一貫煎聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞調(diào)控RhoA/ROCK1通路抑制大鼠肝纖維化的實驗研究

李汶航 張 睿 崔欣怡 唐佐青 油紅捷 楊 錚 付修文 馬 赟 劉文蘭

(1 首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京，100069；2 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，100069，北京)

大量實驗研究證實，骨髓干細胞(Bone Marrow Stem Cells，BMSCs)具有治療肝纖維化的作用，其治療機制與抑制肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)活化有關[1-3]。文獻報道Rho三磷酸鳥苷酶(Rho GTPases)可參與多種生物學行為與功能，其中RhoA/ROCK1信號通路與HSCs活化相關，并參與肝纖維化的形成過程[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一貫煎可促進BMSCs募集到肝臟并發(fā)揮抗肝纖維化的作用，但具體的治療機制尚未探明。本實驗將進一步研究一貫煎聯(lián)合BMSCs通過調(diào)控RhoA/ROCK1通路治療肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6周齡Sprague-Dawlay大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，共72只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006，倫理號：AEEI-2015-123，飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級動物室。

1.1.2 藥物 一貫煎組成：北沙參9 g、麥冬9 g、當歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，購自北京同仁堂藥店。

一貫煎凍干粉制備方法[5-6]：取適宜煎煮容器，加藥材量7倍的冷水浸泡1 h，煮沸20 min，濾出藥液。隨后藥渣添加3倍量的水煎煮，煮沸30 min，取前后2次濾液合并、濃縮。將藥液靜置過夜。加入無水乙醇至70%，待析出沉淀后，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，加入10%甘露醇，于-80 ℃條件下凍存4 h后放入冷凍干燥機凍干48 h以上，待水分全部凍干，研磨粉碎，放入-20 ℃冰箱保存，將所得的凍干粉稱重，計算出大鼠給藥劑量：高劑量為0.44 g/100 g、中劑量為0.22 g/100 g、低劑量為0.11 g/100 g。

1.1.3 試劑與儀器 秋水仙堿(Colchicine，西雙版納藥業(yè)有限責任公司，批號：200101)；橄欖油(邁薩維諾特級初榨橄欖油，希臘，批號：67519)；四氯化碳(CCl4，純度≥99.0%，上海易恩化學技術有限公司，批號：206848)；PVDF膜(羅氏公司，德國，批號：03010040001)；RIPA蛋白裂解液(蘭博利德，批號:1090121810)二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司，批號：010719190828)；動物組織總RNA提取試劑盒(北京普洛麥格生物公司，批號：0000343931)；SYBR Green Qpcr Master Mix(武漢賽維爾生物，批號：MPC2011005)?？贵wRhoA(CST公司，美國，貨號：2117S)；Rho相關激酶1(Rho-associated kinase 1，ROCK1)(CST公司，美國，貨號：4035S)；α-SMA(CST公司，美國，貨號：19245S)；膠原蛋白-1(Collagen I，COL-1)(CST公司，美國，貨號：91144S)，GAPDH(CST公司，美國，貨號：5174S)。

電子天平(Sartorius公司，德國，型號：TE1502S)；冷凍干燥機(CHRIST公司，德國，型號：ALPHA1-2Ldplus)；正置熒光顯微鏡(Leica公司，德國，型號：DM4000B)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-5298A)；全自動多功能酶標儀(Thermo公司，美國，型號：MULTISKAN MK3)；電泳儀(BioRad公司，美國，型號：1659001)；成像系統(tǒng)(Fujifilm株式會社，日本，型號：LAS3000)；低溫離心機(Sigma公司，美國，型號：4-16S/4-16KS)；分光光度計(Thermo公司，美國，型號：NANODROP 2000)；PCR儀(BioRad公司，美國，型號：CFX96)；全自動生化儀(日立公司，日本，型號：7600)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為8組，即正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組、一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組，每組9只。肝纖維化模型構建：除正常對照組外，其余7組大鼠腹腔注射四氯化碳溶液(橄欖油、四氯化碳按1∶1配制)，初始2周注射劑量為0.2 mL/100 g，2次/周；隨后2周調(diào)整劑量為0.1 mL/100 g，2次/周；最后2周調(diào)整劑量為0.05 mL/100 g，2次/周。正常對照組注射等量的橄欖油溶液。

