植物內(nèi)生真菌Talaromyces sp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

李思瑤 張楊 車永勝

(1 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所，北京 100050)

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指一類在寄主植物的健康器官或組織內(nèi)度過(guò)全部或部分生命周期，而通常不使寄主表現(xiàn)出明顯感染癥狀的真菌，該類真菌可能存在于植物的各種組織器官如根、莖、葉、花、果實(shí)或種子中[1-2]。植物內(nèi)生真菌既是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是一類非常重要的微生物資源。目前，從植物內(nèi)生真菌發(fā)酵物中分離得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型包括聚酮、萜類、肽類和生物堿等，部分化合物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等生物活性[3-4]。植物內(nèi)生真菌既能夠獨(dú)立產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，又能夠參與宿主植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，或?qū)ζ溥M(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，是活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源之一[5-6]。來(lái)源于植物內(nèi)生真菌的活性天然產(chǎn)物在生物制藥[3-4,7]、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和工業(yè)發(fā)酵等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。

籃狀菌(Talaromycessp.)廣泛分布于植物、土壤和海洋生物如海綿中[9]，籃狀菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類豐富，部分化合物具有較好的生物活性。從該屬真菌中分離得到蒽醌[10]、吲哚生物堿[11]和萜類[12-14]等不同結(jié)構(gòu)類型的化合物。本研究選取一株采集自南京市郊青檀葉片上的內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，通過(guò)形態(tài)觀察和ITS序列分析，該菌株被鑒定為Talaromycessp.。采用稻米培養(yǎng)基發(fā)酵，乙酸乙酯提取獲得提取物，采用多種色譜分離方法，從發(fā)酵提取物中分離得到11個(gè)化合物(化合物1～11)，通過(guò)對(duì)比核磁、質(zhì)譜等數(shù)據(jù)，化合物1～11的結(jié)構(gòu)鑒定為：1-deoxyrubralactone(1)[15]、alternariol(2)[16]、alternariol 4-methyl(3)[17]、altenuisol(4)[18]、3-hydroxyalternariol-5-O-methyl ether(5)[19]、(2'R,4'R,5'R)-altenuene(6)[20]、(2'S,4'R,5'R)-isoaltenuene(7)[20]、(2'R,4'R,5'R)-altenuene-2-acetoxyester(8)[21]、7-hydroxy-3,5-dimethyl-isochromen-1-one(9)[22]、騰毒素(10)[23]和二氫騰毒素(11)[23]，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1～11

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)；LX-200小型離心機(jī)(北京佳航博創(chuàng)科技有限公司)；AL-204萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；600 MHz核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian Mercury公司)；Agilent 6500高分辨質(zhì)譜(美國(guó)Agilent公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；LC-6AD島津高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；JASCO-J-815圓二色光譜儀(日本Jasco公司)；RP-C18色譜柱4.6 mm×150 mm(美國(guó)Agilent公司)；Agilent Zorbax SB-C18column半制備色譜柱10.0 mm× 250 mm(美國(guó)Agilent公司)；Kromasil 100-5-C18column 色譜柱10.0 mm×250 mm(瑞典Akzo Nobel公司)；Combi Flash?Rf+中壓制備色譜儀(美國(guó)Teledyne ISCO公司)；超低溫冰箱(日本Sanyo公司)。

試劑：甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、無(wú)水甲醇(AR)和甲酸(AR)為研究院試劑庫(kù)領(lǐng)??；氘代試劑購(gòu)自北京百靈威公司；丙酮(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；薄層層析硅膠購(gòu)自新諾有限公司；酵母提取物購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；麥芽糖購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；瓊脂購(gòu)自北京微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 菌株發(fā)酵

1.2.1 菌株

植物內(nèi)生真菌T.sp.(組內(nèi)編號(hào)RCN134)由南京師范大學(xué)陳雙林教授提供，于2006年10月采集自江蘇省南京市郊的青檀葉片，菌株保存于中國(guó)科學(xué)院微生物所普通微生物保存中心，ITS基因序列已提交NCBI基因庫(kù)(Genbank Accession No.ON261385)。

