白花蛇舌草抗炎機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實驗研究

李 曼 張露蓉,2 金順琪 侯文躍 梁國強(qiáng),2

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室，蘇州，215000；2 蘇州市吳門醫(yī)派研究院中藥研究與開發(fā)部，蘇州，215000)

白花蛇舌草別名蛇舌草、蛇舌癀，是茜草科耳草屬植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草，性寒味苦甘，寒性清熱，苦味燥濕，用于治療各種濕熱病癥，具有清熱、利濕、解毒的功效[1-2]。其提取物分布較廣泛，包括蒽醌類、萜類、甾醇類和水溶性酚酸類等，具有抗炎抑菌、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用[3-7]。近年來，對白花蛇舌草抗炎作用的研究多停留在動物整體水平或細(xì)胞水平，對其中發(fā)揮抗炎作用的主要化學(xué)成分及機(jī)制研究并不深入[8-9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，是研究中藥“多成分-多靶點-多通路”的作用手段[10-12]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法篩選白花蛇舌草中與抗炎相關(guān)的靶點通路，以動物實驗?zāi)Ｐ驮u價其藥效作用并檢測血清中炎癥介質(zhì)含量，探討其抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在的分子靶點，為白花蛇舌草抗炎機(jī)制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 相關(guān)活性成分的篩選及“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)檢索白花蛇舌草化學(xué)成分37個，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件篩選白花蛇舌草有效活性成分并匹配其相關(guān)靶點，將其靶點數(shù)據(jù)在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化、確認(rèn)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“白花蛇舌草活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 疾病相關(guān)靶點的獲取 以“Anti-Inflammatory”為檢索詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)(https://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中搜索疾病靶點，根據(jù)Relevance Score值以中位數(shù)卡點獲得相關(guān)疾病靶點，利用韋恩圖在線繪制工具篩選白花蛇舌草抗炎成分和相關(guān)炎癥靶點的交集基因并繪圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)構(gòu)建 將活性成分和疾病的交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，計算各節(jié)點的Degree值，PPI圖根據(jù)Degree值大小進(jìn)行排列。

1.4 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將共有靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進(jìn)行GO和KEGG通路的富集分析，物種選擇“H.sapiens”，并運用相關(guān)軟件繪圖。

1.5 分子對接 選取PPI網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名較高的靶點與相關(guān)活性成分進(jìn)行分子對接，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org/)中下載相關(guān)靶點的3D結(jié)構(gòu)“pdb”文件，在ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc15.docking.org/)中下載化合物小分子的3D結(jié)構(gòu)“mol2”文件，利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接，最終結(jié)果以結(jié)合能來評價分子對接情況。

1.6 動物實驗材料

1.6.1 動物 健康ICR雄性小鼠，無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級，體質(zhì)量在20～22 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0006。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院中心實驗室動物房內(nèi)(倫理審批號：2018倫動批006)，在室溫22～25 ℃、相對濕度40%～50%、12 h光照條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。實驗過程嚴(yán)格按照中華人民共和國科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.6.2 藥液的制備 白花蛇舌草樣品購自藥材市場或經(jīng)產(chǎn)地采收，由蘇州中醫(yī)醫(yī)院藥劑科進(jìn)行鑒別。精密稱取白花蛇舌草干品40 g，用800 mL 75%乙醇(純水)提取2次，每次微沸后提取1 h，最后合并醇提液(水煎液)，旋蒸濃縮，冷凍干燥為粉末，冷藏備用。

1.6.3 試劑與儀器 95%乙醇(分析醇，上海聯(lián)試化工試劑有限公司，批號：160702)，雙氯芬酸鈉緩釋片(北京諾華制藥有限公司，批號：x0804)；二甲苯(上海聯(lián)試化工試劑有限公司，批號：20131201)；醋酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：201620910236)；酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(IL-6、TNF-α)(聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號:70-EK2062/2，70-EK2822/2)；玻璃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司，德國，型號：Heizbad HB digit)；高速離心機(jī)(Sigma公司，德國，型號：1-13型)

1.7 實驗方法

1.7.1 分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分為模型組(0.9%生理鹽水)、陽性藥組(雙氯芬酸鈉緩釋片，DSSRT，13 mg/kg)、白花蛇舌草水提物組[2、4、8 g(生藥)/kg]、醇提物組[2、4、8 g(生藥)/kg]，每組8只。實驗前1 d禁食18 h。每天灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。

1.7.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 于末次給藥1 h后，將20 μL二甲苯(100%)均勻涂抹于各組小鼠右耳的兩面致炎，小鼠的左耳不涂作為對照，30 min后摘眼球取血并脫頸椎處死，沿小鼠耳郭剪下小鼠的兩耳，用直徑6 mm的打孔器在左右耳相同位置打下圓形耳片，分別稱重，以雙耳片的質(zhì)量差作為耳腫脹度，計算腫脹抑制率。腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量。