BMSCs的分離、培養(yǎng)：取6周齡雄性SD大鼠，脫頸處死，于超凈工作臺中取下肢長骨，用完全培養(yǎng)基多次沖洗骨髓腔，過濾。將所得細胞放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞濃度達到70%～80%后進行傳代。當傳至第4代時，消化、收集細胞、調(diào)整濃度為5×106個/L。

1.2.2 給藥方法 干細胞組、一貫煎+干細胞組大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL BMSCs；其他組注射等量生理鹽水。一貫煎高劑量組以一貫煎凍干粉[4.4 g/(kg·d)]灌胃治療，一貫煎中劑量組、一貫煎+干細胞組以一貫煎凍干粉[2.2 g/(kg·d)]灌胃治療，一貫煎低劑量組以一貫煎凍干粉[1.1 g/(kg·d)]灌胃治療。秋水仙堿組以秋水仙堿[0.25 mg/(kg·d)]灌胃治療，連續(xù)4周。正常對照組、模型對照組和干細胞組以等量蒸餾水灌胃。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 陰虛表征觀測 于取材前測量大鼠體質(zhì)量、飲水量、舌面干濕度，記錄糞便、尿液情況，并對二便情況進行評分。大便正常干為1分，較干2分，干3分；小便清為1分，小便白淡黃為2分，黃為3分。

1.2.3.2 組織收集方法 0.1 mL/100 g戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉大鼠，固定并腹主動脈采血，所得血液室溫靜置4 h。使用低溫離心機離心10 min，離心半徑14.5 cm。離心后分離上清待測。分離肝臟，取肝左葉的相同部位，放于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋。剩余肝組織分裝凍存管，液氮凍存后放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.3.3 血清生化檢測 使用日立7600全自動生化儀檢測各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase，GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase，GOT)含量。

1.2.3.4 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)、Masson染色觀察肝組織病理改變 取石蠟包埋好組織切片，厚度5 μm，以HE染色后，使用光學顯微鏡觀察肝組織炎癥情況；另取組織切片以Masson染色，觀察組織中膠原纖維情況。

1.2.3.5 實時PCR法檢測RhoA、ROCK、α-SMA、COL-1 mRNA的表達 使用RNA試劑盒提取總RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，完成后對其進行PCR擴增反應。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表達 取各組大鼠肝組織40 mg，提取總蛋白，以BCA法定量，每組取30 μg/泳道SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，脫脂牛奶封閉1 h。放入按1∶1 000稀釋的一抗中孵育過夜，洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗滌3次，室溫下以1∶10 000稀釋的二抗孵育1 h，檢測各組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1蛋白表達，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.3.7 免疫組織化學檢測α-SMA、COL-1的陽性表達面積 石蠟切片脫蠟復水，磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)漂洗、枸櫞酸鈉抗原修復液加熱進行抗原修復。封閉，滴加按1∶200稀釋的α-SMA、COL-1一抗液，4 ℃濕盒過夜；次日漂洗、加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。

2 結果

2.1 陰虛表征結果 與正常對照組比較，模型對照組大鼠體質(zhì)量明顯減輕、舌面干濕度顯著降低、飲水減少，并出現(xiàn)大便干、小便黃等癥狀，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示模型對照組大鼠出現(xiàn)明顯陰虛癥狀；與模型對照組比較，一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組體質(zhì)量、飲水量和舌面干濕度增加，血流速度減緩，大便正常、小便淡黃，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠陰虛表征比較

2.2 肝功能檢測結果 肝功能檢測結果顯示，模型對照組血清GPT、GOT含量較正常對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示造模成功。一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、一貫煎+干細胞組血清GPT、GOT含量較模型對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3。

2.3 HE、Masson染色結果 與正常對照組比較，模型對照組的肝組織發(fā)生顯著的壞死和肝纖維改變，肝小葉內(nèi)有纖維間隔形成，肝小葉結構紊亂；與模型對照組比較，一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組肝組織的炎癥壞死和纖維化程度均明顯減輕。見表3、圖1。

