基于網(wǎng)絡藥理學探討“酸棗仁-當歸”藥對治療失眠的作用機制

丁勻喬，楊波*，彭海生，蔣蕾，張文遠

(1.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)，黑龍江 大慶 163319)

失眠(insomnia)是一種神經(jīng)性的睡眠障礙類疾病，也是一種心理疾病[1]。中醫(yī)上通常將失眠稱為“不寐”，臨床表現(xiàn)主要是難以入睡、醒后不易入睡、睡時易醒、徹夜難寐、多夢等[2]。長期失眠會造成精神不振、食欲減退、記憶力下降等，對人們的工作生活具有嚴重影響。若不及時治愈，會誘發(fā)焦慮不安、抑郁、恐懼急躁等精神紊亂等癥狀，對胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、認知功能也具有嚴重影響，且會增加心血管類疾病及神經(jīng)性疾病的發(fā)病率[3]。西醫(yī)在治療失眠上常用苯二氮卓類、巴比妥類等鎮(zhèn)靜催眠藥，雖有明顯療效，但長期服用會產(chǎn)生耐受性、依賴性、停藥反跳等不良反應[4]。中藥主要是以清熱去火、養(yǎng)心安神、滋陰補陽來治療失眠且無不良反應、安全有效，故以中藥治療失眠成為一大趨勢。

失眠的發(fā)病機制極其復雜，至今尚未有明確闡述。酸棗仁為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou]的干燥成熟種子。甘、酸，平，歸肝、膽、心經(jīng)。可治療失眠焦慮，達到養(yǎng)心安神、保護心臟的作用，酸棗仁中的總皂苷可抑制中樞神經(jīng)興奮，起到明顯鎮(zhèn)靜催眠的作用[5]。當歸為傘形科植物當歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根。甘、辛，溫。歸肝、心、脾經(jīng)。當歸中的揮發(fā)油、有機酸、黃酮類等具有抗炎平喘、抗抑郁、強腎保肝、補氣血等功效[6]。二者聯(lián)用可起到補氣養(yǎng)血、養(yǎng)心安神等作用。由于中藥成分多、作用靶點多，傳統(tǒng)的藥理學方法難以闡明中藥治療疾病的復雜機理[7]。網(wǎng)絡藥理學作為一種近年來興起的新技術，通過其大量的數(shù)據(jù)分析及多種數(shù)據(jù)庫檢索，可更為整體的探究藥物與疾病之間的關系，預測其作用機制[8]，且符合中醫(yī)理論，通過建立藥物、靶點、途徑和疾病的復雜網(wǎng)絡來揭示藥物的治療機理。因此，許多研究人員利用網(wǎng)絡藥理學來探索中藥的物質(zhì)基礎，預測中藥的作用機理，同時運用分子對接模擬分子和蛋白質(zhì)之間的幾何結構和相互作用來探索分子在目標蛋白質(zhì)結合位點的行為[9]，大大節(jié)省了實驗時間。

有相關學者通過大量數(shù)據(jù)挖掘并分析總結發(fā)現(xiàn)，酸棗仁、當歸單味用藥頻次較高，而“酸棗仁-當歸”藥對使用頻次也較高，且具有良好的支持度與置信度[10]。目前尚無文章僅對“酸棗仁-當歸”藥對進行研究，故本文通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術，構建成分-靶點及PPI網(wǎng)絡圖，對其潛在靶點進行預測并深入探討該藥對治療失眠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 “酸棗仁-當歸”藥對活性成分及靶點的收集 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫TCMSP(https://tcmspw.com/)中分別以“酸棗仁”“當歸”為關鍵詞進行檢索。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選條件進行篩選并匯總，得到藥對的有效活性成分及相應靶點。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中，選定已檢索的物種為人類(Human)的基因下載，將有效活性成分的靶點轉(zhuǎn)化成相應的基因名。

1.2 失眠靶點的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“Insomnia”為關鍵詞進行檢索，以Relevance score≥0.98為篩選條件，得到與失眠相關的疾病靶點。

1.3 “酸棗仁-當歸”藥對-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建 建立Excel表格對中藥、活性成分及靶點進行自命名，導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“酸棗仁-當歸”藥對-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，并對其進行分析。

