一測多評法測定安神寧中4個木脂素含量

宋沛穎，李慧勇，那微，筆雪艷，肖宇

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江省藥品檢驗研究院，黑龍江 哈爾濱 150088；3.國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究與評價重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150088；4.黑龍江省中藥質(zhì)量研究與評價重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150088)

安神寧為中藥糖漿劑，由刺五加浸膏、靈芝、五味子制備而成，其中靈芝、五味子粉碎成粗粉后加60%乙醇浸漬壓榨，壓榨液加刺五加浸膏攪勻制備而成，具扶正固本、益氣健脾、補腎安神作用，主要用于神經(jīng)衰弱、食欲不振、全身無力等。處方中五味子為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實，具收斂固澀、益氣生津、補腎寧心作用[1]。其中木脂素類成分在五味子果實中含量較高，也是發(fā)揮五味子多種功效的有效成分，主要含有五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲、五味子醇乙等[2-5]。

在中藥、天然藥物等復雜體系的成分分析和質(zhì)量評價工作中，應用傳統(tǒng)外標法對產(chǎn)品含量進行測定，對照物質(zhì)使用量大且品類繁多，部分對照物質(zhì)穩(wěn)定性較差，對照品制備成本高，技術(shù)操作難度大，質(zhì)量監(jiān)控過程煩瑣，對產(chǎn)品進行多指標整體控制，逐漸成為產(chǎn)品質(zhì)量控制的研究方向[6-7]。本研究應用外標法同時測定安神寧中4個木脂素含量，同時建立以五味子醇甲為內(nèi)參物，確定五味子醇甲與五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素之間的相對校正因子，計算各成分的含量的一測多評方法，可用于安神寧的質(zhì)量控制[8-12]。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Thermo Evolution 201紫外-可見分光光度計(Thermo公司)；超聲波清洗儀AS10200A(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Laborota 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)。

Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色譜柱；五味子醇甲對照品(批號：110857-201714，含量99.9%)、五味子甲素對照品(批號：110764-201714，含量99.3%)、五味子乙素對照品(批號：110765-200710，純度>98%)均購于中國食品藥品檢定研究院；五味子醇乙對照品(批號：32120010，純度>98%)來自上海安譜實驗科技股份有限公司；研究用10批安神寧樣品由黑龍江雙蘭星制藥有限公司(國藥準字Z23020211)提供；乙腈、甲醇為色譜純(Honeywell公司)，其余試劑為分析純(國藥集團化學試劑)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 檢測波長確定 取4種對照品適量，制成每1 mL各含0.05 mg的混合對照品溶液，以Thermo Evolution 201紫外-可見分光光度計、島津LC-2010A高效液相色譜儀(DAD檢測器)在190～400 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，4種木脂素混合溶液在217 nm處有最大吸收。

2.1.2 流動相組成及洗脫程序[13-15]乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，20% A→60% A；10～25 min，60% A；25～35 min，60% A→75% A；35～45 min，75% A→80% A；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲30 μg、五味子醇乙10 μg、五味子甲素10 μg、五味子乙素10 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取供試品溶液10 mL，至25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定方法

2.3.1 專屬性試驗 按處方比例、工藝制備缺五味子藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項供試品溶液制備陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進入液相色譜儀進行分析，結(jié)果陰性對照色譜圖中，在五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，五味子醇甲色譜峰相鄰處雖有一小色譜峰可能對樣品產(chǎn)生干擾，但其面積小于樣品中五味子醇甲峰面積的5%，符合《中國藥典》2020年版要求[1](見圖1)。

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.3.2 線性關(guān)系考察 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，配制系列濃度對照品混合溶液，進入液相色譜儀進行分析，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果4種成分線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察(n=8)