表3 各組大鼠肝功能與肝臟病理比較

圖1 各組大鼠肝組織病理學(上HE、下Masson染色，×200)

2.4 實時PCR檢測結果 PCR實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與模型對照組比較，一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎+干細胞組的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與BMSCs組比較，一貫煎+干細胞組的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA表達

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測結果 蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1蛋白表達均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與模型對照組比較，一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表達均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，且表達水平隨一貫煎的給藥劑量升高而降低；與干細胞組比較，一貫煎+干細胞組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表達均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與一貫煎中劑量組比較，一貫煎+干細胞組的ROCK1、α-SMA表達均顯著低于一貫煎中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖3。

2.4 免疫組織化學染色結果 肝組織免疫組織化學染色顯示，與正常對照組比較，模型對照組肝組織切片的α-SMA、COL-1陽性面積顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與模型對照組比較，一貫煎高劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎低劑量組、干細胞組、一貫煎+干細胞組中α-SMA、COL-1的陽性面積顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠α-SMA、COL-1比較(免疫組織化學染色，400)

3 討論

肝纖維化在中醫(yī)無明確名稱，臨床中常根據(jù)患者的實際癥狀和體征將其歸于“腹脹”“癥積”“脅痛”病證進行辨證治療。肝纖維化主要由細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)不斷積累引起，ECM主要由活化的HSCs產(chǎn)生，故HSCs的活化和增殖是肝纖維化進展過程中的重要環(huán)節(jié)[7-8]。一貫煎臨床常用于治療證屬肝腎陰虛的肝纖維化、慢性肝炎、肝損傷等疾病。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，一貫煎可抑制地活化和增殖達到抗纖維化的作用[9-10]。

BMSCs來源于骨髓，具有自我更新、增殖、多能分化和低抗原性等特點，故常用BMSCs移植進行肝病治療研究[1-13]。目前，已有臨床研究應用BMSCs治療肝臟疾病并取得了良好效果[14-16]。但有研究發(fā)現(xiàn)，注射BMSCs后對肝纖維化的改善效果并不理想，其具體原因尚不明確，定向引導BMSCs移動到受損肝臟并持續(xù)發(fā)揮治療作用是當前研究的重要內(nèi)容[7]。本課題組前期實驗證明一貫煎可促進BMSCs遷移到肝損傷部位，并發(fā)揮抗肝纖維化的作用，但其中具體機制還未探明[8-19]。

Rho通路在調(diào)控細胞功能方面有重要作用，可調(diào)節(jié)細胞遷移、收縮、活化等生理活動[20]。RhoA是Rho信號通路的啟動子，參與肌動蛋白應力纖維的組裝；ROCK1是RhoA的下游分子，可被RhoA信號激活，從而參與HSCs活化與變形等生理過程[4]。RhoA/ROCK1激活后可引起HSCs活化，高表達α-SMA并分泌大量膠原，其中Collagen Ⅰ是肝纖維化過程中的重要因子，且肝臟的纖維化程度與肝組織中CollagenⅠ的沉積量正相關，故α-SMA、CollagenⅠ常作為肝纖維化嚴重程度的評價指標[21-24]。本研究實時PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，模型對照組RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的mRNA和蛋白表達水平升高，RhoA/ROCK1通路激活，HSCs活化，并產(chǎn)生大量膠原。而一貫煎、干細胞和一貫煎+干細胞等干預方式均可抑制RhoA/ROCK1通路激活，阻止HSCs活化從而減少膠原產(chǎn)生，其中一貫煎聯(lián)合BMSCs的作用效果優(yōu)于一貫煎(中劑量)組和干細胞組(P<0.05)。

本實驗結果表明：一貫煎與BMSCs可抑制Rho通路的關鍵分子RhoA、ROCK1的表達從而抑制HSCs活化，二者聯(lián)合干預作用優(yōu)于各自單獨使用時的效果，本研究為進一步探索一貫煎促進BMSCs抗纖維化提供了基礎。