提高原人參二醇口服生物利用度的固體分散體及其片劑的制備與評價(jià)

劉春雨，趙云，廖永紅，楊飛飛

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

20(S)-原人參二醇(protopanaxadiol，PPD)為二醇型人參皂苷元，天然來源于人參、西洋參、三七等五加科植物，以及絞股藍(lán)等葫蘆科植物。商品PPD常通過微生物酵解二醇組人參皂苷獲得[1-2]。PPD具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、提高學(xué)習(xí)記憶、抗衰老、抗炎、抗癡呆、抗焦慮、抗抑郁、抗疲勞和促進(jìn)造血等廣泛的藥理活性[1-2]。但PPD水溶性較差，在水中的平衡溶解度僅為35.24 mg·L-1，油水分配系數(shù)(P)為46.21(logP=1.66)，腸灌流模型和細(xì)胞模型表明PPD的膜滲透性好，因此PPD屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中屬于溶解性差，滲透性好的第二類藥物[3]。對于此類藥物，溶出是藥物吸收的限速步驟，影響藥物口服生物利用度，改善藥物溶出為常用的提高此類藥物生物利用度的制劑方法[4]。文獻(xiàn)報(bào)道了采用納米晶、自微乳和聚合物膠束等手段有效提高PPD溶出和口服生物利用度的研究[5-8]，其中基于納米晶技術(shù)的方法表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。本文擬報(bào)道一種新型PPD固體分散體，其加水復(fù)溶后可轉(zhuǎn)化為納米混懸液，改善PPD的溶解度、溶出度和口服生物利用度。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 E2695-2489高效液相色譜儀(美國Waters公司)；3200 Q-TRAP液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MS/MS(美國Applied Biosystem公司)；Analyst 1.4 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Applied Biosystem公司)；XS105S 十萬分之一電子天平(瑞士 Mettler Toledo 公司)；Gilson 移液器(法國 Gilson 公司)；Vortex-5 渦旋混勻器(江蘇其林貝爾儀器制造有限公司)；臺式微量高速冷凍離心機(jī)(Micro 17R，美國Thermo Scientific公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國 Heidolph公司)。

1.2 試劑 原人參二醇(≥95%，北京博肽未名生物技術(shù)有限公司)；PPD和地高辛標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁試劑有限責(zé)任公司)；乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯共聚64(PVP-VA，上海維酮材料科技有限公司)；D-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯(TPGS，西安海斯夫生物科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；泊洛沙姆188(F68，北京風(fēng)禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司)；色譜級乙腈和甲醇(德國Merk公司)；無水乙醇(北京化工廠)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 PPD體外含量測定方法 PPD體外含量測定采用HPLC方法，具體條件是色譜柱：Thermo BDSHYPERSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流速：1 mL·min-1，檢測波長：203 nm，進(jìn)樣量：50 μL，流動(dòng)相：10%水∶90%乙腈。

2.2 PPD固體分散體處方篩選和優(yōu)化 處方篩選擬評價(jià)F68和TPGS兩種表面活性劑的固體分散體處方。PPD固體分散體采用溶劑蒸發(fā)法制備，具體是按表1稱取處方量的PPD和輔料于圓底燒瓶中，加入適量無水乙醇溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，圓底燒瓶密封置于-20 ℃冰箱中固化20 min，取出后過200目篩，置干燥器中避光保存。處方優(yōu)化的目的是提高PPD載藥量和減少輔料的用量，具體處方見表2。

表1 PPD固體分散體制備處方組成

表2 PPD固體分散體制備處方優(yōu)化組方

2.3 固體分散體復(fù)溶后的粒徑分布 取10 mg PPD固體分散體復(fù)溶在5 mL人工胃液中，然后用馬爾文激光粒度(ZetasizerNanoZS 90)測定其平衡10 min和放置8 h后的平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)。