將血液于離心機(jī)上3 500 r/min(離心半徑6 cm)，離心10 min，取上清，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書檢測血清中白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)的含量。

1.7.3 醋酸致小鼠扭體實驗 末次給藥1 h后，各小鼠注射醋酸溶液(0.6 %)0.2 mL，計時15 min，記錄其扭體次數(shù)(腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高)，以模型組與給藥組小鼠扭體均數(shù)之差占模型組扭體均數(shù)的百分比表示抑制率[13]。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草主要活性成分的分析 得到7個活性成分，根據(jù)文獻(xiàn)報道及篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-6-O-P-Methoxycinnamoyl Scandoside Methyl Ester具有極高的類藥性，Deacetyl Asperuloside Acid_Qt具有較高OB，共9個活性成分。見表1。

表1 白花蛇舌草主要活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，除1、3、9號成分未匹配到相關(guān)靶點，其余成分獲得相關(guān)靶基因173個。圖1中有6個活性成分節(jié)點和173個靶基因節(jié)點，綠色菱形代表靶點，紅色長方形是活性成分，淺藍(lán)色長方形是藥物名稱，均以Degree值大小依次排列?；钚猿煞职凑斩戎蹬帕袨镼uercetin(槲皮素)、Stigmasterol(豆甾醇)、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Deacetyl Asperuloside Acid_Qt、Poriferasterol；度值≥4的靶點有PTGS2、PTGS1、NCOA2、GABRA1、ADRB2、SCN5A。

圖1 白花蛇舌草“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.2 白花蛇舌草活性成分和炎癥靶點交集基因 從數(shù)據(jù)庫中搜索8 297個疾病靶點相關(guān)信息，根據(jù)Relevance score值以中位數(shù)卡點，得1 046個靶點信息，繪制與成分靶點的交集基因的韋恩圖，共得交集基因99個。見圖2。

圖2 白花蛇舌草活性成分與炎癥靶點交集基因韋恩圖

2.3 白花蛇舌草PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)Degree值大小將99個交集靶點按照形狀由大到小、顏色由紅到淺藍(lán)色進(jìn)行排序，度值≥60的靶點有IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2、JUN、MMP9、CXCL8、IL-1β、CASP3、EGF、EGFR、CCL2、MAPK1，度值越高表明此節(jié)點越重要。見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選結(jié)果

2.4 GO功能和KEGG通路的富集分析 GO分析選取P值前20項，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相關(guān)靶點在細(xì)胞分布上主要分布于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)等；分子功能主要集中于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能。參與的生物過程涉及脂多糖、細(xì)菌來源分子、毒性物質(zhì)反應(yīng)、應(yīng)對受傷、細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、凋亡信號通路、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。見圖4。

圖4 白花蛇舌草相關(guān)靶點的GO富集分析

KEGG富集到兩百多條通路，其中癌癥通路中Pathways in cancer相關(guān)靶點44個，為擊中靶點最多的通路，前20項結(jié)果顯示，所預(yù)測的相關(guān)靶點信息與炎癥相關(guān)通路有：AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路，與其相關(guān)的靶點有AKT1、TNF、IL-6、PTGS2、VEGFA等。見圖5。

圖5 預(yù)測靶點KEGG通路富集分析

2.5 分子對接 將PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前6位的交集靶點AKT1(PDB ID 3CQW)、IL-6(PDB ID 4O9H)、TNF(PDB ID 2AZ5)、VEGFA(PDB ID 4KZN)，其中β-谷甾醇與AKT1結(jié)合能力最強(qiáng)，Poriferasterol、2-methoxy-3-methyl-9,10-anthraquinone、豆甾醇與5個靶點結(jié)合力普遍較強(qiáng)。見表2。

表2 分子對接結(jié)果(1 cal=4.184 J)

2.6 白花蛇舌草對小鼠耳腫脹的影響 白花蛇舌草水提液和醇提液均可顯著減輕小鼠耳腫脹，降低小鼠血清中IL-6、TNF-α因子水平。見圖6。在耳腫脹實驗中，各給藥組腫脹度與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，且以水提物高劑量組藥效最好。此外，與對照組比較，2種提取物中、高劑量組均可明顯降低小鼠血清中炎癥介質(zhì)IL-6水平和TNF-α水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 白花蛇舌草對二甲苯致小鼠耳緣腫脹反應(yīng)模型的影響(n=8)

