定坤丹對(duì)宮腔粘連大鼠血管生成及PI3K/AKT/mTOR通路的影響研究

劉超萍 李 姣

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，長(zhǎng)沙，410007)

宮頸粘連(Intrauterine Adhesion，IUA)多由刮宮術(shù)后子宮內(nèi)膜損傷引起，以子宮內(nèi)膜粘連、子宮腔部分或完全閉塞、下腹部周期性疼痛、月經(jīng)減少、不孕等為主要表現(xiàn)，為婦產(chǎn)科常見疾病之一[1]。研究表明，約有40%的不孕病例和7%的繼發(fā)性閉經(jīng)病例與IUA相關(guān)[2]。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要包括子宮內(nèi)膜干細(xì)胞損傷、局部神經(jīng)痙攣、纖維細(xì)胞增殖及新生血管形成等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)信號(hào)通路能夠參與子宮內(nèi)膜血管新生過程，與IUA的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，通過干預(yù)PI3K/AKT/mTOR通路能夠有效抑制IUA大鼠子宮內(nèi)膜的增生[3-4]。定坤丹為治療經(jīng)血不調(diào)的名方，具有補(bǔ)腎養(yǎng)血，調(diào)經(jīng)止痛之功效。臨床研究證明，其用于IUA患者具有良好療效，能夠顯著改善患者癥狀，減輕子宮腔粘連及子宮內(nèi)膜增生，然而其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚未明晰[5]。本研究通過機(jī)械刮宮結(jié)合脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)感染建立IUA大鼠模型，觀察不同劑量定坤丹治療大鼠IUA的效果，并探討其調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制IUA內(nèi)膜血管生成及炎癥反應(yīng)，恢復(fù)子宮形態(tài)的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)SD大鼠60只，雌性，體質(zhì)量180～200 g，由湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(湘)2020-0015。于我院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，室內(nèi)保持20～22 ℃，明暗交替各12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：20210412)。

1.1.2 藥物 脂多糖(Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：L2880)；定坤丹(山西廣譽(yù)國(guó)藥有限公司，批號(hào)：20210308)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：108492)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin,IL-6)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號(hào)：20210521、20210614、20210523)；VEGF抗體試劑盒(武漢博士德公司，批號(hào)：MK1165)；PI3K、AKT、mTOR一抗(Abcam公司，美國(guó)，批號(hào)：ab83091，ab35200，ab88204)；逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)引物(上海生工生物工程有限公司，貨號(hào)：S0214)。組織切片機(jī)(Leica公司，德國(guó)，型號(hào)：RM 2135)；光學(xué)倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本，型號(hào)：BX51)；低溫高速離心機(jī)(Sigma公司，美國(guó)，型號(hào)：2K15)；多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士，型號(hào)：GENIOSPLOS)；電泳儀(Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：Mini-protean)，RT-PCR儀(Eppenndorf Centrifuge公司，德國(guó)，型號(hào)：7500)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 稱取SD大鼠體質(zhì)量并按體質(zhì)量進(jìn)行分層，隨后取各層內(nèi)大鼠，隨機(jī)方法分為6組：空白組、模型組、戊酸雌二醇組、定坤丹低劑量組、定坤丹中劑量組、定坤丹高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組采用機(jī)械刮宮+LPS感染雙重?fù)p傷法建立IUA模型[6]：大鼠給予腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后，無菌條件下切開下腹，暴露子宮，于子宮上方約1/3處作3 mm縱切口，采用宮腔刮勺經(jīng)切口沿大鼠宮腔全層行刮宮術(shù)，至宮腔肌壁出現(xiàn)粗糙感時(shí)停止搔刮；將無菌手術(shù)線提前置于6 mg/L的LPS生理鹽水中，4 ℃浸泡24 h備用，于刮宮損傷后，將LPS手術(shù)線放入損傷宮腔，在腹壁留置約0.5 cm的尾絲以便隨后取出，生理鹽水沖洗并縫合切口，48 h后開腹，輕拉尾絲取出LPS棉線，生理鹽水沖洗并關(guān)腹，9 d后肉眼可見大鼠子宮色蒼白，宮腔狹窄，子宮四壁厚薄不均，病理可見宮腔狹窄，內(nèi)膜粘連，腺體減少，組織纖維化增生，子宮內(nèi)膜組織纖維化面積比明顯增加，即為IUA造模成功[7]。

