基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接研究三七總皂苷治療腎纖維化的作用機制

龔銘炯 白俊其 徐 文 宮 璐 丘小惠 黃志海 張 靖

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院,中國中醫(yī)科學(xué)院廣東分院,廣州,510006)

腎纖維化(Renal Fibrosis，RF)是慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎衰的共同特征,包括原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病、腎小管、腎間質(zhì)、血管疾病等,表現(xiàn)為腎間質(zhì)和腎實質(zhì)的損傷,多是由于腎臟受到炎癥、物理損傷、藥物損害后,導(dǎo)致多種細(xì)胞因子和活性物質(zhì)的產(chǎn)生、炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞活化、上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)過度沉積等,重者引起組織結(jié)構(gòu)破壞而發(fā)生器官硬化[1]。

三七(RadixNotoginseng)為我國傳統(tǒng)名貴中藥,用于治療疾病已有悠久的歷史,主要用于冠心病、心絞痛等心腦血管系統(tǒng)疾病的治療[2]。三七藥材中主要含有達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜母核結(jié)構(gòu)的皂苷類成分,其中以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、人參皂苷Rd的含量較高[3]。近年來,三七藥材及三七總皂苷(PanaxNotoginsengSaponins，PNS)在治療RF方面具有較好的臨床療效[4-5]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),其作用機制主要包括:減少炎癥細(xì)胞的聚集,下調(diào)腎組織中RF相關(guān)性因子表達(dá),抑制整合素、纖維化標(biāo)志物轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF)-β1的表達(dá),抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,抑制人腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)并減少ECM的積聚等[6]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù)手段,以整體觀、系統(tǒng)觀的角度探尋“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”間的關(guān)聯(lián)性,是一種尋找中藥復(fù)方潛在藥效物質(zhì)和作用靶點，提高藥物發(fā)現(xiàn)效率的新策略,契合中藥多成分、多途徑、多靶點的協(xié)同作用特點及整體觀[7-10]。分子對接則是通過預(yù)測及模擬評價受體大分子及藥物分子之間的結(jié)合模式和親合力,可應(yīng)用于基于特定靶標(biāo)的中藥及復(fù)方的藥效物質(zhì)篩選研究[11]。

藥物經(jīng)傳輸途徑入血、代謝、分布并產(chǎn)生生物效應(yīng),因此入血成分才是最終的“效應(yīng)成分”,它是藥效物質(zhì)傳遞體系的最終環(huán)節(jié)[12]。本課題組前期利用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對三七藥材的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)性分析[13]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測方法及分子對接技術(shù),基于從入血成分-靶點對應(yīng)性分析,找尋中藥有效性表征的化學(xué)成分構(gòu)成,對PNS的潛在質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行研究,闡明PNS治療RF的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制,為制定反映內(nèi)在質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)奠定科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取8周齡雄性SD大鼠10只,體質(zhì)量(220±20)g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號：SYXK(粵)2018-0094。飼養(yǎng)溫度(25±2)℃,相對濕度(50±5)%,自由飲水及飲食。本研究經(jīng)廣東省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:2019056)。

1.1.2 藥物 對照品人參皂苷Rb1(批號:110704-201827)、Rg1(批號:110703-201832)、Re(批號:110754-201827)與三七皂苷R1(批號:110745-201820)購自中國食品藥品檢定研究院。三七皂苷R2、人參皂苷Rf、Rh1、Rg2、Rb2、Rb3和Rd由中國科學(xué)院上海藥物研究所朱大元教授提供。PNS為實驗室自制,三七總皂苷含量>90%。取適量,加水溶解,配制成2.3 g/L溶液。

1.1.3 試劑與儀器 甲醇(Merck公司，德國，貨號:SHBN6011)；乙腈(Merck公司，德國，貨號:I1153107122)；超純水由水純化系統(tǒng)(銳思捷水純化技術(shù)有限公司,型號:RODI-220B1)制得;超高壓液相色譜儀(Thermo-fisher公司,美國,型號:Accela),通過電噴霧離子源(Electrospray Ionization，ESI)與四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Thermo-fisher公司,美國,型號:Q-Exactive)連接;高速冷凍離心機(Sigma公司,德國,型號:3K15);電子天平(Mettler toledo公司,瑞士,型號:AB135-S)。