2.3.3 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素RSD分別為0.1%、0.1%、0.3%、0.2%，精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取安神寧樣品(批號：150901)，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進入液相色譜儀進行分析，計算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均含量及RSD分別為：五味子醇甲0.083 2 mg·mL-1(RSD=0.5%)、五味子醇乙0.020 0 mg·mL-1(RSD=1.7%)、五味子甲素0.010 4 mg·mL-1(RSD=1.3%)、五味子乙素0.013 0 mg·mL-1(RSD=1.5%)，重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、1、3、6、10、15、21、28 h按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結(jié)果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD分別為 0.3%、0.2%、1.0%、0.3%，穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率 精密稱取已知含量安神寧樣品5 mL(批號：150901，含量見重復性試驗結(jié)果)，精密加入已知濃度的對照品混合溶液，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進入液相色譜儀進行分析，結(jié)果加樣回收率分別為五味子醇甲98.52%(RSD=0.8%)、五味子醇乙103.43%(RSD=1.4%)、五味子甲素109.69%(RSD=0.9%)、五味子乙素107.92%(RSD=1.7%)，準確性良好(見表2)。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3.7 耐用性試驗 使用Agilent 1100液相色譜儀，分別選用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色譜柱進行分析；使用Waters e2695液相色譜儀，Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色譜柱在進行分析，測定結(jié)果五味子醇甲平均含量0.086 7 mg·mL-1(RSD=0.9%)、五味子醇乙0.021 4 mg·mL-1(RSD=1.5%)、五味子甲素0.016 7 mg·mL-1(RSD=1.9%)、五味子乙素0.019 7 mg·mL-1(RSD=1.7%)，耐用性良好。

2.4 相對校正因子的計算

2.4.2 相對校正因子耐用性考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液5 μL，平行進樣2次，以五味子醇甲為內(nèi)參物，考察不同液相色譜儀、不同色譜柱五味子醇甲對其他3個成分的相對校正因子(RCF)值，結(jié)果耐用性良好(見表3)。

表3 相對校正因子耐用性考察

2.4.3 相對保留時間RT考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液5 μL，平行進樣2次，以五味子醇甲為內(nèi)參物，考察不同液相色譜儀、不同液相色譜柱五味子醇甲對其他3個成分的相對保留時間，結(jié)果3個木脂素成分相對保留時間平均值分別為RT五味子醇乙=1.118(RSD=1.0%)、RT五味子甲素=2.349(RSD=1.9%)、RT五味子乙素=2.603(RSD=2.2%)，其相對保留時間應在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)。

2.4.4 一測多評法與外標法含量測定結(jié)果比較 取安神寧樣品共10批，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進入液相色譜儀進行分析，應用外標法(EMS)及本研究建立的一測多評方法(QAMS)對同一供試品溶液同時測定，結(jié)果兩者測定含量結(jié)果基本一致，一測多評方法可用于該品種的含量測定(見表4)。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg·mL-1)

3 討論

3.1 檢測波長的確定 本試驗確定檢驗波長試驗，取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素對照品制成每1 mL各含0.05 mg的混合對照品溶液，使用Thermo Evolution 201紫外-可見分光光度計，在190～400 nm范圍內(nèi)掃描，混合對照物質(zhì)溶液于217 nm處有最大吸收；用島津LC-2010A高效液相色譜儀DAD檢測器測定最大吸收，五味子醇甲、五味子醇乙在λ=216 nm、五味子甲素在λ=214 nm處、五味子乙素在λ=215 nm處有最大吸收，綜合上述，本試驗選擇217 nm作為測定波長。

3.2 流動相確定 本試驗應用甲醇-水、乙腈-水[16-17]兩套系統(tǒng)對樣品進行分析測定，結(jié)果甲醇-水系統(tǒng)雖然能達到較好的分離效果，但是基線漂移幅度大，分離色譜峰的峰面積波動大，而乙腈-水系統(tǒng)基線平穩(wěn)，樣品分離度好。

3.3 溶液穩(wěn)定性 穩(wěn)定性試驗過程中發(fā)現(xiàn)，4個木質(zhì)素類成分24 h內(nèi)穩(wěn)定性好良好，色譜峰面積穩(wěn)定；繼續(xù)監(jiān)測穩(wěn)定性，除五味子醇甲峰面積基本保持穩(wěn)定外，其余3種木質(zhì)素峰面積均發(fā)生改變。同時，五味子醇甲在五味子中含量較大，有指征性。綜上，故本方法選擇五味子醇甲為一測多評內(nèi)參物。