核酸適配體在生物傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展

林冬冬，程?hào)|慶（通信作者）

（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053）

核酸適配體又稱適配體，在1990 年被首次提出，它是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）篩選得到的一段DNA 或RNA 寡核苷酸單鏈，通過(guò)分子內(nèi)堿基配對(duì)、靜電作用、氫鍵、范德華力等作用折疊形成多種空間結(jié)構(gòu)，能識(shí)別并結(jié)合重金屬離子、抗生素、小分子等靶分子，具有與抗原-抗體反應(yīng)相類似的高度親和性和特異性，被人們稱為“化學(xué)抗體”。與抗體相比，核酸適配體還具有分子量?。? ～15 KD）、靶標(biāo)范圍廣、免疫原性低、穩(wěn)定性好、可人工合成、易修飾、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。生物傳感器是一種以生物元件為基礎(chǔ)的分析裝置，能將定量或定性的生化反應(yīng)信息轉(zhuǎn)化為電信號(hào)或光學(xué)信號(hào)，具有選擇性好、靈敏度高、可在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者以核酸適配體作為識(shí)別分子與多種傳感器相結(jié)合，開發(fā)了一系列適配體傳感器，包括熒光適配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器以及基于納米材料的各類傳統(tǒng)適配體傳感器，能夠?qū)⒏鞣N不同信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的目的，這些適配體傳感器在農(nóng)藥、重金屬、病原微生物、抗生素檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，適配體傳感器作為高效、快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)受到廣泛關(guān)注，其被認(rèn)為是極具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龉ぞ摺１疚木蜔晒膺m配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器以及基于納米材料的適配體傳感器在上述領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

1.熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器通過(guò)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合后熒光值的變化對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，由于天然存在熒光的生物分子在自然界中較少見，通常需要對(duì)適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生可測(cè)的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)。熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)，它是指具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的化合物，當(dāng)受到光照射時(shí)，可躍遷成為激發(fā)態(tài)，而當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，可釋放能量發(fā)出熒光。通過(guò)熒光標(biāo)記技術(shù)將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附到所研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用熒光物質(zhì)的熒光特性從而對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。由于SYBR Green Ⅰ具有靈敏度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是分子檢測(cè)中應(yīng)用最多的DNA 熒光嵌入染料。熒光適配體傳感器具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏性高、穩(wěn)定性好和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域中對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。Yang 等建立了一種適配體-SYBR Ⅰ熒光探針傳感體系用于檢測(cè)牛奶中的四環(huán)素，在最佳條件下，檢出限達(dá)1×10mg/mL。

雖然熒光適配體具有高效、快速、靈敏的檢測(cè)特點(diǎn)，但是熒光背景和熒光壽命都會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性?？紤]到熒光標(biāo)記適配體價(jià)格相對(duì)昂貴以及熒光團(tuán)標(biāo)記易影響適配體與靶物質(zhì)之間的親和力，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就非熒光標(biāo)記適配體傳感器進(jìn)行了廣泛研究。Chen 等以G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)DNA 替換三聯(lián)體DNA 結(jié)構(gòu)構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記型熒光適配體傳感器，寡核苷酸通過(guò)與硫黃素T（Thioflavine T,ThT）結(jié)合形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針（Signal transduction probe,STP）。基于三螺旋分子開關(guān)（Triplehelix molecular switch, THMS），當(dāng)四環(huán)素存在于人血清中時(shí)，四環(huán)素與適配體結(jié)合形成適配體-四環(huán)素復(fù)合物，具有分解THMS 并釋放STP 的功能。游離的STP 組成G-四聯(lián)體與ThT 結(jié)合，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，檢出限低至9.7×10mol/L。Chen 等基于DNA 四臂連接及SYBR Green Ⅰ染料，建立了一種新型的無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器用于牛奶和蜂蜜中氯霉素（chloroamphenicol, CAP）的檢測(cè)。在CAP 不存在時(shí)，CAP 適配體與其互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交，形成雙鏈引物/適配體復(fù)合物。當(dāng)CAP 存在時(shí)，適配體與CAP 進(jìn)行特異性識(shí)別、結(jié)合，從而生成DNA 四臂連接。由于SYBR Green Ⅰ存在于富含堿基對(duì)的DNA 四臂的連接處，因此熒光強(qiáng)度增加。在最佳條件下，CAP 的檢出限為7.2×10mg/mL。Wei 等以黃連素（berberine,Ber）作為熒光探針，通過(guò)Ag+與富含胞嘧啶的適配體特異性結(jié)合，建立了一種基于核酸外切酶輔助熒光背景還原的無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器，用于檢測(cè)自來(lái)水和人血清中的Ag，檢出限達(dá)4.4×10fM。該方法不僅減少了背景干擾并且加強(qiáng)了靶物質(zhì)的相對(duì)熒光強(qiáng)度。適配體芯片是一種新型生物芯片，能夠固定不同的基團(tuán)，根據(jù)探針與靶基因堿基互補(bǔ)結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的高通量分析。通過(guò)將花青素-3（Cyanidin-3, Cy3）、花青素-5（Cyanidin-5,Cy5）等熒光基團(tuán)標(biāo)記在靶物質(zhì)上，熒光基團(tuán)標(biāo)記的靶物質(zhì)與適配體結(jié)合后形成復(fù)合物，熒光掃描儀發(fā)射光源激發(fā)熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)而檢測(cè)適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合情況，應(yīng)用熒光對(duì)適配體響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。然而熒光基團(tuán)會(huì)破壞靶物質(zhì)的構(gòu)象甚至掩蓋結(jié)果，因此，研究者們正在探索新的非熒光標(biāo)記的適配體傳感器。