1.2.2 菌株發(fā)酵

種子液配制：將菌種涂布于PDA平板上，在平板上生長(zhǎng)5～7 d。待平板上長(zhǎng)滿一定量的菌落后，將連同培養(yǎng)基在內(nèi)的4個(gè)1 cm2大小的菌塊接種到500 mL 的錐形瓶中(內(nèi)含200 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基)。種子液的配方為葡萄糖4.0 g、麥芽汁10.0 g、酵母提取物 4.0 g、蒸餾水1 L，按配方混合并攪拌均勻，將培養(yǎng)液pH值調(diào)至6.5，封口，在121℃滅菌30 min后冷卻備用。將接種完成的錐形瓶置于搖床上培養(yǎng)5 d后(培養(yǎng)溫度：25℃；轉(zhuǎn)速：200 r/min)，用無(wú)菌水將種子培養(yǎng)液稀釋至濃度約1×106個(gè)/mL的菌懸液。

固體培養(yǎng)基配制：將80 g大米和120 mL蒸餾水加入到500 mL錐形瓶中，封口膜封口，待大米被蒸餾水浸泡24 h后，在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌25 min。待固體培養(yǎng)基冷卻后，量取5 mL菌懸液接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，接種40瓶，室溫培養(yǎng)40 d。

1.3 提取與分離

稻米培養(yǎng)基發(fā)酵40 d后，加入乙酸乙酯(350 mL× 40瓶)浸泡24 h并攪拌均勻，重復(fù)4次，合并提取液，減壓蒸干溶劑得到粗提取物20.8 g，粗提物以1:1的比例拌100～200目硅膠拌樣，石油醚/乙酸乙酯/甲醇體系梯度洗脫(每個(gè)梯度800 mL)。

組分3(石油醚:乙酸乙酯=4:1洗脫，1400 mg)經(jīng)中壓反相柱色譜分離(25%～100%甲醇-水，梯度洗脫)。其中組分3.1(25%甲醇-水洗脫，500 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(48%乙腈-水50 min；2 mL/min)制備得到化合物9(2.1 mg；tR49.0 min)。組分3.2(30%甲醇-水洗脫，500 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(51%乙腈-水75 min；2 mL/min)制備得到化合物1(1.8 mg；tR40.0 min)和化合物2(7.3 mg；tR59.0 min)；組分3.3(40%甲醇-水，70 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(29%乙腈-水100 min；2 mL/min)制備得到化合物5(3.5 mg;tR95.0 min)；組分3.4(55%甲醇-水，50 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(72%甲醇-水37.5 min；2 mL/min)制備得到化合物3(7.1 mg，tR34.5 min)。

組分4(石油醚:乙酸乙酯=5:2洗脫，1000 mg)經(jīng)中壓反相柱色譜分離(30%-100%甲醇-水，梯度洗脫)。其中組分4.2(40%甲醇-水，130 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(32%乙腈-水90 min；2 mL/min)制備得到化合物8(2.1 mg，tR84.0 min)和化合物4(1.1 mg，tR74.0 min)。

組分6(石油醚:乙酸乙酯=3:7洗脫，700 mg)經(jīng)中壓反相柱色譜分離(30%-100%甲醇-水，梯度洗脫)。其中組分6.1(30%甲醇-水，250 mg)用半制備高效液相色譜(25%乙腈-水40 min；2 mL/min)制備得到化合物6(2.0 mg，tR35.0 min)和化合物7(3.3 mg，tR33.5 min)。

組分7(石油醚:乙酸乙酯=0:1洗脫，500 mg)經(jīng)中壓反相柱色譜分離(40%～100%甲醇-水，梯度洗脫)。其中組分7.2(50%甲醇-水，50 mg)用半制備高效液相色譜(28%乙腈-水110.0 min；2 mL/min)制備得到化合物10(17.6 mg，tR90.0 min)和化合物11(5.3 mg，tR100.0 min)。

