鑒別布魯菌A19疫苗株的雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立與應(yīng)用

董 浩，原 霖，劉 洋，徐 陽，陳亞娜，沈子瑩，梁春南

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102600；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

我國目前使用的布病疫苗主要有布魯菌A19疫苗、布魯菌S2疫苗和布魯菌M5疫苗。其中布魯菌A19疫苗常用于牛的免疫，該疫苗一般采用皮下注射的方式對3～8月齡牛接種，必要時可以1/60的劑量在第1次配種前(18～20月齡)加強(qiáng)免疫，保護(hù)期可以長達(dá)72個月。由于牛種布魯菌毒力較弱，且采用注射免疫的方式疫苗液暴露風(fēng)險低，對防疫人員的安全較高。但是，A19疫苗不能免疫懷孕牛，否則會造成動物流產(chǎn)的嚴(yán)重后果[1-3]。

血清學(xué)檢測方法是動物布病檢測的主要方法，但是現(xiàn)有血清學(xué)檢測方法與大腸桿菌O157和耶爾森菌O9存在交叉反應(yīng)。除此之外，由于我國目前使用的布病疫苗(A19、S2和M5)都具有與野毒株一樣的完整脂多糖結(jié)構(gòu)，所以現(xiàn)有的血清學(xué)檢測方法無法對我國使用的A19布病疫苗的免疫抗體和自然感染抗體進(jìn)行區(qū)分[4]。

和國外的S19疫苗不同，我國使用的布魯菌病A19疫苗并不存在ery操縱子序列的缺失，因此無法使用Bruce-Ladder PCR進(jìn)行鑒別[5]。2020年，WANG等[6]對A19疫苗全基因組序列的測通，使得分析布魯菌A19疫苗株和其他布魯菌基因組水平的差異成為可能。基于這些特異性的差異序列，建立相應(yīng)的熒光定量PCR方法對布魯菌A19疫苗株進(jìn)行鑒別，將對于布病的鑒別診斷和綜合防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與基因組模板羊種布魯菌16M、牛種布魯菌2308、豬種布魯菌1330、犬種布魯菌RM6/66、布魯菌A19疫苗株和布魯菌S2疫苗株的基因組均由國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈；大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；GoTag Probe qPCR Master Mix購自Promega公司；BamHⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶以及T4連接酶購自NEB公司；TE緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；GeneRotex全自動旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀和Gentier 96E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)購自西安天隆科技有限公司；NanoDrop2000購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 引物探針的設(shè)計根據(jù)GenBank公布的羊種布魯菌16M、牛種布魯菌2308、豬種布魯菌1330、犬種布魯菌RM6/66、布魯菌A19疫苗株和布魯菌S2疫苗株基因組序列，針對A19疫苗株特有的缺失序列，設(shè)計了1對特異性引物和1條探針(A19-F、A19-R和A19-Probe)，用于鑒別A19疫苗株與其他布魯菌菌株。參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計的BCSP31特異性引物和探針作為檢測布魯菌的通檢引物和探針(Bru-F、Bru-R和Bru-Probe)。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見表1。

表1 引物和探針序列

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備針對牛種布魯菌A19疫苗株特異性的缺失序列，設(shè)計相應(yīng)的特異性擴(kuò)增引物(表1)。以牛種布魯菌2308株為模板，擴(kuò)增長度為258 bp的目的片段。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min?；厥针娪敬笮≌_的目的擴(kuò)增片段，經(jīng)過BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切后，克隆入pUC19載體。挑取PCR檢測為陽性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。獲得的陽性質(zhì)粒命名為pUC-A19。將含有pUC-A19目的質(zhì)粒的感受態(tài)菌株，使用含有氨芐青霉素的TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用Nanodrop 2000對質(zhì)粒濃度進(jìn)行測定，計算拷貝數(shù)。采用TE緩沖液對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋。

以牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308株為模板，PCR擴(kuò)增布魯菌保守的BCSP31插入序列中長度為856 bp的目的片段，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。回收目的擴(kuò)增片段，經(jīng)過BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切后，克隆入pUC19載體。挑取PCR檢測為陽性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。獲得的陽性質(zhì)粒命名為pUC-BCSP31。將含有pUC-BCSP31目的質(zhì)粒的感受態(tài)菌株，使用含有氨芐青霉素的TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用Nanodrop 2000對質(zhì)粒濃度進(jìn)行測定，計算拷貝數(shù)。采用TE緩沖液對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋。

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化按照GoTag Probe qPCR Master Mix的試劑使用說明書配置20 μL反應(yīng)體系,包括10 μL 2×GoTaq?Probe qPCR Master Mix、引物、探針、模板和水。用矩陣法進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR,篩選引物和探針的最佳搭配濃度。

