番茄紅素、菟絲子和泰山磐石散緩解玉米赤霉烯酮對孕鼠生殖毒性的作用

康俊港，李 楊，姜國均，王亞博，馬占飛

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)又稱F-2毒素，是一種由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的非甾體雌激素真菌毒素，是真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。全世界每年約有25%的谷物會遭受霉菌毒素的污染，其污染已成為世界性公共安全問題。ZEA具有類雌激素作用，對畜禽的生殖系統(tǒng)具有破壞作用。其污染狀況對畜牧業(yè)產(chǎn)生極大的威脅，嚴(yán)重影響了我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

番茄紅素是植物性食物中存在的一種類胡蘿卜素，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[1]。研究表明，番茄紅素可以拮抗鄰苯二甲酸二丁酯所致果蠅的生殖毒性，包括果蠅生育率、生育期、生育數(shù)和子代存活率[2]。番茄紅素可以緩解環(huán)境雌激素全氟辛酸引起的生殖障礙和肝損傷[3]。KANG等[4]研究發(fā)現(xiàn),番茄紅素可通過防止氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡對豬體外受精胚胎的發(fā)育起有益作用。

菟絲子是純天然藥用植物，其最有效成分為菟絲子黃酮具有滋補(bǔ)肝腎、保胎的功效，具有溫而不燥、補(bǔ)而不滯的特點(diǎn)。菟絲子可以通過調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸來調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌活動[5]，在改善應(yīng)激大鼠卵巢內(nèi)分泌功能，降低流產(chǎn)模型的流產(chǎn)率，預(yù)防氧化應(yīng)激引起的生精細(xì)胞損傷以及阻滯細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[6]。此外，有研究表明，菟絲子黃酮具有抗凋亡作用[7-8]。

泰山磐石散為補(bǔ)益劑，具有益氣健脾，養(yǎng)血安胎之功效。高曉雷等[9]研究表明，泰山磐石散可以調(diào)節(jié)雌二醇(E2)、孕酮(P)和雌激素受體(ER)來降低流產(chǎn)率。另有研究表明，泰山磐石散能使復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠降低胚胎流失率，發(fā)揮免疫防護(hù)作用，有利于妊娠繼續(xù)[10]。楊乃喜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，給妊娠期母鼠飼喂泰山磐石散，能夠提高仔鼠的生長性能，提高仔鼠抗炎性損傷能力，降低仔鼠的腹瀉率。

3種中藥能否緩解ZEA引發(fā)的生殖毒性尚未見報道。本試驗通過對孕鼠灌胃ZEA及中藥后，檢測分析孕鼠子宮形態(tài)、生殖激素和細(xì)胞凋亡因子表達(dá)水平的變化，探究ZEA的毒性損傷及中藥的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料ZEA購自上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司，純度保證值為97%；番茄紅素購自上海源葉生物科技有限公司，純度為80%；菟絲子黃酮購自西安開來生物工程有限公司，純度為90%；泰山磐石散購自楊凌正大生物科技有限公司。

1.2 實驗動物飼養(yǎng)管理及分組昆明系8周齡雌性小鼠、9周齡雄性小鼠，購自北京斯貝福實驗動物中心，許可證號：SCXK(京)2019-0010。雌鼠4只1籠，雄鼠1只1籠。試驗期間自由飲水和采食，室溫19～22℃，通風(fēng)良好，常規(guī)飼養(yǎng)。

第3天后，雌鼠∶雄鼠2∶1合籠過夜，次日清晨檢查出陰栓者，定為孕0 d，孕鼠均單籠飼喂。將未孕小鼠轉(zhuǎn)到原籠，傍晚再與雄鼠合籠過夜，直至檢出陰栓。將妊娠小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)4只。A組為對照組；B組為模型組，C組為番茄紅素組，D組為菟絲子黃酮組，E組為泰山磐石散組。孕0 d上午，A組灌胃蒸餾水0.2 mL，B、C、D、E組均灌胃5 mg/kg ZEA 0.2 mL；下午A、B組灌胃蒸餾水0.2 mL，C組灌胃20 mg/kg 番茄紅素0.2 mL，D組用灌胃10 mg/kg 菟絲子黃酮0.2 mL，E組灌胃1 g/mL泰山磐石散0.2 mL。各組試驗鼠于孕第11天剖殺，記錄體質(zhì)量和流產(chǎn)數(shù)。