1.4 活性測(cè)試

1.4.1 供試品的配置

配制樣品初始濃度為10 mg/mL二甲基亞砜溶液作為母液，用時(shí)將母液用PBS緩沖液稀釋不同倍數(shù)。

1.4.2 MTT法

96孔板中接入細(xì)胞密度約為104/孔，培養(yǎng)24 h后并除去培養(yǎng)液，然后加入樣品溶液(溶液為含有0.2%二甲基亞砜的50 μL培養(yǎng)基溶液或合適濃度的化合物樣品溶液(0.1～100 μmol/L)。37℃下連續(xù)孵育4 h，避光條件下將原培養(yǎng)基更換為DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h。以無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS培養(yǎng)基溶解MTT，調(diào)整MTT濃度為0.5 mg/mL，96孔板中加入50 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育3 h。去除MTT培養(yǎng)基后，每孔加入100 μL二甲基亞砜溶液，設(shè)定轉(zhuǎn)速為60 r/min，震蕩 5 min使沉淀溶解并除去氣泡。采用酶標(biāo)儀測(cè)定 540 nm下的吸光度值，重復(fù)3次。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組吸收值A(chǔ)/對(duì)照組吸收值A(chǔ))×100%。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末；E S I-M Sm/z：261.1[M+H]+；1H NMR(600 MHz，acetone-d6)δH:11.32(1H，s，6-OH)，6.93(1H，d，J=2.3 Hz，H-9)，6.77(1H，d，J=2.3 Hz，H-7)，4.02(3H，s，8-OCH3)，3.60(1H，pd，J=6.9，1.3 Hz，H-1)，2.95(1H，dd，J=18.8，6.5 Hz，H-2)，2.26(1H，dd，J=18.8，1.3 Hz，H-2)，1.47(3H，d，J=7.0 Hz，H-10)；13C NMR(150 MHz，acetone-d6)δC:195.7(C-3)，168.0(C-8)，166.1(C-6)，165.7(C-5)，149.1(C-3a)，145.3(C-10a)，136.1(C-9a)，104.0(C-7)，103.6(C-9)，102.7(C-5a)，56.7(8-OCH3)，43.3(C-2)，25.7(C-1)，21.0(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照基本一致，因此鑒定為1-deoxyrubralactone。

化合物2：淡黃色粉末；E S I-M Sm/z:259.1[M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δH：11.76(1H，s，3-OH)，7.23(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.71(1H，d，J=2.5 Hz，H-5')，6.63(1H，d，J=2.5 Hz，H-3')，6.35(1H，d，J=2.0 Hz，H-4)，2.70(3H，s，H-8)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δC：165.9(C-7)，164.7(C-5)，164.0(C-3)，158.4(C-4')，152.6(C-2')，138.3(C-6')，138.1(C-1)，117.5(C-5')，109.0(C-1')，104.5(C-6)，101.6(C-3')，100.9(C-4)，97.1(C-2)，25.2(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致，因此鑒定為alternariol。

化合物3：淡黃色粉末;E S I-M Sm/z：273.1[M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δH：7.23(1H，d，J=2.6 Hz，H-6)，6.73(1H，d，J=2.2 Hz，H-5')，6.65(1H，d，J=2.2 Hz，H-3')，6.63(1H，d，J=2.6 Hz，H-4)，3.91(3H，s，5-OCH3)，2.74(3H，s，H-8)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δC：166.2(C-7)，164.7(C-5)，164.1(C-3)，158.6(C-4')，152.6(C-2')，138.5(C-6')，137.8(C-1)，117.6(C-5')，108.8(C-1')，103.4(C-6)，101.6(C-3')，99.2(C-4)，98.5(C-2)，55.8(5-OCH3)，25.0(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照基本一致，因此鑒定為alternariol 5-methyl ether。

化合物4：褐色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：275.1[M+H]+；1H NMR(600 MHz，acetone-d6)δH：11.67(1H，s，3-OH)，7.56(1H，s，H-6')，7.05(1H，brs，H-4)，6.83(1H，s，H-3')，6.49(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，3.99(3H，s，5-OCH3)；13C NMR(150 MHz，acetone-d6)δC：168.0(C-7)，166.7(C-5)，165.4(C-3)，149.6(C-2')，145.9(C-4')，144.3(C-5')，138.6(C-1)，110.8(C-6')，109.4(C-1')，104.3(C-3')，100.7(C-4)，99.8(C-2)，98.8(C-6)，56.3(5-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]對(duì)照基本一致，因此鑒定為altenuisol。

化合物5：黃色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：289.1[M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δH：11.91(1H，s，3-OH)，7.24(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.73(1H，s，H-5')，6.63(1H，d，J=2.2 Hz，H-4)，3.91(3H，s，5-OCH3)，2.66(3H，s，H-8)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δC：166.1(C-7)，164.6(C-5)，164.1(C-3)，147.0(C-4')，141.5(C-2')，138.4(C-1)，131.2(C-3')，126.4(C-6')，116.9(C-5')，109.1(C-1')，103.4(C-6)，99.2(C-4)，98.3(C-2)，55.8(5-OCH3)，24.5(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]對(duì)照基本一致，因此鑒定為3-hydroxyalternariol 5-O-methyl ether。