1.6 特異性試驗分別以大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等滅活細(xì)菌核酸為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 檢測，并設(shè)置1個牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308核酸陽性對照和1個空白對照(水)。同時，分別以羊種布魯菌16M、牛種布魯菌2308、豬種布魯菌1330、犬種布魯菌RM6/66、布魯菌A19疫苗株和布魯菌S2疫苗株滅活細(xì)菌核酸為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測，同時設(shè)置1個空白對照(水)。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別將1.4構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC-BCSP31和pUC-A19做10倍梯度稀釋，模板為濃度是1×106，1×105，1×104，1×103，1×102拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測，用Gentier 96E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)配套軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 敏感性試驗分別將1.4構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC-BCSP31和pUC-A19做10倍梯度稀釋，模板為濃度是1×105，1×104，1×103，1×102，1×101，1×100拷貝/μL的質(zhì)粒，每個稀釋度做3個重復(fù)，進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測，以測定該雙重?zé)晒舛縋CR方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗分別采用濃度為1×106，1×104，1×102拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測，每個濃度的模板分別進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗3次，以評估所建立方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測分別采用建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法，對國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈的92份臨床流產(chǎn)奶牛陰道拭子核酸樣品(對應(yīng)牛的布病血清檢測均為陽性)和本實驗室收集的30份A19疫苗皮下注射免疫(6×1010CFU/頭)的3月齡犢牛血液的核酸樣品進(jìn)行檢測。同時，用現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)》(NY/T 1467-2007)的套式PCR方法和Bruce-Ladder PCR方法對上述樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定以牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308株為模板，PCR擴(kuò)增布魯菌保守的BCSP31插入序列和A19疫苗株缺失序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳后，分別在856，258 bp出現(xiàn)和預(yù)期相符的目的條帶。2種PCR產(chǎn)物回收后分別克隆入pUC19載體，經(jīng)過PCR鑒定和測序分析發(fā)現(xiàn)，2個重組質(zhì)粒(pUC-BCSP31和pUC-A19)構(gòu)建成功。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過體系優(yōu)化，雙重?zé)晒舛縋CR的最佳反應(yīng)體系為GoTaq?Probe qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各 0.6 μL，10 μmol/L的探針各0.6 μL，DNA 模板 2 μL，加入無核酸酶的水補(bǔ)齊 20 μL。

反應(yīng)程序確定為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環(huán)。每個循環(huán)第 2 步，60℃ 1 min，分別收集FAM和VIC熒光信號。

將pUC-BCSP31和pUC-A19標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板，采用優(yōu)化好條件的雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在1×106～1×102拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板時，布魯菌BCSP31通檢熒光的E= 90.954%，R2值為0.997(圖1A)；布魯菌A19疫苗缺失序列熒光的E=101.256，R2值為0.999(圖1B)。

A.使用pUC-BCSP31標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.使用pUC-A19標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗分別以羊種布魯菌16M、牛種布魯菌2308、豬種布魯菌1330、犬種布魯菌RM6/66、布魯菌A19疫苗株、布魯菌S2疫苗株、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的核酸作為模板，同時以ddH2O為陰性對照，采用優(yōu)化好條件的雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，布魯菌A19疫苗株出現(xiàn)1條S型特異性擴(kuò)增曲線(圖2A)，羊種布魯菌16M、牛種布魯菌2308、豬種布魯菌1330、犬種布魯菌RM6/66、布魯菌S2疫苗株出現(xiàn)2條S型特異性擴(kuò)增曲線，受篇幅限制只展示羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M和牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308核酸的擴(kuò)增曲線(圖2B，C)。非布魯菌的其他細(xì)菌核酸樣品均未出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線。

A.A19疫苗株核酸的擴(kuò)增曲線；B.羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M核酸的擴(kuò)增曲線；C.牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308核酸的擴(kuò)增曲線

2.4 敏感性試驗為了測試雙重?zé)晒舛縋CR的敏感性，將pUC-BCSP31和pUC-A19標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板，采用優(yōu)化好條件的雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，布魯菌BCSP31通檢熒光的最低檢測限為1×101拷貝/μL，布魯菌A19疫苗缺失序列熒光的最低檢測限為1×101拷貝/μL(圖3)。

A.a～g分別為1×106～1×100拷貝/μL的pUC-BCSP31標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果；B.1～6分別為1×106～1×100拷貝/μL的pUC-A19標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗分別采用濃度為1×106，1×104，1×102拷貝/μL的2種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)試驗，結(jié)果如表2所示，組內(nèi)和組間的變異系數(shù)(CV)均小于3%，這說明所建立的雙重?zé)晒舛縋CR具有良好的重復(fù)性。

表2 雙重?zé)晒舛縋CR的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗結(jié)果(Ct值)

