李汶航 張 睿 崔欣怡 唐佐青 油紅捷 楊 錚 付修文 馬 赟 劉文蘭
(1 首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院,北京,100069;2 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,100069,北京)
大量實驗研究證實,骨髓干細胞(Bone Marrow Stem Cells,BMSCs)具有治療肝纖維化的作用,其治療機制與抑制肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)活化有關[1-3]。文獻報道Rho三磷酸鳥苷酶(Rho GTPases)可參與多種生物學行為與功能,其中RhoA/ROCK1信號通路與HSCs活化相關,并參與肝纖維化的形成過程[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一貫煎可促進BMSCs募集到肝臟并發(fā)揮抗肝纖維化的作用,但具體的治療機制尚未探明。本實驗將進一步研究一貫煎聯(lián)合BMSCs通過調(diào)控RhoA/ROCK1通路治療肝纖維化的作用機制。
1.1 材料
1.1.1 動物 6周齡Sprague-Dawlay大鼠,雄性,體質(zhì)量(200±20)g,共72只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006,倫理號:AEEI-2015-123,飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級動物室。
1.1.2 藥物 一貫煎組成:北沙參9 g、麥冬9 g、當歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g,購自北京同仁堂藥店。
一貫煎凍干粉制備方法[5-6]:取適宜煎煮容器,加藥材量7倍的冷水浸泡1 h,煮沸20 min,濾出藥液。隨后藥渣添加3倍量的水煎煮,煮沸30 min,取前后2次濾液合并、濃縮。將藥液靜置過夜。加入無水乙醇至70%,待析出沉淀后,過濾,濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味,加入10%甘露醇,于-80 ℃條件下凍存4 h后放入冷凍干燥機凍干48 h以上,待水分全部凍干,研磨粉碎,放入-20 ℃冰箱保存,將所得的凍干粉稱重,計算出大鼠給藥劑量:高劑量為0.44 g/100 g、中劑量為0.22 g/100 g、低劑量為0.11 g/100 g。
1.1.3 試劑與儀器 秋水仙堿(Colchicine,西雙版納藥業(yè)有限責任公司,批號:200101);橄欖油(邁薩維諾特級初榨橄欖油,希臘,批號:67519);四氯化碳(CCl4,純度≥99.0%,上海易恩化學技術有限公司,批號:206848);PVDF膜(羅氏公司,德國,批號:03010040001);RIPA蛋白裂解液(蘭博利德,批號:1090121810)二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司,批號:010719190828);動物組織總RNA提取試劑盒(北京普洛麥格生物公司,批號:0000343931);SYBR Green Qpcr Master Mix(武漢賽維爾生物,批號:MPC2011005)??贵wRhoA(CST公司,美國,貨號:2117S);Rho相關激酶1(Rho-associated kinase 1,ROCK1)(CST公司,美國,貨號:4035S);α-SMA(CST公司,美國,貨號:19245S);膠原蛋白-1(Collagen I,COL-1)(CST公司,美國,貨號:91144S),GAPDH(CST公司,美國,貨號:5174S)。
電子天平(Sartorius公司,德國,型號:TE1502S);冷凍干燥機(CHRIST公司,德國,型號:ALPHA1-2Ldplus);正置熒光顯微鏡(Leica公司,德國,型號:DM4000B);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,型號:RE-5298A);全自動多功能酶標儀(Thermo公司,美國,型號:MULTISKAN MK3);電泳儀(BioRad公司,美國,型號:1659001);成像系統(tǒng)(Fujifilm株式會社,日本,型號:LAS3000);低溫離心機(Sigma公司,美國,型號:4-16S/4-16KS);分光光度計(Thermo公司,美國,型號:NANODROP 2000);PCR儀(BioRad公司,美國,型號:CFX96);全自動生化儀(日立公司,日本,型號:7600)。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為8組,即正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組、一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組,每組9只。肝纖維化模型構建:除正常對照組外,其余7組大鼠腹腔注射四氯化碳溶液(橄欖油、四氯化碳按1∶1配制),初始2周注射劑量為0.2 mL/100 g,2次/周;隨后2周調(diào)整劑量為0.1 mL/100 g,2次/周;最后2周調(diào)整劑量為0.05 mL/100 g,2次/周。正常對照組注射等量的橄欖油溶液。
BMSCs的分離、培養(yǎng):取6周齡雄性SD大鼠,脫頸處死,于超凈工作臺中取下肢長骨,用完全培養(yǎng)基多次沖洗骨髓腔,過濾。將所得細胞放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞濃度達到70%~80%后進行傳代。當傳至第4代時,消化、收集細胞、調(diào)整濃度為5×106個/L。