2.4 PPD固體分散體片劑的制備 PPD固體分散體在處方中為主藥，每片PPD含量為100 mg。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以壓片物料的流動(dòng)性、片劑的可壓性、崩解時(shí)間及外觀光潔度作為評價(jià)制劑質(zhì)量的指標(biāo)，對分散片的崩解劑、填充劑及潤滑劑的種類及用量進(jìn)行篩選。在單因素考察試驗(yàn)中，按基本處方進(jìn)行試驗(yàn)：PPD固體分散體(含PPD 100 mg)80%、填充劑10%，崩解劑9%、潤滑劑1%。以乳糖、可壓性淀粉和微晶纖維素(MCC)為填充劑，硬脂酸鎂為潤滑劑，崩解劑選擇羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)、交聯(lián)聚維酮(PPVP)或交聯(lián)羧甲纖維素鈉(CC-Na)。

采用直接壓片法制備固體分散體片劑。具體是將PPD固體分散體過80目篩，其他輔料過100目篩，按處方量分別稱取主藥PPD固體分散體及各種輔料，混合均勻，最后加上潤滑劑過100目篩，混合均勻，檢驗(yàn)合格后壓片即可。取PPD固體分散片，照崩解時(shí)限檢查法[《中國藥典》2015年版(二部)附錄XA]，測定片劑崩解時(shí)間。

2.5 PPD固體分散片體外溶出試驗(yàn) 比較優(yōu)化后的固體分散體和原藥經(jīng)相同處方物理混合壓片的片劑的體外溶出度。分別取兩種自制片各6 片，以純水為溶出介質(zhì)，參照《中國藥典》2015 年版片劑溶出度測定法(漿法)進(jìn)行考察。溶出介質(zhì)為500 mL，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，溫度設(shè)置為(37±2)℃，分別在第15、30、60、90、120、240、360、480 min 取樣，用微孔濾膜過濾，濾過液經(jīng)90%的甲醇溶液稀釋后，用HPLC進(jìn)樣分析。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)要指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。雄性Wistar大鼠(180～220 g，8周)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK-京2012-0001)，實(shí)驗(yàn)前在SPF動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。所有動(dòng)物均保持在控制溫度(22±2)℃，12 h光照/黑暗周期，并自由飲食和飲水。

2.6.2 頸靜脈插管手術(shù) 將大鼠腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥鈉生理鹽水溶液，深度麻醉后，在右嘴角向鎖骨處做一條垂線，在交點(diǎn)上方約0.5 cm的部位，用剪刀將皮膚剪開一個(gè)1 cm 左右的切口，鈍性分離頸靜脈，并將其遠(yuǎn)心端結(jié)扎，在頸靜脈竇遠(yuǎn)心方向約0.5 cm處剪一個(gè)小切口，沿切口處向心臟方向插入約2.5 cm的聚乙烯管(ID 0.5 mm，OD 1 mm，英國Portex公司)，并將聚乙烯管末端沿皮下在背部導(dǎo)出，用肝素生理鹽水溶液封管，結(jié)扎固定，縫合開口。術(shù)后至少恢復(fù)12 h以上。所有動(dòng)物給藥前禁食不禁水。

2.6.3 大鼠口服灌胃給藥和取血樣 雄性Wistar大鼠插管手術(shù)恢復(fù)后隨機(jī)分成2組，每組6只，標(biāo)號后灌胃給予PPD固體分散片和PPD物理混合片劑。給藥前片劑按3 mg?mL-1的PPD濃度分散在水中，給藥體積為10 mL·kg-1灌胃給藥，相當(dāng)于PPD劑量為30 mg·kg-1。給藥后分別在15、30、45、60、120、180、240、360、720 min時(shí)間點(diǎn)從頸靜脈置留管中取全血約0.12 mL放于含有抗凝劑肝素的EP管中，5 000 r·min-1離心5 min收集得50 μL血漿，冷凍儲(chǔ)存待用。

2.6.4 樣品處理方法 取50 μL血漿置于2 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)地高辛(250 μg·mL-1)10 μL和40 μL磷酸緩沖液，渦旋震蕩5 min。加入二氯甲烷1.5 mL，渦旋震蕩10 min，12 000 r·min-1離心5 min，小心吸取溶液，高純氮?dú)獯蹈蓳]發(fā)掉有機(jī)溶劑，殘?jiān)尤?00 μL 80%甲醇復(fù)溶，渦旋震蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清經(jīng)HPLC-MS/MS分析檢測。