1.4 靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖的構建 將最終得到的“酸棗仁-當歸”藥對靶點與失眠靶點導入韋恩圖繪制軟件Draw Venn Diagiam(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)生成韋恩圖，得到“酸棗仁-當歸”藥對與疾病的交集靶點。將交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設定條件為“Homo sapiens”，參數(shù)設定為>0.4，得到蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡圖。

1.5 GO功能富集與KEGG通路分析 利用R studio 1.4.1106軟件對交集靶點進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)功能富集分析。基因本體富集分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(cellular component,CC)、細胞組成(molecular functinn,MF)。以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。取富集數(shù)量排名前十的生物學過程及二十條通路進行繪圖。并結合國內(nèi)外文獻篩選與失眠相關的通路進行分析。

1.6 分子對接 選取PPI網(wǎng)絡圖中degree值排名前五的靶點，通過RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載對應的靶點蛋白，保存為PDB格式。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載“酸棗仁-當歸”藥對活性成分的結構，保存為mol2格式。通過Autodock軟件對靶點蛋白進行去除水分子并加氫處理，將受體與配體進行分子對接，記錄對接的分數(shù)進行評估，一般認為得分>4.25為有一定的結合活性，得分>5為結合活性較強，≥7為結合能力極強[11]。在PyMOL軟件中對得分最高的成分靶點對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 “酸棗仁-當歸”藥對活性成分及靶點的篩選結果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到酸棗仁、當歸中的活性成分共158個，其中酸棗仁33個，當歸125個，經(jīng)過OB≥30%且DL≥0.18為條件篩選后，得到活性成分11個，其中酸棗仁9個，當歸2個，無相同成分。靶點共88個，其中酸棗仁40個，當歸48個，刪除重復靶點，最終“酸棗仁-當歸”藥對活性成分的靶點共50個。11個活性成分基本信息見表1。

表1 “酸棗仁-當歸”藥對活性成分基本信息

2.2 失眠相關靶點的收集 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，獲取失眠相關靶點共2 563個，經(jīng)過Relevance score≥0.98為條件篩選后得到相關靶點1 348個。

2.3 “酸棗仁-當歸”-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖 將TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到的2味中藥、9個活性成分與50個相應靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件繪圖，得到藥對-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，其中2個成分未參與繪制(見圖1)。圖中可見節(jié)點共61個，邊線共97條。其中黃色代表中藥名稱，粉色代表酸棗仁活性成分，紫色代表當歸活性成分，藍色代表靶點基因。連接度超過10的有4個活性成分，β-谷甾醇連接度最高，能與34個靶點相互作用，其次為烏藥堿，與21個靶點相互作用，豆甾醇與14個靶點相互作用，齊墩果堿與11個靶點相互作用。β-谷甾醇、豆甾醇來源于當歸，烏藥堿、齊墩果堿來源于酸棗仁。

圖1 “酸棗仁-當歸”藥對-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.4 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖的構建與篩選 將“2.1”項下得到的50個活性成分靶點與“2.2”項下得到的1 348個疾病靶點導入韋恩圖繪制軟件Draw Venn Diagiam，得到韋恩圖(見圖2)。從圖中可得交集靶點20個。將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中生成PPI網(wǎng)絡圖(見圖3)。圖中可得交集靶點蛋白節(jié)點20個，相互作用邊線76條，平均節(jié)點度為7.6，PPI富集P值為1.0×10-16,其中degree≥10的節(jié)點有6個，分別為乙酰膽堿酯酶(ACHE)、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運蛋白(SLC6A4)、胺氧化酶[含黃素]A(MAOA)、鈉依賴性多巴胺轉(zhuǎn)運體(SLC6A3)、α-2A腎上腺素能受體(ADRA2A)、胺氧化酶[含黃素]B(MAOB)。可認為這6個靶點蛋白在PPI中互作明顯，為酸棗仁-當歸藥對治療失眠的核心靶點。

圖2 “酸棗仁-當歸”藥對靶點與失眠相關靶點韋恩圖

圖3 潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

2.5 GO功能富集與KEGG通路分析 通過R Studio軟件對20個交集靶點蛋白進行GO功能富集和KEGG通路分析。得到GO條目503個(P<0.05)，其中生物過程(BP)396個，分子功能(CC)54個，細胞組成(MF)53個。分別選取富集基因數(shù)排名前十的條目繪圖(見圖4)。得到KEGG通路共33條(P<0.05)，根據(jù)富集基因數(shù)大小，選取前20條通路繪制氣泡圖(見圖5)，圖中圓點代表富集靶點數(shù)量，顏色越紅，P值越小，可信度高。