1.3 樣品采集和指標(biāo)測定

1.3.1樣品采集 孕第11天，眼球摘除采血，37℃培養(yǎng)箱靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取血清-20℃ 保存?zhèn)溆?。脫頸處死小鼠，取子宮，放入4℃保存的生理鹽水中，記錄胚胎數(shù)，剝離胎兒及胎盤，稱量子宮凈重。然后取子宮中段固定于4%甲醛溶液中；其余部分錫紙包裹放入封裝袋，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2生殖激素水平分析 血清和子宮中E2、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、P等生殖激素采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。E2試劑盒、FSH試劑盒、LH試劑盒和P 試劑盒均購自東莞酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.3子宮石蠟切片的制作 對4%甲醛浸泡后的子宮組織進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片、鏡檢。

1.3.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法測定子宮中凋亡因子mRNA的表達(dá) 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成以下引物序列：Bax上、下游引物：5′-TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG-3′，5′-CCATGATGGTTCTGATCAGCTC-3′;Bcl-2上、下游引物：5′-AGGCTCTCTGCACCATCACTT-3′,5′-CTCTGGGTTGGGTCTGTGTTC-3′;Caspa-se-3上、下游引物：5′-GAAACTCTTCATCATTCAGGCC-3′，5′-GCGAGTGAGAATGTGCATAAAT-3′;Caspase-8上、下游引物5′-ACCAAATGAAGAACAAACCTCG-3′，5′-CTTCATTTTT-CGGAGTTGGGTT-3′。

將干粉引物10 000 r/min離心1 min，使其落入管底部，加入無菌無酶水稀釋到10 μmol/L，備用。取40 mg、-80℃保存的子宮組織，按照試劑盒說明提取總RNA，合成cDNA。將所得cDNA按照RT-qPCR試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 ZEA對孕鼠生長性能及流產(chǎn)率的影響及中藥的緩解作用妊娠第11天，相比A組，B組孕鼠末體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，平均日增體質(zhì)量也極顯著降低(P<0.01)，流產(chǎn)率極顯著升高(P<0.01)；C組末體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，平均日增體質(zhì)量和流產(chǎn)率差異不顯著(P>0.05)；D、E組末體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，D組平均日增體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，流產(chǎn)率極顯著升高(P<0.01)；E組平均日增體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，流產(chǎn)率差異不顯著(P>0.05)。與B組相比，C、D、E組末體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)，C組平均日增體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，流產(chǎn)率極顯著降低(P<0.01)；D、E組平均日增體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，流產(chǎn)率極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果詳見表1。

表1 妊娠小鼠生長性能及流產(chǎn)率

2.2 ZEA對妊娠小鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響及中藥的緩解作用孕鼠妊娠期開始灌喂5 mg/kg ZEA后，對子宮產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。A組(對照組)子宮內(nèi)膜呈絨毛狀突起，組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)清晰，而B組(模型組)子宮內(nèi)膜內(nèi)陷，固有層水腫，結(jié)締組織排列疏松，結(jié)構(gòu)紊亂。C、D、E組相對清晰完整，可見給予中藥有一定的緩解作用(圖1)。