2.電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)生物傳感器由生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件組成，能夠?qū)⑸锓肿雍桶蟹肿拥慕Y(jié)合過(guò)程轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)分析。常用的生物識(shí)別元件包括抗體、酶和核酸探針，而核酸適配體以其易于修飾、易于保存、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為目前研究最廣的生物識(shí)別元件之一，并與電化學(xué)生物傳感器合用，形成電化學(xué)適配體傳感器。近年來(lái)，電化學(xué)適配體傳感器是適配體傳感器中研究最廣、發(fā)展最快的一類。

Nie 等開發(fā)了一種基于核酸酶信號(hào)循環(huán)放大的高親和力截短型電化學(xué)適配體傳感器，對(duì)牛奶和水樣中的妥布霉素進(jìn)行特異性檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)5.13×10mol/L。2021 年，Taghdisi 等以雙標(biāo)記適配體作為檢測(cè)元件，亞甲藍(lán)為氧化還原劑，開發(fā)了一種新型電化學(xué)檢測(cè)方法，以亞甲藍(lán)電信號(hào)變化來(lái)檢測(cè)人血清、牛奶、自來(lái)水中環(huán)丙沙星的含量，在最佳測(cè)試條件下，環(huán)丙沙星的檢出限達(dá)1×10mol/L。此外，新型電化學(xué)檢測(cè)器件具有提高靈敏度的作用。Zhang 等基于微型集成電路芯片，開發(fā)了一種針對(duì)4 種高毒性有機(jī)磷農(nóng)藥（丙溴磷、水胺硫磷、氧樂果和甲拌磷）的廣譜適配傳感器，無(wú)需額外預(yù)處理即可測(cè)定水溶液中的目標(biāo)分子，且具有良好的特異性，檢測(cè)限達(dá)（0.24 ～1.67）fM。電化學(xué)適配體傳感器具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本較低、便于攜帶等特點(diǎn)，是一個(gè)極具發(fā)展能力的分析工具，但其檢測(cè)結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)條件和周圍環(huán)境的干擾，對(duì)于標(biāo)本預(yù)處理十分必要。因此，如何更快更有效的降低電化學(xué)適配體傳感器所受干擾，將其應(yīng)用于更多領(lǐng)域，有待深入研究。

3.基于納米材料的適配體傳感器

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于納米材料的適配體傳感器也得到不斷發(fā)展。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍內(nèi)（1 ～100 nm）或其作為基本單元構(gòu)成的材料。由于納米材料結(jié)構(gòu)特殊、尺寸小，因而具有小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)、高反應(yīng)活性等。近年來(lái)，量子點(diǎn)、碳點(diǎn)、金納米顆粒（gold nanoparticles,AuNPs）、銀納米顆粒（silver nanoparticles, AgNPs）等納米材料被應(yīng)用到比色、熒光、電化學(xué)適配體傳感器中，基于納米材料的適配體傳感器極大提高了對(duì)目標(biāo)分子檢測(cè)的特異性、靈敏度以及準(zhǔn)確性。