化合物6：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：293.1[M+H]+；[α]25D-3.0(c1.0，MeOH)；CD(c1×10-3mol/L，MeOH)λmaxnm(Δε)：237(+2.7)，280(-1.0)，325(-0.1)。1H NMR(600 MHz，acetone-d6)δH：11.44(1H，s，3-OH)，6.71(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.46(1H，d，J=2.4 Hz，H-4)，6.31(1H，d，J=2.9 Hz，H-6')，4.12(1H，dd，J=5.5，2.9 Hz，H-5')，3.92(3H，s，5-OCH3)，3.85(1H，ddd，J=8.9，5.5，3.8 Hz，H-4')，2.40(1H，dd，J=14.3，3.7 Hz，He-3')，2.01(1H，dd，J=14.3，8.9 Hz，Ha-3')，1.53(3H，s，H-8)；13C NMR(150 MHz，acetone-d6)δC:169.6(C-7)，167.2(C-5)，164.8(C-3)，140.4(C-1)，133.7(C-1')，131.6(C-6')，103.1(C-6)，101.5(C-4)，101.4(C-2)，82.0(C-2')，71.9(C-5')，70.5(C-4')，56.2(5-OCH3)，40.3(C-3')，28.0(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對(duì)照基本一致，通過(guò)與文獻(xiàn)的CD數(shù)據(jù)［(c1.7 mmol/L，MeOH)λmaxnm(Δε):231(+25.2)，278(-17.2)，321(-2.0)］比對(duì)，數(shù)據(jù)基本一致，因此鑒定其為(2'R,4'R,5'R)-altenuene。

化合物7：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：293.1[M+H]+；[α]25D+14.00(c1.0，MeOH)；CD(c1× 10-3M，MeOH)λmaxnm(Δε):237(-1.1)，280(+1.7)，325(+0.2)。1H NMR(600 MHz，acetone-d6)δH：11.47(1H，s，3-OH)，6.70(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.47(1H，d，J=2.3 Hz，H-4)，6.25(1H，d，J=2.4 Hz，H-6')，4.26(1H，dd，J=7.9，2.4 Hz，H-5')，3.92(3H，s，5-OCH3)，3.78(1H，ddd，J=12.7，7.9，3.7 Hz，H-4')，2.27(1H，m，He-3')，2.09(1H，brs，Ha-3')，1.56(3H，s，H-8)；13C NMR(150 MHz，acetone-d6)δC:169.0(C-7)，167.2(C-5)，165.0(C-3)，138.9(C-1)，133.0(C-1')，131.1(C-6')，103.0(C-6)，101.8(C-4)，101.1(C-2)，83.1(C-2')，74.2(C-5')，71.9(C-4')，56.3(5-OCH3)，44.3(C-3')，26.8(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對(duì)照基本一致，通過(guò)與文獻(xiàn)的CD數(shù)據(jù)［(c3.4 mmol/L，MeOH)λmaxnm(Δε)：231(-4.9)，278(+3.2)，321(+0.5)］比對(duì)，數(shù)據(jù)基本一致，因此鑒定為(2'S,4'R,5'R)-isoaltenuene。

化合物8：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：335.1[M+H]+；[α]25D-25.0(c1.0，MeOH)；CD(c1× 10-3M，MeOH)λmaxnm(Δε):237(+2.7)，280(-1.0)，325(-0.1)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δH：11.29(1H，s，3-OH)，6.53(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.46(1H，d，J=2.3 Hz，H-4)，6.04(1H，d，J=2.7 Hz，H-6')，5.24(1H，dd，J=5.9，2.7 Hz，H-5')，4.10(1H，m，H-4')，3.86(3H，s，5-OCH3)，2.56(1H，dd，J=14.6，4.1 Hz，Ha-3')，2.14(3H，s，H-10)，2.08(1H，dd，J=14.6，8.9 Hz，He-3')，1.56(3H，s，H-8)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δC：171.0(C-9)，168.5(C-7)，166.2(C-5)，164.2(C-3)，138.3(C-1)，136.1(C-1')，124.6(C-6')，103.1(C-6)，101.2(C-4)，100.5(C-2)，80.5(C-2')，73.8(C-5')，67.4(C-4')，55.8(5-OCH3)，39.6(C-3')，27.9(C-8)，21.1(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]對(duì)照，比對(duì)化合物8與化合物6的CD數(shù)據(jù)，二者基本一致，因此化合物8鑒定為(2'R,4'R,5'R)-altenuene-5'-acetoxyester。