1.1.4 數(shù)據(jù)資料 本研究涉及靶點蛋白UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(https://www.rcsb.org/)、PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[14]、CooLGeN數(shù)據(jù)庫(http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/)和人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、生物信息學(xué)DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/);分析軟件采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲕浖﨏ytoscape 3.2.1、分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件Pymol 2.3.2、化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換軟件Open Babel 2.3.1、POCASA在線預(yù)測蛋白活性口袋(http://g6altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/)、分子對接軟件AutoDock1.5.6及AutoDock Vina[15]。

1.2 方法

1.2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱為CORTECS C18(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)色譜柱;流動相為水(A)、乙腈(B),梯度洗脫程序:0～3 min(12% B→22%B),3～9 min(22%B→40%B),18～19 min(40%B→95%B);柱溫:25 ℃;流速:250 μL/min;進(jìn)樣體積:2 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源負(fù)離子模式,離子源參數(shù)設(shè)置如下:鞘氣(N2)44 psi,輔助氣8 psi,噴霧電壓2.7 kV,毛細(xì)管溫度350 ℃;樣品先采用高分辨質(zhì)譜全掃描,質(zhì)量范圍為m/z 300～1 450;二級質(zhì)譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描,分辨率為Full Scan 70 000 FWHM,MS/MS 15 000 FWHM。使用Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理,通過高分辨質(zhì)譜信息推導(dǎo)其可能的分子式,采用前期實驗室已建立的三七化學(xué)成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,結(jié)合化合物的一級、二級質(zhì)譜及裂解規(guī)律進(jìn)行分析和鑒別。

1.2.2 給藥及樣本處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,給藥前禁食不禁水12 h。將大鼠隨機分為2組(n=5),給藥組灌胃給予三七總皂苷提取液,給藥體積0.01 mL/g,空白組灌胃相同體積水,連續(xù)給藥3 d。末次給藥1 h后,10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血7 mL,室溫放置30 min,待充分凝血后,以3 000 r/min,離心半徑7 cm,離心15 min。吸取上清液1.0 mL,加入4 mL乙腈,于離心管中充分渦旋1 min,以15 000 r/min,離心半徑7 cm,離心15 min。吸取上清液,用氮氣吹干,用0.5 mL12%乙腈溶液充分溶解殘留物,過0.22 μm微孔濾膜,得血清供試品溶液。

1.2.3 靶標(biāo)蛋白篩選 采用反向藥效團(tuán)匹配的方法將檢測到的PNS的入血成分以*.mol2格式上傳到PharmMapper系統(tǒng),將蛋白種類設(shè)定為Human Protein Targets Only,其他參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)。提交后獲得PDB ID、靶點名稱(Target Name)和得分(Fit Score),其中Fit Score為分子和靶點的匹配度,數(shù)值越高代表越匹配。選取fit score>3的靶點蛋白作為化合物的靶標(biāo)蛋白,輸入UniProt數(shù)據(jù)庫,校正靶點名稱為相應(yīng)基因簡稱,經(jīng)檢索和轉(zhuǎn)化操作獲取與成分相關(guān)的潛在作用靶點。通過在CooLGeN和GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Renal Fibrosis”搜索與CGN相關(guān)的基因,并去除重復(fù)和假陽性基因。

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥對的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,限定物種為人,進(jìn)行PPI分析。選取0.7的高置信度保證數(shù)據(jù)的可靠性,保存結(jié)果。將導(dǎo)出文件中的Node1、Node2和Combined Score信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析,并將節(jié)點大小設(shè)置用于反映度(Degree)值的大小,邊(Edge)的粗細(xì)設(shè)置反映Combined Score的大小。

1.2.5 靶點的通路分析 在DAVID網(wǎng)站導(dǎo)入得到的潛在作用靶點,限制物種為人,進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析,分析結(jié)果以P值小于0.05為指標(biāo)篩選。應(yīng)用在線繪圖軟件E Chat對KEGG分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。將入血成分預(yù)測出的31個作用靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG分析。GO富集分析結(jié)果包括生物過程(Biological Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)。

1.2.6 活性成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)上述20個入血活性成分的靶點篩選及通路分析結(jié)果,采用Cytoscape軟件構(gòu)建三七總皂苷“活性成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)。其中,以不同的節(jié)點(Node)分別表示活性成分、靶蛋白、通路、疾病4類節(jié)點,用邊(Edge)表示它們之間的相互關(guān)系,構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)探討PNS多成分、多靶點和多通路之間的相互作用機制。綠色三角代表黃芪活性成分,橙色菱形代表三七活性成分,綠色圓形代表靶點,紫色方形代表通路。