圖4 GO功能富集柱狀圖

圖5 前20條KEGG通路氣泡圖

經(jīng)分析得，GO富集中生物過程主要包括G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、腎上腺素能受體信號通路等；分子功能主要包括突觸前膜、突觸后膜、膜茷等；細胞組成主要包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、兒茶酚胺結合、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動等。KEGG通路分析與文獻調(diào)查得，涉及失眠的重要通路有神經(jīng)活性配體受體相互作用、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、膽堿能突觸、cAMP信號通路等。

2.6 分子對接結果分析 通過Autodock軟件將酸棗當歸藥對的活性成分丁子香萜、β-谷甾醇、豆甾醇、美洲茶酸、烏藥堿、胡蘿卜甾醇、酸棗仁皂苷、植物甾醇、酸棗仁環(huán)肽、獐牙菜素、齊墩果堿與PPI網(wǎng)絡圖中得到的核心靶點SLC6A3、ADRA2A、ACHE、SLC6A4、MAOA、MAOB進行分子對接(對接結果評分表見2)。發(fā)現(xiàn)丁子香萜、烏藥堿、酸棗仁皂苷、β-谷甾醇、豆甾醇、胡蘿卜甾醇與6個核心靶點結合能力強。其中丁子香萜-MAOB、烏藥堿-SLC6A4的結合能均<-9 kJ·mol-1。丁子香萜-MAOB結合能力最強，通過PyMOL軟件對其對接結果進行可視化(見圖6)。

表2 分子對接評分結果

圖6 丁子香萜與MAOB對接結果圖

3 討論

失眠在人群中極為普遍，在過去的幾年中，通過替代療法改善患者的生理精神狀態(tài)，提高患者的睡眠質(zhì)量的方法愈發(fā)流行。通過對中藥主要成分進行分析，研究其藥理作用的方法越來越受到研究者的關注。將酸棗作為良藥用于治療失眠在中國已有兩千余年的歷史，酸棗仁作為中國傳統(tǒng)中藥之一，已鑒定出150多種化合物，包括萜類化合物，生物堿，類黃酮等，具有多種藥理作用如鎮(zhèn)靜、催眠、抗炎和抗氧化等。水迷宮和跳臺實驗表明，酸棗仁還具有改善失眠大鼠學習和記憶能力的作用[12]。當歸是一種傳統(tǒng)的藥用和食用植物，長期以來被用于補血、減輕疼痛、潤滑腸道并治療女性月經(jīng)不調(diào)和閉經(jīng)。近年來有文獻表明其在治療失眠方面也有一定的作用[13]?！八釛椚?當歸”藥對有著非常有效的鎮(zhèn)靜催眠作用，但治療失眠的具體機制尚不清楚，這限制了該藥進一步的臨床應用，本文通過借助網(wǎng)絡藥理學篩選潛在靶點，并通過分子對接的方法對可能的機制進行初步探討。

在本研究中，通過研究網(wǎng)絡藥理學進行靶標預測，建立PPI蛋白互作網(wǎng)絡，GO和KEGG富集分析和分子對接驗證，討論了“酸棗仁-當歸”藥對治療失眠的可能機制。在篩選的“酸棗仁-當歸”藥對的有效成分中，植物甾醇具有神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，能夠抑制乙酰膽堿酯酶活性[14]，β-谷甾醇已證明具有鎮(zhèn)靜、強心的作用，可以維持神經(jīng)傳導、鎮(zhèn)靜神經(jīng)，平復情緒，改善睡眠不實。有資料表明[15]，酸棗仁中的總皂苷可明顯阻斷小鼠中樞神經(jīng)興奮，促使小鼠睡眠及提高其睡眠質(zhì)量，并對神經(jīng)遞質(zhì)、受體、失眠參數(shù)等也都具有調(diào)節(jié)作用，通過改善睡眠同時也達到抗抑郁、焦慮等作用，是酸棗仁產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用最主要的成分[16]。張妍等[17]通過搖籃試驗比較了酸棗仁皂苷和地西泮的鎮(zhèn)靜作用，指出酸棗仁皂苷的鎮(zhèn)靜作用比地西泮更穩(wěn)定，更持久。Zhang等[18]研究得到酸棗仁皂苷對谷氨酸介導的海馬興奮性信號通路具有抑制作用，并且可能通過其抗鈣調(diào)蛋白發(fā)揮作用。生物堿類不僅有鎮(zhèn)靜催眠的作用，還可通過調(diào)節(jié)免疫功能、影響炎癥細胞因子和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)起到抗抑郁作用[19]。但烏藥堿、齊墩果堿相關研究較少，尚不能說明具有鎮(zhèn)靜催眠作用，有待進一步探索。