化合物9：白色粉末；E S I-M Sm/z：191.1[M+H]+；1H NMR(600 MHz，methanol-d4)δH:6.64(1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.63(1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，6.00(1H，s，H-4)，2.71(3H，s，H-10)，2.32(3H，s，H-9)；13C NMR(150 MHz，methanol-d4)δC：182.0(C-1)，166.6(C-3)，163.2(C-8a)，161.5(C-7)，143.6(C-5)，118.0(C-6)，115.6(C-4a)，111.4(C-4)，101.7(C-8)，23.1(C-10)，19.8(C-9)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]對(duì)照基本一致，因此鑒定為7-hydroxy-3,5-dimethyl-isochromen-1-one。

化合物10：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：415.2[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δH:7.74(1H，s，H-20)，7.41(5H，brs，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6')，5.19(1H，d，J=12.8 Hz，H-9)，4.36(1H，s，H-6)，4.20(1H，brs，H-3)，3.58(1H，d，J=12.8 Hz，H-9)，3.19(3H，s，H-13)，2.81(3H，s，H-19)，1.66(1H，m，H-14)，1.53(3H，d，J=7.1 Hz，H-18)，1.30(1H，m，H-15)，1.25(1H-s-H-14)-0.63(3H，d，J=6.4 Hz，H-16)，0.52(3H，s，H-17)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δC：171.5(C-2)，171.5(C-8)，170.1(C-5)，164.6(C-11)，136.9(C-20)，133.0(C-1')，131.9(C-12)，130.8(C-4')，129.7(C-2'，C-6')，129.4(C-3'，C-5')，56.9(C-6)，49.9(C-3)，44.5(C-9)，40.7(C-14)，35.4(C-13)，30.2(C-19)，24.6(C-15)，22.3(C-16)，22.1(C-17)，15.6(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]對(duì)照基本一致，因此鑒定為騰毒素。

化合物11：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z：417.2[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δH:7.73(1H，s，10-NH)，7.29(2H，d，J=7.5 Hz，H-3'，H-5')，7.22(2H，m，H-2'，H-6')，7.20(1H，m，H-4')，4.92(1H，t，J=14.7 Hz，H-9)，4.61(1H，dd，J=11.3，3.5 Hz，H-3)，4.26(1H，d，J=8.3 Hz，H-6)，3.68(1H，d，J=14.8 Hz，H-20)，3.50(1H，d，J=14.7 Hz，H-9)，2.87(1H，m，H-20)，2.83(3H，s，H-13)，2.77(3H，s，H-19)，1.67(1H，dt，J=13.8，6.7 Hz，H-14)，1.54(3H，d，J=6.5 Hz，H-18)，1.38(1H，m，H-15)，1.24(1H，m，H-14)，0.82(3H，d，J=6.5 Hz，H-16)，0.76(3H，d，J=6.5 Hz，H-17)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δC：172.2(C-2)，171.6(C-8)，170.6(C-5)，170.1(C-11)，137.0(C-1')，129.0(C-3'，C-5')，128.2(C-2'，C-6')，127.1(C-4')，62.9(C-12)，57.3(C-6)，48.4(C-3)，44.5(C-9)，41.0(C-14)，34.3(C-20)，30.6(C-13)，30.1(C-19)，24.5(C-15)，22.6(C-16)，22.3(C-17)，15.6(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]對(duì)照基本一致，因此鑒定為二氫騰毒素。