1.2.7 活性成分與關(guān)鍵靶點驗證 選擇PPI中度值排名前11位中的靶點蛋白結(jié)構(gòu),與PNS入血成分進(jìn)行反，向分子對接模擬計算,采用Pymol、AutoDock、Open Babel等軟件分別對靶蛋白及配體分子進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化及預(yù)處理,構(gòu)建活性口袋(結(jié)合原配體并檢索POCASA預(yù)測蛋白活性口袋),使用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接篩選,獲取反映活性成分與各個靶點蛋白親和力分?jǐn)?shù)(對接打分函數(shù)結(jié)果為結(jié)合自由能△G,單位為kcal/mol)和對接構(gòu)象相互作用。結(jié)果選取結(jié)合自由能≤-10.0 kcal/mol(1 cal=4.184 J)的結(jié)合構(gòu)象,使用Pymol軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 PNS色譜圖建立與入血成分分析 PNS及空白組、給藥組的大鼠血清樣品進(jìn)行了定性分析,3種樣品的總離子流圖見圖1。由于血液中的內(nèi)源性代謝物也同時有良好的響應(yīng),對含量較低的PNS入血成分干擾明顯,在色譜圖上難以直接發(fā)現(xiàn)其入血成分。入血的原形成分既存在于給藥血清中又存在于PNS中,因此比對PNS及給藥組血清的色譜圖,通過對PNS中主要成分的準(zhǔn)分子離子峰為基峰的離子流圖進(jìn)行提取,并比對保留時間,對照品圖譜及二級色譜圖,在給藥血清中分析并鑒定了20種入血的皂苷類成分。見表1。入血成分的精確相對分子質(zhì)量誤差均小于5×10-6。

表1 三七總皂苷入血成分的LC-MS數(shù)據(jù)及鑒定

圖1 三七總皂苷(A),空白血清(B)和給藥血清(C)的負(fù)離子模式總離子流圖

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 靶標(biāo)蛋白篩選 將采用反向藥效團(tuán)匹配方法得到的成分靶點,刪除重復(fù)及去除假陽性,整合得到成分作用靶點272個,與CooLGeN和GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選的RF相關(guān)的基因1 498個取交集,匯總得到31個與PNS入血成分治療RF相關(guān)的潛在作用靶點。見表2。

表2 與三七總皂苷入血成分治療腎纖維化相關(guān)的潛在作用靶點

2.2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 圖2中節(jié)點表示蛋白,邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián),其中節(jié)點的大小表示度值的大小,邊的粗細(xì)表示Combined Score值的大小。其中度值大于5的蛋白包括AKT1(11)、EGFR(11)、MMP9(11)、SRC(10)、STAT1(10)、JAK2(8)、CASP3(7)、NOS2(6)、MMP2(6)、IL2(6)、MDM2(6)。

圖2 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析

2.2.3 靶點通路注釋分析 根據(jù)錯誤發(fā)生率小于0.05,篩選出BP 50個(涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、增殖、基質(zhì)分解、缺氧應(yīng)答等);CC 12個(涉及細(xì)胞核、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、胞漿等);MF 33個(涉及蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶活性、內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合等)。取Count值大于5排序,結(jié)果如圖3所示,BP富集的基因數(shù)靶點較多,說明PNS入血成分主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生物過程發(fā)揮治療RF的作用。KEGG分析共富集到51條信號通路,與RF相關(guān)主要涉及PI3K-AKT信號通路、Rap1信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、Ras信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路等。選與RF相關(guān)的10個通路進(jìn)行可視化。見圖4。

圖3 三七總皂苷入血成分作用靶點的GO富集分析

圖4 三七總皂苷入血成分作用靶點KEGG富集分析的8條通路

2.2.4 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)分析 該網(wǎng)絡(luò)有64個節(jié)點(包括20個成分、31個靶點、10條通路和1個疾病)和560條邊。節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點連接的路線數(shù)目,度值越大說明與之相連的節(jié)點數(shù)越多。表明三七總皂苷治療RF的作用是多成分、多基因、多靶點協(xié)同作用的復(fù)雜過程。見圖5。

