一起D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起小規(guī)模關(guān)中奶山羊腹瀉報(bào)道

吳 克，馮 航，王 斌，王晨驍，王 娟，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種有莢膜的革蘭陽性厭氧菌，菌體呈粗短桿狀[1]，廣泛存在于各種動(dòng)物的胃腸道中[2]；并且產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠形成芽孢和生物膜，增強(qiáng)其對(duì)不利因素抵抗力，使其能夠在土壤、河流等自然環(huán)境中長期生存[3-4]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌致病主要依靠菌體產(chǎn)生的蛋白毒素[5]，作為一種重要的人畜共患致病菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌在適宜的條件下生長繁殖迅速且能夠產(chǎn)生20余種毒素[6]。根據(jù)對(duì)α、β、ι、ε毒素的產(chǎn)生能力，先前分型標(biāo)準(zhǔn)將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A～E 5個(gè)毒素型[7-8]；在最新分型標(biāo)準(zhǔn)中，根據(jù)是否產(chǎn)生CPE和NetB毒素，F(xiàn)型和G型產(chǎn)氣莢膜梭菌也被加入分型系統(tǒng)[9]。不同毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起多種人畜疾病，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起機(jī)體氣性壞疽，F(xiàn)型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起人類食源性感染[10-11]；據(jù)統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒在美國和韓國所有食源性感染中排名第2位，在英國和法國則排在第3位[12]。除引起人類食源性感染外，B、C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌也能夠引起以壞死性腸炎、出血性腸炎、腸毒血癥、猝死和腹瀉為特征的家畜感染[13]。

據(jù)以往報(bào)道，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是產(chǎn)氣莢膜梭菌最常見的毒素型，雖然D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分布沒有A型產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛，但D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性遠(yuǎn)超A型產(chǎn)氣莢膜梭菌；其產(chǎn)生的ETX毒素半數(shù)致死量為70 ng/kg，毒性僅次于肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素。并且D型產(chǎn)氣莢膜梭菌能造成綿羊和山羊猝死、腸毒血癥、神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)癥狀[14]。本研究自陜西省富平縣某規(guī)模化羊場病羊舍11只伴隨不同程度腹瀉的山羊肛門拭子中均分離到D型產(chǎn)氣莢膜梭菌。為探究此次小規(guī)模流行D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株及其在綿羊腹瀉中的作用，本研究在產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定的基礎(chǔ)上檢測了產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株毒素基因組成、生物膜形成能力、對(duì)常用抗生素耐藥性、致病性以及對(duì)常規(guī)消毒劑的抵抗力，為產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的預(yù)防和控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源11份伴隨不同程度腹瀉的關(guān)中奶山羊肛門拭子于2021年8月采集自陜西省富平縣某規(guī)?；B(yǎng)殖場，拭子采集后置于運(yùn)輸培養(yǎng)基并于4℃采樣箱保存，12 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2 主要試劑和儀器細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；昆明小鼠購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；細(xì)菌培養(yǎng)96孔板購自廣州潔特生物過濾股份有限公司；2×Taq PCR StarMix購自北京Genstar 生物科技有限公司；藥品購自上海源葉生物科技有限公司；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、CAMHB肉湯和普通營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；厭氧培養(yǎng)箱購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定將所采集的肛門拭子浸泡于1 mL無菌生理鹽水，37℃靜置30 min。取50 μL液體按照1∶100加入5 mL厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)18 h增菌。培養(yǎng)完成后，取1 mL 菌液3 000 r/min離心2 min，劃線接種于TSC培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。挑取TSC培養(yǎng)基上黑色菌落接種于5%綿羊血平板進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。取血平板上單菌落生理鹽水稀釋煮菌后PCR擴(kuò)增分離菌株16S rRNA序列并送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 分離菌株毒素基因檢測毒素基因cpa、cpb、etx、itx,cpe、netB、cpb2的特異引物見表1，送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。水煮法提取菌株DNA，毒素基因cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR,50 μL反應(yīng)體系：25 μL 2×Mix預(yù)混液，cpa、cpb、etx、itx毒素上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL,雙蒸水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序：94℃ 10 min；(94℃ 30 s，51.6℃ 30 s，72℃ 30 s)30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。cpe、netB、cpb2采用單重PCR，20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×Mix預(yù)混液，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL,雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94℃ 10 min；(94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min)30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

表1 毒素基因PCR引物

1.5 分離菌株耐藥性檢測通過微量肉湯稀釋法測定產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株對(duì)選用抗生素的最小抑菌濃度(MIC)，在細(xì)菌用96孔板每孔加入50 μL CAMHB，并將青霉素(PEN)、氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DOX)、恩諾沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異噁唑(SOX)、磺胺氯噠嗪(SCP)、克林霉素(CLI)、萬古霉素(VAN)、氯霉素(CL)和鏈霉素(STR)進(jìn)行梯度稀釋。血平板上刮取產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落，生理鹽水稀釋為麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌液。菌液CAMHB混合均勻，按照每孔50 μL加入96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20 h。通過觀察96孔細(xì)菌培養(yǎng)板內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長情況統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)菌株對(duì)所選抗生素的MIC值。

1.6 分離菌株生物膜測定分離產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種于厭氧肉肝湯過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)菌液使用CAMHB培養(yǎng)基稀釋100倍后按照每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，1% PBS清洗2次，甩出孔內(nèi)剩余液體后每孔加入100 μL甲醇室溫條件下固定15 min；固定完成后，吸出甲醇并置于37℃溫箱風(fēng)干剩余液體；1%結(jié)晶紫染色10 min后流水洗去多余結(jié)晶紫，并風(fēng)干水分；每孔加入100 μL 33%醋酸37℃靜置15 min溶解結(jié)晶紫后讀取595 nm處D值。上述操作每株菌重復(fù)3次，D值取3次平均值；6個(gè)孔只加入100 μL CAMHB并做相同處理作為陰性對(duì)照。