在失眠疾病靶點與活性成分靶點相交的韋恩圖中，我們得到了20個交集靶點，通過PPI蛋白互作網(wǎng)絡我們得到了與失眠相關聯(lián)了6個核心靶標，分別為乙酰膽堿酯酶(ACHE)、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運蛋白(SLC6A4)、胺氧化酶[含黃素]A(MAOA)、鈉依賴性多巴胺轉(zhuǎn)運體(SLC6A3)、α-2A腎上腺素能受體(ADRA2A)、胺氧化酶[含黃素]B(MAOB)，這其中的大多數(shù)靶標與鎮(zhèn)靜催眠關系密切。其中，ACHE是一種絲氨酸蛋白酶，可將神經(jīng)遞質(zhì)、乙酰膽堿水解為乙酸鹽和膽堿，從而終止神經(jīng)傳遞。Leung等[20]指出海馬體中乙酰膽堿酯酶的喪失，證實了中隔的病變，表明海馬中膽堿能傳入物質(zhì)的消耗在誘導和出現(xiàn)過程中均增加了對揮發(fā)性和可注射全身麻醉劑的催眠，固定和鎮(zhèn)痛作用。SLC6A4為血清素轉(zhuǎn)運蛋白，通過調(diào)節(jié)血清素能信號影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通常負責5-羥色胺(5-HT)再攝取，5-HT信號傳導中斷就會導致抑郁癥，Lam等[21]認為SLC6A4的DNA甲基化與晚期抑郁癥之間的基因型相關聯(lián)。目前有很多抗抑郁藥具有鎮(zhèn)靜安定作用，如氟西汀、舍曲林。因此我們推斷SLC6A4可能具有鎮(zhèn)靜作用從而治療失眠。ADRA2A屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，介導低血壓、鎮(zhèn)靜催眠、麻醉等多種生理效應[22]，ADRA2A的基因多態(tài)性可以通過促進miR-34a與ADRA2A的結合從而影響患者的睡眠質(zhì)量[23]。

KEGG富集結果表明，“酸棗仁-當歸”藥對治療失眠可能與神經(jīng)活性配體-受體相互作用，鈣信號通路，5-HT能通路，多巴胺能突觸，心肌細胞的腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導，膽堿能突觸等通路有關。據(jù)調(diào)查[24]，神經(jīng)活性配體-受體相互作用為首選治療通路，促進覺醒/抑制睡眠的物質(zhì)(如：兒茶酚胺)和促進睡眠/抑制覺醒的物質(zhì)(如：5-HT、褪黑素)等皆由此通路發(fā)揮作用；研究表明，下丘腦中5-HT和多巴胺為調(diào)節(jié)睡眠-覺醒的重要神經(jīng)遞質(zhì)[25]，5-HT又名血清素，腦內(nèi)5-HT水平的降低，不僅會導致失眠、焦慮、抑郁等疾病，還會影響其他神經(jīng)遞質(zhì)活動。GO富集結果表明，調(diào)節(jié)突觸后膜電位的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、腎上腺素能受體結合、突觸膜的整體成分、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路起到了重要的作用。綜上，我們得出了“酸棗仁-當歸”藥對治療失眠的可能機制。我們推測，“酸棗仁-當歸”藥對可能通過MAOB、ACHE、SLC6A4、ADRA2A等靶標通過調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、鈣信號通路，5-HT能信號通路來起到多信號通路共同影響其治療失眠的作用，多信號通路和多靶標的共同作用體現(xiàn)了中藥治療疾病過程中作用復雜，綜合調(diào)理的特點。

本文旨在通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接等方法進行靶標預測和初步探討“酸棗仁-當歸”藥對治療失眠的幾種潛在機制，體現(xiàn)了中藥通過多成分、多靶點、多途徑治療疾病的特點，并未對具體的信號通路進行進一步深入的探索，通路的具體調(diào)控過程有待實驗研究進一步驗證。