2.6.5 LC-MS/MS血漿樣品分析方法 LC-MS/MS血漿樣品分析方法采用作者前期報(bào)道的方法[11]。

2.6.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用WinNonlin軟件(版本6.1，美國Pharsight公司)計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。包括最高血藥濃度(Cmax)，最高血藥濃度時(shí)間(Tmax)，半衰期(t1/2)和生物利用度(AUC0～t)。

3 結(jié)果

3.1 PPD固體分散體處方優(yōu)化 PPD和PVP或PVP-VA溶于乙醇溶液后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮干燥后可形成固體分散體，復(fù)溶于水后，藥物溶液沉淀。當(dāng)在其中加入F68或TPGS后，復(fù)溶后可形成納米混懸液。尤其是在PVP-VA中加入TPGS后，固體分散體復(fù)溶后可形成平均粒徑小于120 nm的納米混懸液(見表3)。因此進(jìn)一步處方優(yōu)化選用PVP-VA作為固體分散體的分散載體材料?？紤]到表面活性劑可能對胃腸道存在一定的毒副作用，在處方優(yōu)化時(shí)，表面活性劑用量盡量減小。

表3 不同固體分散體處方粒徑結(jié)果

表4 不同固體分散體處方粒徑結(jié)果

3.2 PPD固體分散片處方優(yōu)化 優(yōu)選的PPD固體分散體可直接壓成片劑，但片劑遇水后黏性很大，難以崩解。因此考慮在壓片時(shí)加入一定量的常用崩解劑和填充劑。在CMS-Na、CCNa和PPVP 3種崩解劑中，CMS-Na和CCNa的崩解效果不顯著，而PPVP吸水膨脹性強(qiáng)，觀察結(jié)果顯示其有很好的崩解效果(見表5)，因此選用PPVP為PPD固體分散體片劑的崩解劑。

在常用片劑輔料中，MCC既可作填充劑，還具有一定促崩解作用，本研究中，使用MCC的PPD片劑表面光滑，可壓性優(yōu)于其他輔料，但使用MCC的片劑反而不易崩解。和可壓性淀粉相比，乳糖的可壓性和崩解性能均優(yōu)于淀粉，因此選擇乳糖作為填充劑。當(dāng)固定崩解劑和填充劑總量為處方量為19%，乳糖∶PPVP為1∶3時(shí)，崩解時(shí)間可縮短至約9 min，且可壓性良好(見表5)。由此確定PPD固體分散片優(yōu)化處方為：PPD固體分散體PVP-VA-TPGS-2 80%、填充劑乳糖4%、崩解劑PPVP 15%、潤滑劑硬脂酸鎂1%，片劑中PPD的含量為25%。

表5 輔料對片劑性能的影響篩選結(jié)果

對優(yōu)化后的固體分散片，以及基于固體分散材料物理混合的片劑進(jìn)行了體外溶出試驗(yàn)。在物理混合的片劑中，PPD原藥的平均粒徑為(17.4±0.8)μm。從圖1中的溶出結(jié)果可知，固體分散片在15 min時(shí)溶出量超過了90%，而物理混合的片劑15 min時(shí)只有約10%的藥物溶出。需要注意的是，溶出的藥物是以納米混懸的形式存在，而不是藥物分子形式溶出，因?yàn)槿艹鲆翰捎?.22 μm濾膜過濾，分散體復(fù)溶形成的納米?？山?jīng)濾膜過濾。

圖1 PPD固體分散體和物理混合物的體外溶出曲線

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果 大鼠口服PPD固體分散體和物理混合物的藥-時(shí)曲線和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見圖2和表6。由結(jié)果可知，固體分散體口服給藥后可快速吸收入血，達(dá)峰時(shí)間為30 min，而物理混合物的PPD則顯示出緩慢吸收的特性，沒有明顯的達(dá)峰時(shí)間。固體分散體的快速溶出顯著提高了其最高血藥濃度達(dá)6.59倍，同時(shí)其相對生物利用度也是物理混合物的2.54倍。