1.7 小鼠致病性試驗(yàn)將產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株1∶100接種于7 mL厭氧肉肝湯培養(yǎng)基中，于37℃溫箱過夜培養(yǎng)。10只小鼠隨機(jī)均分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，取過夜培養(yǎng)菌液0.2 mL/只腹腔注射攻毒試驗(yàn)組小鼠，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水并于相同條件飼養(yǎng)。將試驗(yàn)組死亡小鼠與對(duì)照組小鼠進(jìn)行剖檢，對(duì)比觀察試驗(yàn)組死亡小鼠的病理變化；并將病變組織器官進(jìn)行常規(guī)石蠟制片和組織病理學(xué)觀察。

1.8 對(duì)常規(guī)消毒劑抵抗力產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株接種于厭氧肉肝湯過夜培養(yǎng)，取2 mL菌液3 000 r/min離心5 min，使用生理鹽水稀釋至麥?zhǔn)蠞岫?.5，分別使用經(jīng)一定濃度稀釋后的新潔爾滅、乙醇、84消毒液和濃戊二醛溶液作用10 min，然后用足量中和劑對(duì)反應(yīng)進(jìn)行終止(表2)。將消毒劑作用前后菌液分別以10-5稀釋和原濃度涂布于TSC平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對(duì)常規(guī)消毒劑的抵抗力。

表2 消毒劑及中和劑選擇

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定及毒素分型分離菌株在TSC平板上為中心黑色邊緣半透明菌落(圖1A)，5%綿羊血平板上培養(yǎng)24 h后為帶有雙重溶血環(huán)的半透明光滑小菌落(圖1B)，革蘭染色鏡檢顯示其為革蘭陽性中等大小桿菌(圖1C)。PCR擴(kuò)增16S rRNA序列后比對(duì)顯示分離菌株均為產(chǎn)氣莢膜梭菌。本研究自11只腹瀉奶山羊肛門拭子中分離得到8株產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為D-1～D-8。經(jīng)毒素基因檢測顯示8株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為攜帶毒素基因cpa和etx的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，且均攜帶有cpb2毒素基因，結(jié)合8株產(chǎn)氣莢膜梭菌分離自同一病羊舍8只腹瀉奶山羊，初步懷疑所分離的8株產(chǎn)氣莢膜梭菌為同一株D型產(chǎn)氣莢膜。

圖1 分離菌株形態(tài)特征觀察

2.2 分離菌株耐藥性及生物膜形成能力經(jīng)藥敏檢測和生物膜形成能力測定，8株產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株對(duì)12種常用抗生素MIC值分布和生物膜形成能力高度一致(表3)；結(jié)合毒素基因檢測顯示其毒素基因組成一致，判斷這8株分離于同一病羊舍的產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于同一株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌。且該產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株對(duì)磺胺類藥物(MIC >1 024 mg/L)、STR抵抗力較強(qiáng)(MIC ≥128 mg/L)，對(duì)TET和CL具有一定抵抗力(MIC為4～8 mg/L)，對(duì)PEN、AMP、ENR、CLI和VAN等藥物抵抗力較弱(MIC<0.5 mg/L)。

表3 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株耐藥性檢測

2.3 分離產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性檢測該產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株過夜培養(yǎng)物腹腔注射小鼠后，試驗(yàn)組5只小鼠24 h內(nèi)全部死亡；將試驗(yàn)組死亡小鼠與對(duì)照組小鼠剖檢對(duì)比觀察病變，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠肝臟出現(xiàn)輕度腫大、顏色變黑，腸道出現(xiàn)明顯臌氣、出血等變化(圖2)；取試驗(yàn)組死亡小鼠腸道內(nèi)容物進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定均可得D型產(chǎn)氣莢膜梭菌。病變腸道石蠟切片觀察可見死亡小鼠腸絨毛破碎、腸壁肌肉層結(jié)構(gòu)變松散等病變(圖3)。

A.試驗(yàn)組；B.對(duì)照組

A.試驗(yàn)組；B.對(duì)照組

2.4 分離產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)常規(guī)消毒劑抵抗力如圖4所示，該D型產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)75%酒精、1∶5稀釋新潔爾滅、1∶86稀釋84消毒液處理10 min后被完全殺滅，但1∶3 000稀釋的濃戊二醛處理后效果較差。

圖4 常規(guī)消毒劑對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株作用效果評(píng)價(jià)

3 討論

關(guān)中奶山羊?yàn)殛兾麝P(guān)中地區(qū)的乳用型山羊，具有適應(yīng)性廣、耐粗飼、繁殖率高、適于放牧或舍飼、乳用性能好等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)從同一病羊舍11只腹瀉關(guān)中奶山羊肛門拭子分離到8株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌。8株產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因組成一致，對(duì)常用抗生素MIC值分布和生物膜形成能力高度一致，判斷為同一株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌在小范圍流行所致。小鼠攻毒顯示該產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株具有致死性，且對(duì)消化系統(tǒng)損傷能力較強(qiáng)；結(jié)合奶山羊的腹瀉癥狀，可判斷此次奶山羊小規(guī)模腹瀉是由1株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行導(dǎo)致，且PEN、AMP、ENR、CLI等藥物對(duì)其防治效果較好。對(duì)常規(guī)消毒劑抵抗力檢測顯示，新潔爾滅和84消毒液對(duì)該產(chǎn)氣莢膜梭菌的作用效果良好；奶山羊生產(chǎn)中為防止產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行感染應(yīng)加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的機(jī)械清掃和消毒，以防止產(chǎn)氣莢膜梭菌的區(qū)域性傳播致病。