圖5 三七總皂苷治療腎纖維化“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.3 活性成分與靶蛋白對接分析 對20個PNS入血成分和11個潛在核心靶點進(jìn)行分子對接,即受體為AKT1(PDB ID:6HHF)、EGFR(PDB ID:6S9B)、MMP9(PDB ID:IL6J)、SRC(PDB ID:1KSW)、STAT1(PDB ID:1YVL)、JAK2(PDB ID:3IO7)、CASP3(PDB ID:6OBL)、NOS2(PDB ID:3E7G)、MMP2(PDB ID:1RTG)、IL2(PDB ID:4NEM)、MDM2(PDB ID:6Q9H)。大部分的PNS入血成分與靶點有較高的結(jié)合活性,結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。本研究結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol的對接結(jié)果有219個,占99%;結(jié)合能小于-9.0 kcal/mol的對接結(jié)果有49個,占22%。本研究以≤-9.0 kcal/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn),除M7、M9、M15外,其他17個入血成分與單個或多個受體結(jié)合活性較高,其中M5、M8、M11、M12、M16～M20與3個以上的受體結(jié)合活性較高。在11個靶點受體中,AKT-1、SRC、CASP3、NOS2與5個以上的成分結(jié)合活性較高。見圖6。圖7為選取結(jié)合能小于-10.0 kcal/mol的分子最接結(jié)果用Pymol軟件進(jìn)行可視化。

圖6 分子對接結(jié)果的熱圖分析

圖7 三七總皂苷抗腎纖維化靶蛋白-入血成分分子對接圖

3 討論

以往文獻(xiàn)研究表明,有的三七皂苷類成分即是入血成分,也是其他主要成分的代謝產(chǎn)物[16-17]。一般認(rèn)為,結(jié)合能小于0說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合,配體與受體的相互作用的親和力越強則構(gòu)象越穩(wěn)定,所需的能量也越少,結(jié)合的可能性越大。經(jīng)Vina篩選,根據(jù)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析,結(jié)果見圖6,紅色越深代表結(jié)合自由能越低。

3.1 關(guān)鍵活性成分分析 三七皂苷類成分在肝臟、心臟、腎臟、肺等器官中發(fā)揮良好的抗纖維化作用,能有效減輕肌成纖維細(xì)胞的激活和增殖,抑制ECM的過度積累(包括膠原蛋白和纖維連接蛋白),減少氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，以及纖維化標(biāo)志物(尤其是TGF-β1),減少對實質(zhì)細(xì)胞的損傷(包括凋亡和壞死變化)[18]。人參皂苷Rg1能明顯抑制UUO誘導(dǎo)的腎纖維化,顯著降低梗阻腎和TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-smooth Muscle Actin，α-SMA)的表達(dá),并通過降低血小板應(yīng)答蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)表達(dá)和增加血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)來調(diào)節(jié)腎微血管完整性[19-21]。人參皂苷Rb1能有效抑制腎小管損傷及膠原沉積等導(dǎo)致的腎纖維化,降低TGF-β1水平并能通過AMPK/mTOR、PI3K/AKT/mTOR等通路抑制細(xì)胞自噬體形成和自噬聚集[22-24]。人參皂苷Rh2顯著降低細(xì)胞凋亡指數(shù),下調(diào)膠原的表達(dá)水平,切割胱天蛋白酶3,增加腎臟中Bcl-2的表達(dá)[25]。此外,PNS還可有效抑制炎癥以及激活抗氧化活性從而減少腎損傷[26]。因此,三七總皂苷被視為治療腎纖維化的一類有效成分。

在三七藥材及PNS中,含量較高的成分主要為人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd及三七皂苷R1等,研究顯示這些成分的口服利用度較低。但除了口服后以原型的形式吸收入血外,這些成分還通過在消化道內(nèi)脫去糖苷代謝為極性更小的活性成分并吸收入血[27]。在人及生物樣品中,人參皂苷Rg1主要以代謝產(chǎn)物形式人參皂苷Rh1及人參皂苷F1存在;人參皂苷Rb1的可代謝為人參皂苷Rd、人參皂苷F2或Rg3、人參皂苷Rh2或CK;三七皂苷R1可代謝為三七皂苷R2及Rh1[28-29]。分子對接結(jié)果中,入血成分與潛在靶點之間99%均具有結(jié)合活性。其中人參皂苷Rb1、丙二酰人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg3等與主要靶點AKT1、SRC、CASP3、NOS2的結(jié)合活性較強,這些成分有的即是PNS的入血成分,也是其他主要成分的代謝產(chǎn)物。含量較高的成分,如人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1,除了自身與靶點具有較好的結(jié)合活性外,還通過代謝為極性更小的化合物而發(fā)揮更好的結(jié)合活性。

