：缺血性腦損傷后給予IGF-1可減少腦梗死體積，減少相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[32]，改善神經(jīng)功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B(SalB)和2，3-二羥基苯甲酸十四酯(ABG-001)治療可以通過激活I(lǐng)GF-1/IGF-1R途徑抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞，減輕慢性腦灌注不足所致的脫髓鞘，從而維持正常的神經(jīng)血管偶聯(lián)，顯著改善血管性癡呆模型大鼠的認(rèn)知功能障礙[33-34]。

神經(jīng)血管偶聯(lián)(NVC)損害是VCI發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)。NVC損害會(huì)影響大腦活躍區(qū)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的局部腦血流量的即時(shí)調(diào)節(jié)，阻礙有毒性代謝副產(chǎn)物的清除以及能量和氧氣向神經(jīng)元的輸送。星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的微血管擴(kuò)張，在 NVC 反應(yīng)中起著核心作用。內(nèi)皮特異性的IGF1R信號(hào)干擾會(huì)損害NVC反應(yīng)[35]，表明IGF-1對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞健康和維持正常的NVC反應(yīng)至關(guān)重要。相似的，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的IGF1R信號(hào)受阻后，作為血管擴(kuò)張劑和膠質(zhì)遞質(zhì)的環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)釋放減少，可溶性環(huán)氧水解酶(SEH)表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致EET介導(dǎo)的膠質(zhì)血管偶聯(lián)反應(yīng)受損[38]，使認(rèn)知能力下降。

3.3 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) BNDF是體內(nèi)含量最多的一種神經(jīng)保護(hù)因子，是一類由神經(jīng)細(xì)胞合成的小分子堿性蛋白，廣泛分布于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦的海馬和皮質(zhì)高表達(dá)。BDNF介導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)和長時(shí)程抑制(long term depression,LTD)，與學(xué)習(xí)記憶過程中的突觸可塑性(synaptic plasticity)有關(guān)，能夠控制影響記憶和認(rèn)知的突觸相互作用，促進(jìn)神經(jīng)元突觸發(fā)生，提高海馬學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的突觸可塑性[37]。BNDF還能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌，拮抗神經(jīng)毒性物質(zhì)，提供神經(jīng)保護(hù)作用。BDNF與其特異性受體原肌球蛋白受體激酶B(TrkB)結(jié)合，激活包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷脂酶C(PI-PLC)等信號(hào)分子，調(diào)節(jié)局部突觸功能。BNDF還能夠與p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(P75NTR)結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF的表達(dá)會(huì)受到許多腦損傷的影響，缺氧后海馬神經(jīng)元BDNF表達(dá)水平明顯降低[38]，提示BDNF可能在VCI的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。最近的研究表明，3-正丁基苯酞(NBP)和利培酮均能夠通過提高海馬的BDNF表達(dá)水平，改善VCI動(dòng)物模型所致的認(rèn)知功能減退[39-40]。

運(yùn)動(dòng)會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)BDNF的上調(diào)，加強(qiáng)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)，使其免受最終損傷，并有利于神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)可塑性。Niu等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)的小鼠VCI模型中，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善小鼠認(rèn)知能力，提高環(huán)形RNA circRIMS2的表達(dá)水平，circRIMS2通過miR-186/BDNF途徑增加BNDF表達(dá)，降低miR-186表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡。同時(shí)，miR-186對(duì)BDNF有直接的負(fù)調(diào)控作用。有氧運(yùn)動(dòng)還能夠下調(diào)NF-κB，通過降低miR-503表達(dá)、提高BDNF表達(dá)，減輕血管性腦梗死[42]。康復(fù)訓(xùn)練同樣能夠通過提高BDNF及其活化受體pTrkB/TrkB的表達(dá)水平，下調(diào)JNK的表達(dá)及其通路的活性，提高Bcl-2/Bax比值[43]，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)、抑制細(xì)胞凋亡作用，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的重塑和功能恢復(fù)。

4 Nrf2

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是抗氧化防御的主要調(diào)節(jié)因子之一，細(xì)胞通常通過Nrf2來抵消過量活性氧和親電試劑造成的氧化應(yīng)激傷害。Nrf2具有7個(gè)Nrf2-ECH同源結(jié)構(gòu)域(Neh1-7)，其中Neh2結(jié)構(gòu)域包含DLG和ETGE兩個(gè)高度保守的氨基酸序列，介導(dǎo)與Nrf2負(fù)調(diào)節(jié)因子Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)的相互作用，對(duì)Nrf2的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控[44]。Keap1是一種氧化還原敏感的E3泛素連接酶底物適配器，在正常條件下，Nrf2與Keap1形成共價(jià)化合物，在胞漿中維持持續(xù)泛素化的非活性狀態(tài)。當(dāng)被氧化應(yīng)激過程產(chǎn)生的活性氧(ROS)激活時(shí)，Nrf2的DLG基序從Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域中釋放，使Nrf2的泛素化和降解被停止，細(xì)胞質(zhì)釋放Nrf2，由Neh5結(jié)構(gòu)域調(diào)控其定位進(jìn)入細(xì)胞核，并與抗氧化反應(yīng)元件(AREs)結(jié)合[45]。ARE是多種抗氧化和解毒酶基因啟動(dòng)子中的關(guān)鍵調(diào)控元件，其中包括血紅素加氧酶(HO-1)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、超氧化物歧化酶(SOD)和醌氧化還原酶1(NQO1)等[46]。Nrf2與ARE在細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)合誘導(dǎo)這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化和調(diào)節(jié)代謝的作用。

最近的多項(xiàng)研究表明，Nrf2激活劑可以通過激活Nrf2相關(guān)通路，顯著提高Nrf2的表達(dá)水平，同時(shí)促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)下游相關(guān)的HO-1、SOD、NQO1等抗氧化酶的表達(dá)，對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡和膠質(zhì)細(xì)胞激活起保護(hù)作用，降低氧化應(yīng)激水平[47-49]，從而改善認(rèn)知功能。在體外缺氧缺糖模型中，蘿卜硫素(SFN)能夠抑制 Keap1并上調(diào)Nrf2的表達(dá)，減少神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，減輕軸突損傷，增加髓鞘碎片清除，從而維持血腦屏障的完整性[50]。Sadovnikova等[51]研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/ARE通路能夠增強(qiáng)老年小鼠海馬中線粒體的生物發(fā)生、有絲分裂和抗氧化防御，從而降低線粒體DNA的氧化損傷程度，改善記憶功能；還能夠?qū)е履c道微生物群組成發(fā)生積極變化。除了減輕神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷外，Nrf2/ARE通路激活還被報(bào)道能夠通過抑制海馬神經(jīng)元的鐵死亡來改善CCH大鼠的認(rèn)知障礙[52]。

5 小結(jié)與展望

隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的不斷加快，VCI作為一種常見的老年性疾病，近年發(fā)病率不斷上升，給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，迫切需要在基礎(chǔ)科學(xué)、藥物研發(fā)和臨床治療方法上深入研究，建立有效的VCI治療策略。目前與VCI發(fā)病機(jī)制相關(guān)的通路研究還在不斷進(jìn)行，深入了解VCI發(fā)生、發(fā)展過程信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，對(duì)于預(yù)防和治療VCI具有十分重要的意義。