A～E.對照組、模型組、番茄紅素組、菟絲子黃酮組、泰山磐石散組

2.3 ZEA對妊娠小鼠生殖激素水平的影響及中藥的緩解作用

2.3.1妊娠小鼠血清生殖激素水平及中藥的緩解作用 與A組相比，B組的E2、FSH和P含量極顯著升高(P<0.01)，而LH的含量極顯著降低(P<0.01)，C、D、E組的E2和LH的含量差異不顯著(P>0.05)，C、D組FSH的含量極顯著升高(P<0.01)，P的含量顯著升高(P<0.05)；與B組相比，C、D、E組E2的含量顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)SH的含量極顯著降低(P<0.01)，C組LH水平顯著升高(P<0.05)，C、D組P的含量差異不顯著(P>0.05)，D、E組LH的含量極顯著升高(P<0.01)，E組P的含量顯著降低(P<0.05)(圖2)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.3.2妊娠小鼠子宮勻漿生殖激素水平及中藥的緩解作用 與A組相比，B組的E2、FSH、P的含量均極顯著升高(P<0.01)，而LH的含量極顯著降低(P<0.01)，C、D、E組的E2、FSH、LH和P的含量差異不顯著(P>0.05)；與B組相比，C、D組E2、FSH和P的含量顯著降低(P<0.05)，LH的含量顯著升高(P<0.05)，E組E2、FSH和P的含量極顯著降低(P<0.05)，E組LH水平極顯著升高(P<0.01)(圖3)。

圖3 妊娠小鼠子宮勻漿生殖激素的含量變化

2.4 ZEA對妊娠小鼠子宮凋亡相關(guān)因子的影響及中藥的緩解作用凋亡因子的mRNA相對表達(dá)量，與A組相比，B組子宮Bax、Caspase-3和Caspase-8 mRNA相對表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，C、D、E組子宮Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8 mRNA相對表達(dá)量均與A組相近(P>0.05)；與B組相比，C、D組Bax和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Caspase-8 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；D組Bcl-2和Caspase-3差異不顯著(P>0.05)；E組Bax mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2和Caspase-8 mRNA相對表達(dá)量相近(P>0.05)，Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(圖4)。

圖4 ZEA對妊娠期小鼠子宮凋亡相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

3 討論

近年來，霉菌毒素的污染日益嚴(yán)重，同時我國嚴(yán)禁在飼料中添加激素類藥物，用中藥解決ZEA污染問題成為重要選項之一。本試驗通過灌服中藥成分和中藥方，探討其對ZEA引起生殖毒性的緩解作用。

子宮是母鼠重要的生殖器官，在激素分泌和胚胎附植過程中起到重要作用，而ZEA正是以雌性動物生殖系統(tǒng)作為主要靶器官。子宮的功能狀態(tài)直接影響母鼠的繁殖機(jī)能。王相生[12]研究表明，母豬妊娠期飼糧中含有微量ZEA可顯著降低胎兒數(shù)，提高產(chǎn)弱仔豬發(fā)生率；王丙雷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度ZEA的攝入可以導(dǎo)致雌性小鼠子宮增生和上皮內(nèi)陷。孕期檢測平均日增體質(zhì)量可以間接反映胚胎發(fā)育情況和孕鼠的繁殖性能。本試驗結(jié)果顯示，B組的平均日增體質(zhì)量顯著低于A組，流產(chǎn)率也高于對照組，子宮內(nèi)膜增生，固有層水腫，說明ZEA對孕鼠產(chǎn)生生殖毒性，對子宮造成損傷，造模成功。在KUNISHIGE等[14]關(guān)于ZEA作用于早期妊娠小鼠的研究中，ZEA 通過影響輸卵管中胚胎的運(yùn)輸和延遲胚胎發(fā)育，干擾胚胎附植過程，探索了ZEA致流產(chǎn)的機(jī)理。本試驗發(fā)現(xiàn)，使用番茄紅素等中藥后，平均日增重升高，流產(chǎn)率降低，子宮內(nèi)膜未增生，固有層輕微水腫。楊柳[3]研究表明，番茄紅素可以提高妊娠小鼠平均子宮質(zhì)量，可能是拮抗了全氟辛酸對胚胎生長發(fā)育的抑制作用；菟絲子黃酮能夠通過增加滋養(yǎng)細(xì)胞MMP9的表達(dá)來增加滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲能力，同時激活MAPK、AKT和Notch信號通路的相互信號傳導(dǎo)發(fā)揮預(yù)防治療流產(chǎn)作用[15]；泰山磐石散通過抑制NF-κB的活化、降低促炎細(xì)胞因子的合成和釋放來防治自然流產(chǎn)[16]；這與本試驗番茄紅素、菟絲子黃酮和泰山磐石散能夠降低流產(chǎn)率結(jié)果相一致，但對降低ZEA染毒流產(chǎn)率的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