1.2.2 給藥方法 干細胞組、一貫煎+干細胞組大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL BMSCs;其他組注射等量生理鹽水。一貫煎高劑量組以一貫煎凍干粉[4.4 g/(kg·d)]灌胃治療,一貫煎中劑量組、一貫煎+干細胞組以一貫煎凍干粉[2.2 g/(kg·d)]灌胃治療,一貫煎低劑量組以一貫煎凍干粉[1.1 g/(kg·d)]灌胃治療。秋水仙堿組以秋水仙堿[0.25 mg/(kg·d)]灌胃治療,連續(xù)4周。正常對照組、模型對照組和干細胞組以等量蒸餾水灌胃。
1.2.3 檢測指標與方法
1.2.3.1 陰虛表征觀測 于取材前測量大鼠體質(zhì)量、飲水量、舌面干濕度,記錄糞便、尿液情況,并對二便情況進行評分。大便正常干為1分,較干2分,干3分;小便清為1分,小便白淡黃為2分,黃為3分。
1.2.3.2 組織收集方法 0.1 mL/100 g戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉大鼠,固定并腹主動脈采血,所得血液室溫靜置4 h。使用低溫離心機離心10 min,離心半徑14.5 cm。離心后分離上清待測。分離肝臟,取肝左葉的相同部位,放于4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋。剩余肝組織分裝凍存管,液氮凍存后放入-80 ℃冰箱保存。
1.2.3.3 血清生化檢測 使用日立7600全自動生化儀檢測各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)含量。
1.2.3.4 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)、Masson染色觀察肝組織病理改變 取石蠟包埋好組織切片,厚度5 μm,以HE染色后,使用光學顯微鏡觀察肝組織炎癥情況;另取組織切片以Masson染色,觀察組織中膠原纖維情況。
1.2.3.5 實時PCR法檢測RhoA、ROCK、α-SMA、COL-1 mRNA的表達 使用RNA試劑盒提取總RNA后,將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,完成后對其進行PCR擴增反應。引物序列見表1。
表1 引物序列
1.2.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表達 取各組大鼠肝組織40 mg,提取總蛋白,以BCA法定量,每組取30 μg/泳道SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳完成后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,脫脂牛奶封閉1 h。放入按1∶1 000稀釋的一抗中孵育過夜,洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗滌3次,室溫下以1∶10 000稀釋的二抗孵育1 h,檢測各組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1蛋白表達,以GAPDH作為內(nèi)參。
1.2.3.7 免疫組織化學檢測α-SMA、COL-1的陽性表達面積 石蠟切片脫蠟復水,磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)漂洗、枸櫞酸鈉抗原修復液加熱進行抗原修復。封閉,滴加按1∶200稀釋的α-SMA、COL-1一抗液,4 ℃濕盒過夜;次日漂洗、加入二抗,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木精復染,脫水、透明、封片。
2.1 陰虛表征結果 與正常對照組比較,模型對照組大鼠體質(zhì)量明顯減輕、舌面干濕度顯著降低、飲水減少,并出現(xiàn)大便干、小便黃等癥狀,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),提示模型對照組大鼠出現(xiàn)明顯陰虛癥狀;與模型對照組比較,一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組體質(zhì)量、飲水量和舌面干濕度增加,血流速度減緩,大便正常、小便淡黃,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。
表2 各組大鼠陰虛表征比較
2.2 肝功能檢測結果 肝功能檢測結果顯示,模型對照組血清GPT、GOT含量較正常對照組顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),提示造模成功。一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、一貫煎+干細胞組血清GPT、GOT含量較模型對照組顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3。
2.3 HE、Masson染色結果 與正常對照組比較,模型對照組的肝組織發(fā)生顯著的壞死和肝纖維改變,肝小葉內(nèi)有纖維間隔形成,肝小葉結構紊亂;與模型對照組比較,一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組肝組織的炎癥壞死和纖維化程度均明顯減輕。見表3、圖1。
表3 各組大鼠肝功能與肝臟病理比較
圖1 各組大鼠肝組織病理學(上HE、下Masson染色,×200)