圖6 白花蛇舌草提取物對耳腫脹小鼠血清中IL-6、TNF-α的影響

2.7 白花蛇舌草對醋酸致小鼠扭體的影響 白花蛇舌草水提物和醇提物均可明顯減少醋酸致小鼠扭體次數(shù)；除水提物低劑量組外，各給藥組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，以水提物高劑量組鎮(zhèn)痛效果最佳。見表4。

表4 白花蛇舌草對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型的影響(n=8)

3 討論

白花蛇舌草是清熱解毒的良藥，現(xiàn)代臨床研究以其抗腫瘤作用為主，但在傳統(tǒng)古方中白花蛇舌草多用于治療蟲蛇咬傷等引起的紅腫熱痛，即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常說的急性炎癥[14]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選得6個活性成分，173個相關(guān)靶點，取其活性成分和抗炎交集靶點99個，構(gòu)建“靶點-成分”可視化網(wǎng)絡(luò)，藥物活性成分包括槲皮素、豆甾醇、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、Β-谷甾醇、Deacetyl Asperuloside Acid_Qt、Poriferasterol，核心靶點有AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2等[15]。槲皮素具有廣泛抗炎作用[16]；豆甾醇能顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2的表達(dá)，通過下調(diào)核因子κB、P65，抑制核因子κB抑制物磷酸化(Phosphorylation of Nuclear Factor-kappa B Inhibitorα，p-IκBα)活化，增加了抗炎因子IL-10的表達(dá)[17]；Β-谷甾醇能夠最大程度地降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞IL-6的活性，并減少TNF-α和IL-1β的分泌，達(dá)到抗炎效果[18]；2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone尚未見文獻(xiàn)報道相關(guān)抗炎作用。核心靶點中AKT1與細(xì)胞代謝、生存遷移和基因表達(dá)有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)血管通透性發(fā)揮作用，導(dǎo)致水腫和白細(xì)胞外滲，對于急性炎癥和組胺介導(dǎo)的血管滲漏至關(guān)重要[19]。IL-6是趨化因子家族中的細(xì)胞因子，能促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的浸潤[20]；血管內(nèi)皮生長因子A可促進(jìn)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)體內(nèi)血管增生，增加血管的通透性，從而促進(jìn)炎癥介質(zhì)的生成[21]；在急性炎癥反應(yīng)中，活化轉(zhuǎn)錄因子3(Activating Transcription Factor 3，ATF3)負(fù)調(diào)節(jié)前列腺素-內(nèi)過氧化酶合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase2,PTGS2),PTGS2軸失調(diào)可能會導(dǎo)致慢性炎癥疾病中白細(xì)胞積累增加，前列腺素E2/前列腺素D2水平升高，PTGS2表達(dá)異常[22]。以上皆表明白花蛇舌草中6個活性成分可能作用于AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2等靶點發(fā)揮抗炎作用，分子對接也證明此結(jié)合的有效性。

GO和KEGG通路富集分析顯示花蛇舌草通過不同途徑調(diào)控體內(nèi)多種信號通路。發(fā)揮抗炎效應(yīng)的靶點主要參與TNF、IL-17、AGE-RAGE等信號通路。TNF是由巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號有核因子κB、細(xì)胞凋亡、JNK等信號通路途徑，在炎癥反應(yīng)、腫瘤免疫等方面發(fā)揮重要作用[23]。IL-17是一種高度多功能的炎癥介質(zhì)，在宿主防御、組織修復(fù)、炎癥疾病發(fā)病機(jī)制和癌癥進(jìn)展等多種過程中都至關(guān)重要[24]。

本研究進(jìn)一步通過體內(nèi)實驗對白花蛇舌草的抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行藥效學(xué)的驗證，結(jié)果顯示其提取液可顯著減輕二甲苯致小鼠耳腫脹，減少醋酸致小鼠扭體次數(shù)，降低血清中IL-6、TNF-α水平。體內(nèi)實驗水提物呈良好的“量-效”關(guān)系，提示白花蛇舌草提取液中水溶性成分越高，抗炎作用越有優(yōu)勢。此外，醇提液也有明顯的抗炎作用，表明溶于水醇溶液中的抗炎成分同樣不可忽視。

綜上所述，白花蛇舌草可能通過Β-谷甾醇，Poriferasterol、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、豆甾醇等關(guān)鍵成分影響AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2等關(guān)鍵靶點，影響TNF等信號通路，體現(xiàn)了白花蛇舌草治療炎癥作用的“多成分、多靶點、多通路”的特點，通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證其抗炎作用，推測其抗炎機(jī)制可能與抑制TNF-α和IL-6這2種炎癥介質(zhì)的生成有關(guān)，為白花蛇舌草抗炎機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考。