2.2 化合物生物活性測(cè)試

采用MTT法評(píng)價(jià)化合物對(duì)SKBR3(人乳腺癌細(xì)胞株)、A549(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株)，J82(人膀胱癌細(xì)胞株)和Huh7(人肝癌細(xì)胞株)4種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性?；衔?～11及陽(yáng)性對(duì)照順鉑在100 μmol/L和10 μmol/L濃度下對(duì)4種細(xì)胞的抑制率見(jiàn)表1，在100 μmol/L的濃度下，化合物2和3對(duì)J82細(xì)胞具有一定抑制活性，抑制率分別為56.9%和59.7%；其中化合物3對(duì)SKBR3及J82細(xì)胞的IC50值分別為62.0和83.1 μmol/L； 陽(yáng)性對(duì)照順鉑對(duì)四株細(xì)胞的IC50值分別為3.7、6.6、0.6和5.1 μmol/L。評(píng)價(jià)結(jié)果表明，化合物1～11對(duì)所選4種細(xì)胞的細(xì)胞毒活性較弱。

表1 化合物1～11在100和10 μmol/L濃度下對(duì)四種細(xì)胞株的抑制率Table 1 Inhibition rates of compounds 1～11 against four cell lines at 100 and 10 μmol/L

3 結(jié)論

青檀Pterocelti tatarinowii為我國(guó)特有的單種屬第三紀(jì)孑遺植物，作為一種古老的植物，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，與其內(nèi)生菌群形成了穩(wěn)定的適應(yīng)關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)來(lái)自不同采集地的青檀枝條、葉片內(nèi)生真菌菌群的多樣性研究結(jié)果表明，擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis和交鏈孢屬Alternaria真菌為青檀內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌群[24-25]。

本研究對(duì)青檀葉片內(nèi)生真菌T.sp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物開(kāi)展研究，分離得到11個(gè)化合物，通過(guò)核磁、質(zhì)譜以及CD數(shù)據(jù)對(duì)比，確定了11個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

化合物1為聚酮類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道該化合物為DNA聚合酶抑制劑，對(duì)大鼠DNA聚合酶β和人DNA聚合酶κ的IC50值分別為11.9和59.8 μmol/L[15]。

化合物2～8屬于交鏈孢酚類化合物，結(jié)構(gòu)上的區(qū)別主要在于6H-benzo[c]chromen-6-one母核上取代基種類、位置和芳環(huán)部分氫化程度不同。文獻(xiàn)報(bào)道，化合物2在10 μg/mL濃度下對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞株L5178Y的抑制率為11.8%[16]；化合物3由紅樹林內(nèi)生真菌No.2240中分離得到，對(duì)人口腔上皮癌細(xì)胞株KB及其多藥耐藥細(xì)胞株KBv200的IC50值分別為4.82 和4.94 μg/mL[17]；化合物4從植物病原菌Alternariasp.中分離得到，為一種植物毒素[18]；化合物5由蓼屬藥用植物Polygonum senegalense的內(nèi)生真菌Alternariasp.中分離得到，對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y的IC50值為7.8 μg/mL，并且對(duì)ARK5等多種腫瘤相關(guān)蛋白激酶具有抑制作用[19]；化合物6和7為立體異構(gòu)體，由地衣內(nèi)生真菌Nigrosporasp.中分離得到[20]；化合物8由植物內(nèi)生真菌Alternaria alternata中分離得到，為化合物7的5'羥基乙?；苌?，對(duì)葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 25923)和白色念珠菌(Candida albicansATCC 24433)的MIC80值分別為15.4和48.8 μg/mL[21]；化合物9由植物內(nèi)生真菌Ulocladiumsp.中分離得到，對(duì)白念珠菌(Candida albicansSC 5314)的IC50值為97.93 μmol/L[22]。

化合物10和11屬于環(huán)肽類化合物，由L-亮氨酸，L-苯丙氨酸，甘氨酸和L-丙氨酸縮合形成，文獻(xiàn)報(bào)道騰毒素(10)是由鏈格孢霉產(chǎn)生的一種霉菌毒素，能夠通過(guò)降低植物細(xì)胞內(nèi)ATP酶活性抑制光合磷酸化[26]。

目前已從Talaromyces屬真菌中分離得到200余種次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括萜類、甾體、聚酮、異香豆素、醌類、生物堿和肽類等多種結(jié)構(gòu)類型[9]。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果表明，未見(jiàn)化合物1、化合物3～11從Talaromyces屬菌株中分離的報(bào)道。本研究初步闡明了青檀葉片內(nèi)生真菌T.sp.的化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究青檀葉片內(nèi)生真菌與宿主植物的相互作用及其生態(tài)學(xué)意義奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝南京師范大學(xué)陳雙林教授為本研究提供菌株。