1.2.2 給藥方法 各給藥組于造模術(shù)后第1天開始灌胃給藥治療，戊酸雌二醇組予以0.3 mg/kg灌胃干預(yù)，定坤丹低劑量組、中劑量組、高劑量組根據(jù)臨床人用劑量折算出大鼠等效劑量的1、2和4倍分別給予定坤丹混懸液(2.13、4.26、8.52 g/kg)灌胃治療，1次/d，持續(xù)給藥28 d。空白組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃處理。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色觀察子宮組織病理形態(tài) 各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后處死，解剖后取部分子宮組織，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入梯度乙醇中浸泡脫水，置于透明劑二甲苯中透明，經(jīng)石蠟液包埋后冷卻凝固，切片機(jī)作5 μm厚切片。切片于恒溫箱中烘干，采用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織形態(tài)并拍照。

1.2.3.2 Masson染色觀察子宮組織纖維化面積 大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后處死，解剖后取部分子宮組織，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入梯度乙醇中浸泡脫水，置于透明劑二甲苯中透明，經(jīng)石蠟液包埋后冷卻凝固，切片機(jī)作5 μm厚切片，行Masson染色，于高倍鏡(×200)下選取6個(gè)視野，采用Image-Pro Plus軟件計(jì)算組織纖維化面積比，纖維化面積比=纖維化面積/視野總面×100%[8]。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中VEGF、IL-6、IL-8水平 大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，血液于離心半徑13.5 cm，3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min以分離血清，將血清樣品分裝并凍存于-20 ℃冰箱備用。臨用前將血清置于常溫下平衡1 h，3 000 r/min(離心半徑13.5 cm)，離心15 min，樣品孔加入血清樣品10 μL，樣品稀釋液40 μL和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體100 μL，同時(shí)做空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔，37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗板6次，各孔加入顯色液100 μL，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品孔OD值計(jì)算各樣本VEGF、IL-6、IL-8的表達(dá)水平。

1.2.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜VEGF蛋白表達(dá) 取大鼠部分子宮組織置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟液包埋后作5 μm切片，經(jīng)脫蠟、透明和脫水后，切片滴加30%過氧化氫(H2O2)孵育20 min，枸櫞酸鈉抗原熱修復(fù)15 min，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封閉20 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃恒溫箱孵育20 min，鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(Streptavidin-biotin-peroxidase Complex method，SABC法)37 ℃恒溫箱孵育20 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色，中性樹膠封片，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件分析平均光密度值(MOD值)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達(dá) 取大鼠部分子宮組織，冰上快速勻漿后，加入放射免疫沉淀分析裂解緩沖液(Radio-Immunoprecipitation Assay Buffer,RIPA buffer)，4 ℃，12 000 r/min(離心半徑8 cm)離心20 min提取總蛋白，取少量上清二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品調(diào)至等濃度，加入10 μL樣品，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠電泳分離，冰上轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，加入二抗，室溫孵育2 h，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(Enhanced Chemiluminescence,ECL)，凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

1.2.7 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表達(dá) 取大鼠部分子宮組織，用無菌剪將組織塊剪成碎塊，采用Trizol裂解液提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度，再將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃變性10 s，退火60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，2-△△Ct法分析相對(duì)mRNA表達(dá)量。具體引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮病理形態(tài)變化 光鏡下可見空白組大鼠子宮結(jié)構(gòu)清晰完整，子宮腔通暢，內(nèi)膜厚度正常，腺體量多；模型組正常宮腔結(jié)構(gòu)消失，子宮腔變小變窄，腺體數(shù)量減少；與模型組比較，定坤丹各劑量組大鼠子宮結(jié)構(gòu)均有不同程度改善，隨給藥濃度的增加，大鼠腺體數(shù)量逐漸增多，子宮腔逐漸通暢。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)變化(HE染色，×50)