圖2 PPD固體分散體和物理混合物以30 mg·kg-1劑量經(jīng)大鼠口服給藥后的藥時(shí)曲線

表6 PPD固體分散體和物理混合物以30 mg·kg-1劑量經(jīng)大鼠口服給藥后的的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4 討論

固體分散技術(shù)可以顯著增加難溶性藥物的溶解度和溶出速率，提高藥物生物利用度。人參皂苷元PPD在水中的溶解度低，通過固體分散技術(shù)，提高其在水中的溶解度?？诜腆w分散體在胃腸道復(fù)溶后，藥物形成過飽和溶液。溶解后的藥物分子經(jīng)歷吸收和重結(jié)晶兩個(gè)過程的相互競爭[9]。傳統(tǒng)的固體分散技術(shù)是通過選擇適當(dāng)?shù)妮o料材料，延長藥物在胃腸道的過飽和狀態(tài)，抑制藥物重結(jié)晶，從而提高難溶性藥物的口服生物利用度。但延長藥物的過飽和狀態(tài)并不容易，一般載藥量超過5%時(shí)，很難形成穩(wěn)定的過飽和溶液。

本文研究了一種新型溶出機(jī)制的固體分散體。在固體分散體復(fù)溶時(shí)，不是通過提高過飽和溶液的穩(wěn)定性，而是加速過飽和溶液中藥物重結(jié)晶，通過控制重結(jié)晶后藥物的粒徑，使其形成穩(wěn)定的納米混懸液，提高PPD的溶出特性。當(dāng)TPGS用量從處方量的33%減少到20%時(shí)，復(fù)溶后的納米混懸液平均粒徑略有增加，從約(101.6±4.2)nm增大到(115.1±1.5)nm，納米混懸液放置8 h后略有增大，分別增大到(124.3±2.9)nm和(136.7±0.7)nm。當(dāng)繼續(xù)降低TPGS的用量時(shí)，復(fù)溶的納米混懸液的粒徑開始增大，并且在酸性介質(zhì)中放置8 h下出現(xiàn)沉淀。因此，優(yōu)選的固體分散體處方PPD∶PVP-VA∶TPGS組成為100∶140∶60。固體分散體中加入表面活性劑可抑制藥物結(jié)晶，并提高終產(chǎn)品片劑的物理穩(wěn)定性。當(dāng)終產(chǎn)品進(jìn)行溶出測試時(shí)，在沒有考慮復(fù)溶溶劑的漏槽條件情況下形成至少穩(wěn)定8 h的納米混懸劑。

體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固體分散體經(jīng)大鼠口服后可以顯著提高PPD的口服生物利用度。利用控制結(jié)晶法制備PPD納米晶提高藥物溶出特性和口服生物利用度的方法已有研究報(bào)道。在該研究中，Chen等[10]利用反溶劑法將溶有高濃度PPD的有機(jī)溶劑滴加到含有保護(hù)劑的水相中，PPD可通過控制重結(jié)晶過程制備藥物納米晶，含有表面活性劑作為保護(hù)劑的PPD納米晶混懸液的Cmax和生物利用度分別是原藥制劑4.74倍和1.81倍。在本研究中，固體分散體Cmax和生物利用度分別是原藥及輔料物理混合物的6.59倍和2.54倍，說明固體分散體原位形成的納米混懸液具有更好的增溶作用。同時(shí)，本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)固體分散體不含表面活性劑時(shí)，復(fù)溶后的藥物迅速重結(jié)晶形成大的顆粒而沉淀；而加入表面活性劑可控制PPD結(jié)晶后的粒徑大小，比較而言，加入TPGS可形成比F68更小的納米顆粒。這一采用表面活性劑控制結(jié)晶的策略和文獻(xiàn)納米晶的制備方法基本一致，并具有類似的控制效果[11]。和納米晶口服藥物制劑相比，本研究中的可轉(zhuǎn)化為納米混懸劑的固體分散體具有兩個(gè)優(yōu)勢：首先制備簡單，可直接通過真空干燥法制備固體分散體，然后制備為片劑；其次所需的表面活性劑的用量更低，因?yàn)榛诠腆w分散體的納米混懸劑是在溶出部位原位形成的，局部的表面活性濃度高，因此需要的表面活性劑用量更低。