下丘腦-垂體-性腺軸分泌的E2、FSH、LH和P共同調(diào)控動物體生殖內(nèi)分泌活動。本試驗結(jié)果顯示，與A組相比，B組的E2、FSH和P含量極顯著升高(P<0.01)，而LH的含量極顯著降低(P<0.01)。E2的主要作用為促進(jìn)雌性生殖器官的發(fā)育，這可能是本試驗子宮內(nèi)膜增生的原因，E2的含量變化與KUNISHIGE等[13]的研究結(jié)果一致。FSH可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，與LH協(xié)同作用促進(jìn)雌激素的分泌。有研究表明，ZEA可以增加FSH水平[17-18]；NAKAMURA等[19]研究證實，ZEA及其所有代謝物在體外通過G蛋白偶聯(lián)受體30抑制來自牛垂體前葉細(xì)胞的LH分泌，均與本試驗結(jié)果一致，這可能與本試驗中E2和P的升高負(fù)反饋調(diào)節(jié)了LH的分泌，導(dǎo)致LH水平的降低。P是卵巢黃體分泌的一種天然孕激素，是維持妊娠的重要保證，ZEA會導(dǎo)致P水平降低，進(jìn)而影響妊娠過程。VANCE等[20]對攝入3個發(fā)情周期的妊娠母馬血清P含量進(jìn)行檢測，也是升高的，結(jié)果與本試驗?zāi)Ｐ徒M相同；但在王相生等[21]的研究中，飼喂添加ZEA飼糧的妊娠母豬血清P含量顯著高于對照組；導(dǎo)致此結(jié)果的原因目前還不清楚，這可能與正處在妊娠期有關(guān)，但具體機(jī)制還要進(jìn)一步驗證。本試驗發(fā)現(xiàn)，與B組相比，C、D組E2、FSH和P的含量顯著降低(P<0.05)，LH的含量顯著升高(P<0.05)，E組E2、FSH和P的含量極顯著降低(P<0.05)，E組LH水平極顯著升高(P<0.01)。有研究表明，番茄紅素和菟絲子黃酮升高了由雙酚A染毒的子代雌鼠LH水平，降低了E2生殖激素水平[22]；菟絲子黃酮能夠調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸來維持生殖激素的穩(wěn)態(tài)[5]；泰山磐石散可以調(diào)節(jié)流產(chǎn)模型大鼠外周血E2和P含量[9]；這表明3種中藥都可以調(diào)控生殖激素水平，并與本試驗結(jié)果相一致，表明番茄紅素等中藥可以對ZEA引起的生殖激素紊亂起到一定的逆轉(zhuǎn)作用。

眾所周知，Bax/Bcl-2的變化對細(xì)胞凋亡有顯著影響，一切促進(jìn)或抑制凋亡基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，最終歸結(jié)為Bax/Bcl-2比值的變化。研究表明，ZEA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用是ZEA上調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)，同時下調(diào)促凋亡基因Bcl-2表達(dá)[23-24]；Caspase-8和Caspase-3是Caspase酶家族成員，分別處于Caspase凋亡傳導(dǎo)通路的上、下游。Caspase-8是重要的凋亡啟動因子，而Caspase-3為凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶。ZEA可以通過上調(diào)Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)從而引起子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡[25]，與本試驗結(jié)果一致，說明ZEA能夠通過Caspase-8這條途徑引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對子宮造成損傷，產(chǎn)生生殖毒性。有研究表明，番茄紅素通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，改善線粒體膜電位，減少細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-3的激活，從而減少體外豬胚胎細(xì)胞凋亡[4]；菟絲子黃酮可以通過降低凋亡蛋白Bax，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)抑制平滑肌細(xì)胞的凋亡[26]；泰山磐石散能夠通過降低TNFα-TNFR1信號通路相關(guān)凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-8)來治療流產(chǎn)[27]。本試驗凋亡基因檢測結(jié)果說明3種中藥能夠緩解ZEA引起的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，ZEA可以通過使生殖激素紊亂，子宮細(xì)胞凋亡對孕鼠產(chǎn)生毒性作用，而3種中藥可以緩解其毒性，其中泰山磐石散作用效果最好。