2.2 各組大鼠子宮纖維化面積 Masson染色顯示，與空白組比較，模型組大鼠子宮組織纖維化面積比明顯升高(P<0.01)；定坤丹各劑量組治療后，大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比隨給藥濃度的增加逐漸降低(P<0.05，P<0.01)。見圖2～3。

圖2 各組大鼠子宮組織纖維化情況(Masson染色，×200)

2.3 各組大鼠血清VEGF、IL-6、IL-8表達(dá)水平 與空白組比較，模型組大鼠血清中VEGF、IL-6、IL-8水平均有顯著升高(P<0.01)；戊酸雌二醇及定坤丹各劑量組血清VEGF、IL-6、IL-8的水平較模型組均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且定坤丹低劑量、中劑量、高劑量組之間呈劑量依賴性，以高劑量組改善作用最明顯。見表2。

表2 大鼠血清中VEGF、IL-6、IL-8的水平

圖3 各組大鼠子宮組織纖維化情況比較

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá) 免疫組化可見VEGF的陽(yáng)性表達(dá)位于胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色，胞核呈藍(lán)染。空白組大鼠子宮內(nèi)膜僅見少量VEGF陽(yáng)性表達(dá)，模型組VEGF陽(yáng)性表達(dá)較空白組明顯增多，呈強(qiáng)陽(yáng)性(P<0.01)；與模型組比較，定坤丹各劑量組VEGF表達(dá)均有不同程度的減少(P<0.05，P<0.01)，以定坤丹高劑量組最為明顯。見圖4～5。

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)(IHC染色，×200)

2.5 各組大鼠子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達(dá) 與空白組比較，各組大鼠AKT、mTOR的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)較空白組顯著升高(P<0.01)；定坤丹各劑量組劑量依賴地降低了大鼠子宮組織PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。見圖6～7。

圖5 各組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)比較

圖6 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達(dá)

圖7 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達(dá)比較

2.6 各組大鼠子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路的mRNA表達(dá) 與空白組比較，模型組大鼠子宮組織中PI3K、p-AKT、p-mTOR的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)定坤丹不同劑量治療后，大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的mRNA表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且效果具有劑量依賴型。見表3。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表達(dá)

3 討論

IUA是由刮宮術(shù)、子宮內(nèi)膜感染、創(chuàng)傷等因素導(dǎo)致的以宮腔粘連閉塞為主要表現(xiàn)的常見并發(fā)癥。近年來，隨著人工流產(chǎn)率的不斷升高，IUA患病率也逐年攀升，由此引起的月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)、周期性下腹疼痛、反復(fù)流產(chǎn)等一系列內(nèi)分泌及生殖問題嚴(yán)重影響著患者的生殖健康[1-2]。目前臨床針對(duì)IUA的治療手段主要包括應(yīng)用雌激素制劑結(jié)合宮腔鏡粘連松解術(shù)，以及術(shù)后放置宮內(nèi)節(jié)育器等方法輔助宮腔隔離，這些療法雖然對(duì)部分患者具有良好療效，但復(fù)發(fā)率較高，中度和重度IUA患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)23%和62%，宮內(nèi)節(jié)育器的放置也會(huì)阻礙子宮內(nèi)膜再生，引起宮內(nèi)感染和再次粘連等問題[9]。