3.2 核心靶點及相關(guān)通路分析 本研究結(jié)果顯示,PNS入血成分參與治療RF的潛在核心靶點為AKT1、EGFR、MMP9、SRC、STAT1、JAK2、CASP3、NOS2、MMP2、IL2、MDM2等,核心靶點之間存在顯著的相互作用關(guān)系,且與大部分入血成分顯示出良好的結(jié)合活性。由KEGG通路富集分析可知,31個靶點共富集在10條與RF相關(guān)的通路上,入血成分通過這些信號通路上的相關(guān)靶點達(dá)到治療RF的目的。這些信號通路主要影響細(xì)胞遷移、增殖、分化和凋亡,與炎癥、缺氧、成纖維細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等密切相關(guān)。其中,PI3K/AKT信號通路與RF相關(guān)的靶點數(shù)量最多。KEGG分析顯示,入血成分能作用于上游的胰島素樣生長因子1受體、胰島素受體、JAK激酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、表皮生長因子受體、KIT、C-C基序配體5以及作用于蛋白激酶B1,通過上游RAS信號通路、趨化因子信號通路、Rap1信號通路等多途徑調(diào)控或直接作用于PI3K/AKT信號通路,從而抑制細(xì)胞的生長、增殖,影響細(xì)胞周期。PI3K/AKT通路能作用于下游的HIF-1信號及FoxO信號通路,可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、自噬及氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng),從而調(diào)節(jié)纖維化,作用于腎臟細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和存活,對RF起保護(hù)作用。

蛋白激酶B1、Src蛋白、胱天蛋白酶3、一氧化氮合酶2、表皮生長因子受體與多個成分有較高的結(jié)合活性。AKT是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要的信號節(jié)點,小鼠蛋白激酶B1的缺失可減少腎纖維化和腎小管去分化,使單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)小鼠腎臟中纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)顯著增加,并增強人近端腎小管細(xì)胞(HK2細(xì)胞)中TGF-β1的表達(dá)及磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá),促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡[30-31]。Src蛋白是一種非受體酪氨酸激酶,用化學(xué)抑制劑PP1失活后,通過抑制TGF-β1、PI3K/AKT和EGFR信號通路的激活,以及增加上皮細(xì)胞G2/M阻滯,可抑制腎成纖維細(xì)胞的活化和增殖,減少ECM沉積[32-33]。此外,PP1可抑制Src蛋白激活阻斷腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)吞作用,增加基質(zhì)金屬蛋白酶-2活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡及ECM降解[34]。胱天蛋白酶3在細(xì)胞內(nèi)能特異性切割Gasdermin E蛋白產(chǎn)生氨基末端片段而引起細(xì)胞凋亡,特異性敲除胱天蛋白酶3能減輕腎小管損傷和炎癥,防止腎小管損傷[35]。近端上皮中表皮生長因子受體的持續(xù)激活可導(dǎo)致自發(fā)性進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化,表皮生長因子受體激活下游的ERK、AKT，以及TGF-β1/SMAD通路,可促進(jìn)上皮去分化、細(xì)胞周期阻滯及肌成纖維細(xì)胞的增殖[36-38]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在腎間質(zhì)纖維化中高度表達(dá),其小分子抑制劑可降低一氧化氮合酶2表達(dá)以及TGF-β1/Smad3磷酸化[39]。蛋白激酶B1、Src蛋白、胱天蛋白酶3、表皮生長因子受體均視為目前治療腎纖維化的潛在靶點。

綜上所述,本研究以PNS口服吸收入血成分為研究對象,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了三七總皂苷治療腎纖維化的主要作用靶點及通路,構(gòu)建“活性成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò),并運用分子對接方法對這些入血成分與潛在關(guān)鍵靶點的結(jié)合能力進(jìn)行驗證。研究結(jié)果表明,PNS是三七治療腎纖維化的活性成分,其入血成分均呈現(xiàn)出與AKT1、SRC、CASP3、NOS2、EGFR等靶點良好的結(jié)合能力,從而通過多成分、多靶點、多途徑的特點發(fā)揮治療腎纖維化的作用，為后續(xù)的藥理研究及藥物開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。