2.4 實時PCR檢測結果 PCR實驗結果顯示,與正常對照組比較,模型對照組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表達顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);與模型對照組比較,一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎+干細胞組的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表達顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);與BMSCs組比較,一貫煎+干細胞組的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表達顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。
圖2 各組大鼠RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA表達
2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測結果 蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示,與正常對照組比較,模型對照組的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1蛋白表達均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);與模型對照組比較,一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表達均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),且表達水平隨一貫煎的給藥劑量升高而降低;與干細胞組比較,一貫煎+干細胞組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表達均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);與一貫煎中劑量組比較,一貫煎+干細胞組的ROCK1、α-SMA表達均顯著低于一貫煎中劑量組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖3。
2.4 免疫組織化學染色結果 肝組織免疫組織化學染色顯示,與正常對照組比較,模型對照組肝組織切片的α-SMA、COL-1陽性面積顯著增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與模型對照組比較,一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組中α-SMA、COL-1的陽性面積顯著減少,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖4。
圖4 各組大鼠α-SMA、COL-1比較(免疫組織化學染色,400)
肝纖維化在中醫(yī)無明確名稱,臨床中常根據(jù)患者的實際癥狀和體征將其歸于“腹脹”“癥積”“脅痛”病證進行辨證治療。肝纖維化主要由細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)不斷積累引起,ECM主要由活化的HSCs產(chǎn)生,故HSCs的活化和增殖是肝纖維化進展過程中的重要環(huán)節(jié)[7-8]。一貫煎臨床常用于治療證屬肝腎陰虛的肝纖維化、慢性肝炎、肝損傷等疾病。體外實驗研究發(fā)現(xiàn),一貫煎可抑制地活化和增殖達到抗纖維化的作用[9-10]。
BMSCs來源于骨髓,具有自我更新、增殖、多能分化和低抗原性等特點,故常用BMSCs移植進行肝病治療研究[1-13]。目前,已有臨床研究應用BMSCs治療肝臟疾病并取得了良好效果[14-16]。但有研究發(fā)現(xiàn),注射BMSCs后對肝纖維化的改善效果并不理想,其具體原因尚不明確,定向引導BMSCs移動到受損肝臟并持續(xù)發(fā)揮治療作用是當前研究的重要內(nèi)容[7]。本課題組前期實驗證明一貫煎可促進BMSCs遷移到肝損傷部位,并發(fā)揮抗肝纖維化的作用,但其中具體機制還未探明[8-19]。
Rho通路在調(diào)控細胞功能方面有重要作用,可調(diào)節(jié)細胞遷移、收縮、活化等生理活動[20]。RhoA是Rho信號通路的啟動子,參與肌動蛋白應力纖維的組裝;ROCK1是RhoA的下游分子,可被RhoA信號激活,從而參與HSCs活化與變形等生理過程[4]。RhoA/ROCK1激活后可引起HSCs活化,高表達α-SMA并分泌大量膠原,其中Collagen Ⅰ是肝纖維化過程中的重要因子,且肝臟的纖維化程度與肝組織中CollagenⅠ的沉積量正相關,故α-SMA、CollagenⅠ常作為肝纖維化嚴重程度的評價指標[21-24]。本研究實時PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示,模型對照組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的mRNA和蛋白表達水平升高,RhoA/ROCK1通路激活,HSCs活化,并產(chǎn)生大量膠原。而一貫煎、干細胞和一貫煎+干細胞等干預方式均可抑制RhoA/ROCK1通路激活,阻止HSCs活化從而減少膠原產(chǎn)生,其中一貫煎聯(lián)合BMSCs的作用效果優(yōu)于一貫煎(中劑量)組和干細胞組(P<0.05)。
本實驗結果表明:一貫煎與BMSCs可抑制Rho通路的關鍵分子RhoA、ROCK1的表達從而抑制HSCs活化,二者聯(lián)合干預作用優(yōu)于各自單獨使用時的效果,本研究為進一步探索一貫煎促進BMSCs抗纖維化提供了基礎。