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果利用建立的雙重?zé)晒舛縋CR對國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈的92份臨床流產(chǎn)奶牛陰道拭子核酸樣品和本實驗室收集的30份A19疫苗注射免疫的犢牛血液的核酸樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，92份臨床流產(chǎn)奶牛陰道拭子樣品，雙重?zé)晒舛縋CR檢出87陽性(均為含有非A19疫苗株的布魯菌核酸，不排除樣品中同時含有A19疫苗株核酸)，套式PCR檢測出53份布魯菌核酸陽性，Bruce-Ladder PCR檢測出11份樣品羊種布魯菌陽性。30份A19疫苗免疫的犢牛血液核酸樣品，雙重?zé)晒舛縋CR檢出8陽性(均為A19疫苗株)，套式PCR檢測出5份布魯菌核酸陽性，Bruce-Ladder PCR檢測出0份布魯菌陽性(表3)。

表3 雙重?zé)晒舛縋CR、套式PCR和Bruce-Ladder PCR檢測臨床樣品的比較

3 討論

由于我國目前使用的A19布病疫苗與我國布病流行株均屬于光滑型布魯菌菌株，使得在使用該疫苗免疫家畜后無法對免疫抗體和自然感染抗體進(jìn)行鑒別診斷。根據(jù)《布魯菌病防治技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定，為了排除疫苗免疫抗體的干擾，接種過A19疫苗的動物，在接種后18個月(豬接種后6個月)才能通過血清學(xué)檢測判定動物是否感染野毒菌株。但是如此長的時間周期顯然不利于盡快剔除群體中的感染動物。

PCR方法是家畜布魯菌病診斷的一種重要方法，在現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)《動物布魯菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646-2018)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)》(NY/T 1467-2007)中分別提供了可用于布魯菌檢測的Bruce-Ladder PCR方法和套式PCR方法。然而，這2種方法都存在一定的缺陷。Bruce-Ladder PCR雖然可以進(jìn)行布魯菌的分型，但是由于該方法敏感性偏低，僅能在分離到布魯菌后才可以應(yīng)用，無法直接應(yīng)用于臨床樣品中布魯菌核酸的檢測，這就極大地限制了該方法的應(yīng)用范圍。而且該方法能夠分型的疫苗株均為國外應(yīng)用的疫苗株，并不適用于我國現(xiàn)有的疫苗株(S2、A19和M5株)的分型。套式PCR雖然敏感性較高(但仍低于熒光定量PCR方法)，可以直接對臨床樣品進(jìn)行檢測，但是該方法只是一種布魯菌的通檢方法，無法進(jìn)行分型和疫苗株的鑒別。因此，迫切需要一種敏感性高并且可以適用于我國疫苗株鑒別診斷的PCR檢測方法。

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，大量布魯菌的全基因組序列被測通和上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，這使得通過比較基因組學(xué)篩選疫苗株特定的檢測靶點成為可能。王姝懿等[8]完成了A19疫苗株的全基因組測序，并進(jìn)行了相關(guān)的比較基因組學(xué)分析。譚鵬飛等[9]運(yùn)用生物信息學(xué)對A19疫苗株的基因組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在A19和S19疫苗株中，ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503這3個SNP位點為這2個菌株的特異性SNP位點，可用于對上述2個菌株進(jìn)行鑒別診斷?；谶@些特異性的SNP位點，研究者們建立了相應(yīng)的A19/S19的鑒別診斷方法。NAN等[10]基于A19和S19菌株特異的SNP位點，建立了相應(yīng)的cycleave PCR鑒別方法，該方法對A19疫苗株核酸的最低檢測限是7.6 fg，對其他布魯菌菌株核酸的最低檢測限是220 fg。

和上述研究相比，本研究同樣也是基于A19疫苗株特有的缺失序列設(shè)計了1套對A19疫苗株進(jìn)行鑒別的引物和探針，配合布魯菌BCSP31通檢引物探針，實現(xiàn)對A19疫苗株的鑒別診斷。而本研究建立的方法最大的優(yōu)點在于僅需使用常規(guī)的TaqMan探針和通用的熒光定量PCR試劑，而不需要像cycleave PCR等方法購買試劑盒，大大降低了試劑成本，更有利于該方法在分子檢測實驗室的應(yīng)用與推廣。

綜上所述，本研究建立了一種可以對布魯菌A19疫苗株進(jìn)行鑒別診斷的雙重?zé)晒舛縋CR方法，敏感性、特異性和重復(fù)性較好，對于臨床樣品檢測效果也明顯優(yōu)于目前我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的套式PCR方法和國家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的Bruce-Ladder PCR方法。因此，該方法可用于臨床家畜組織樣品A19疫苗株與其他布魯菌屬的鑒別檢測，對我國布病的早期診斷和綜合防控具有重要意義。