中醫(yī)學(xué)中并無“IUA”相應(yīng)病名記載，根據(jù)其癥狀表現(xiàn)可將其囊括于“婦人腹痛”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇。認(rèn)為其病屬本虛標(biāo)實(shí)，以金器所傷，胞脈受損，瘀血內(nèi)停為其標(biāo)，腎精耗傷，沖任虧損，血海不足為其本，腎虛兼血瘀為其病機(jī)關(guān)鍵，故治療當(dāng)以益精補(bǔ)腎，化瘀活血為原則。定坤丹為清代治療經(jīng)血不調(diào)的名方，有補(bǔ)腎養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之效。方中以人參、白術(shù)、茯苓、甘草“四君子”益氣補(bǔ)脾，鹿茸、杜仲、肉桂、鹿角霜補(bǔ)腎溫陽(yáng)，干姜溫經(jīng)通脈，當(dāng)歸、熟地黃、阿膠、枸杞子滋肝補(bǔ)腎，白芍、川芎行氣活血，五靈脂、三七、延胡索、雞血藤、紅花、牛膝化瘀活血，香附、柴胡、烏藥、砂仁、黃芩疏肝調(diào)經(jīng)，清熱解郁，諸藥合用，既滋補(bǔ)腎精、培補(bǔ)氣血，又行氣化滯，活血消瘀，使補(bǔ)血而不留滯，化瘀而不傷血，用于腎虛血瘀之IUA具有滿意療效。本實(shí)驗(yàn)中，IUA模型大鼠子宮組織壞死，腺體減少，組織纖維化增生，纖維化面積與空白組比較明顯增加，符合IUA特征，經(jīng)不同劑量定坤丹灌胃干預(yù)后，子宮內(nèi)膜損傷程度及纖維化面積比均有不同程度改善，提示定坤丹對(duì)刮宮損傷和LPS感染所致的IUA具有明顯療效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IUA的病理機(jī)制尚未完全明晰，多數(shù)研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜創(chuàng)傷所引起的炎癥及局部新生血管的形成在其發(fā)生與進(jìn)展中起到重要作用[10-11]。VEGF能夠與血管內(nèi)皮特異性結(jié)合，加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生[12]。在子宮內(nèi)膜出現(xiàn)感染和損傷后，局部缺血和炎癥環(huán)境可刺激VEGF的表達(dá)增多，引起新生血管形成和炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生和浸潤(rùn)[13-14]。IL-6是巨噬細(xì)胞釋放的一種多功能炎癥介質(zhì)，可參與機(jī)體局部炎癥反應(yīng)的形成，IL-8是一種重要的炎癥介質(zhì)，也是促血管生成因子[15-16]。在IUA發(fā)病過程中，受損子宮內(nèi)膜引起的炎癥反應(yīng)可引起IL-6和IL-8水平的升高，IL-6又可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)增多，增多的VEGF和IL-8可進(jìn)一步引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖和黏附，使細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，大量堆積于子宮內(nèi)膜，使之逐漸被結(jié)締組織取代，最終形成子宮內(nèi)膜纖維化，為IUA的發(fā)病提供條件[17]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)定坤丹不同劑量灌胃治療后，IUA大鼠血清中IL-6、IL-8和VEGF的水平均明顯降低，免疫組織化學(xué)顯示子宮組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)亦有顯著減少，提示定坤丹可通過抑制IL-6和IL-8炎癥介質(zhì)的釋放，降低VEGF的表達(dá)而抑制子宮內(nèi)膜新生血管形成，延緩IUA的進(jìn)展。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、凋亡、自噬與血管再生的重要途徑，與IUA的發(fā)病關(guān)系密切[18]。子宮內(nèi)膜在缺血缺氧狀態(tài)下，VEGF表達(dá)的增多能夠誘導(dǎo)PI3K活化，AKT發(fā)生磷酸化，加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，PI3K/AKT的激活又可促進(jìn)IL-8、VEGF等血管生成相關(guān)分子表達(dá)的增加，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，進(jìn)而形成新生血管[19-20]。研究顯示，通過抑制PI3K/AKT通路激活能夠有效抑制IUA大鼠子宮內(nèi)膜再生[4]。過度活化的PI3K/AKT進(jìn)一步激活下游的mTOR，使其發(fā)生磷酸化，磷酸化的mTOR可發(fā)揮其生物活性，促使VEGF過量表達(dá)和內(nèi)膜細(xì)胞的大量增殖[21]。本研究蛋白質(zhì)印跡法和反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果可見，定坤丹能夠顯著抑制IUA大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白及mRNA水平，說明定坤丹可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，發(fā)揮對(duì)IUA相關(guān)血管生成的抑制作用。

綜上所述，定坤丹能夠顯著減輕IUA大鼠子宮組織損傷和宮腔粘連，其中定坤丹高劑量組對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的改善更為明顯，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化水平，從而降低局部血管再生因子和炎癥介質(zhì)的分泌相關(guān)。