3.1 基于納米材料的比色適配體傳感器

比色法具有可用肉眼直接觀察、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備和易于實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)，將比色法與適配體傳感器結(jié)合形成比色適配體傳感器。比色適配體傳感器是一種將目標(biāo)信號(hào)轉(zhuǎn)化為顏色變化，用于檢測(cè)靶物質(zhì)的適配體傳感器，具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于觀察、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前，常用的比色法主要是AuNPs、AgNPs 等納米材料聚集或分散引起的顏色變化來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀判定。Abnous 等將適體互補(bǔ)鏈和雙鏈脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu)組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)組裝在AuNPs 上，當(dāng)人血清樣品中存在馬拉硫磷時(shí)，互補(bǔ)鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被釋放，顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，最低檢出限為1×10mol/L?；贏uNPs 的比色法應(yīng)用較為普遍，但研究表明，AgNPs 的消光系數(shù)大于AuNPs，能夠檢測(cè)較低濃度的特定DNA 序列，具有更高的靈敏度和可見度。Bala 等使用適配體、陽(yáng)離子肽和AgNPs 對(duì)水和食品樣品中的馬拉硫磷進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)離子肽通過(guò)靜電相互作用將帶負(fù)電荷的AgNPs 聚集，顏色由黃色變?yōu)槌壬?。該方法具有?yōu)異的選擇性并且最低檢出限低至0.5×10mol/L?？紤]到一種物質(zhì)上可能存在多種農(nóng)藥，Liu 等建立了基于廣譜適配體的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留比色檢測(cè)方法，對(duì)不同類型的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行初步篩查，并解決了高通量檢測(cè)農(nóng)藥殘留的問題。此外，Yang 等采用捕獲-選擇電極法（Capture-SELEX）篩選出與1-氯氟氰菊酯農(nóng)藥結(jié)合的適體LCT-1，l-氯氟氰菊酯可截短適體LCT-1 序列獲得LCT-1-39，該團(tuán)隊(duì)利用LCT-1 和LCT-1-39 作為識(shí)別分子，首次建立了檢測(cè)l-氯氟氰菊酯的比色適體傳感器，最低檢測(cè)限分別為0.019 7 mg/mL 和0.018 6 mg/mL。Sun 等以適體共軛磁性納米顆粒為探針，基于G-四聯(lián)體脫氧核酶建立了比色適配體傳感器。當(dāng)鮭魚樣本中存在副溶血弧菌時(shí)，適配體與副溶血弧菌結(jié)合，其互補(bǔ)鏈與氯高鐵血紅素構(gòu)成G-四聯(lián)體，導(dǎo)致溶液中的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫被催化為藍(lán)色，進(jìn)而檢測(cè)副溶血弧菌含量。Tao Z 等將石墨烯/FeO-AuNPs 作為酶模擬物，Pb的適配體修飾于胺磁珠表面。當(dāng)自來(lái)水中存在Pb時(shí)，通過(guò)磁分離將適配體-Pb復(fù)合物去除，適配體的互補(bǔ)鏈吸附于石墨烯/FeO-AuNPs 復(fù)合材料表面，抑制催化活性與顯色反應(yīng)，Pb的濃度與溶液顏色成反比，最低檢出限達(dá)6.3×10mg/mL。2021 年，Liu 等將適配體嵌于亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾DNA 結(jié)構(gòu)中，當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，鉑納米顆粒催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺-HO產(chǎn)生比色反應(yīng)，進(jìn)一步提高了比色法檢測(cè)的靈敏度，牛奶中卡那霉素的檢出限低至0.2×10mg/mL?；诩{米材料的比色適配體傳感器具有快速篩查的優(yōu)勢(shì)，而基于模擬酶或各種酶催化顯色反應(yīng)的比色適配體傳感器，不僅可直接肉眼查看檢測(cè)結(jié)果還能提高檢測(cè)的靈敏度，因此將其與基于納米材料的比色適配體傳感器進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用是目前的研究方向。

3.2 基于納米材料的熒光適配體傳感器

近年來(lái)，基于納米材料的熒光適配體傳感器得到了快速發(fā)展。YI 等建立了適配體-納米金-SYBR GreenⅠ熒光探針體系，基于熒光嵌入劑SYBR Green Ⅰ對(duì)的自來(lái)水、河水和人工尿液中氧氟沙星（ofloxacin, OFL）的殘留進(jìn)行檢測(cè)，SYBR Green Ⅰ是一種選擇性嵌入染料，能與DNA 結(jié)合并增強(qiáng)熒光值。如果OFL 存在時(shí)，OFL 將與其適體結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致OFL 適體結(jié)構(gòu)改變，SYBR Green Ⅰ從OFL 適體釋放到溶液中，進(jìn)而使SYBR Green Ⅰ的熒光值下降。熒光強(qiáng)度在1.1 ～200.0 nm 的氧氟沙星濃度范圍內(nèi)呈線性下降，檢出限達(dá)0.34 nmol/L。Saberi 等以西曲溴銨為原料，通過(guò)水熱法合成具有藍(lán)色熒光的陽(yáng)離子碳點(diǎn)。當(dāng)（加標(biāo)）廢水、自來(lái)水和番茄中存在啶蟲脒時(shí)，適配體由于靜電吸附于碳點(diǎn)表面并與啶蟲脒結(jié)合，熒光強(qiáng)度隨啶蟲脒濃度成比例增加。該傳感器具有較高的靈敏度，檢出限達(dá)0.3×10mol/L。隨著我國(guó)的環(huán)保意識(shí)不斷加強(qiáng)，非標(biāo)記型熒光適配體傳感器也在不斷發(fā)展。Fan 等以富含AT 的雙鏈DNA 模板與銅納米顆粒結(jié)合作為熒光探針，建立了一種用于啶蟲脒檢測(cè)的無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶熒光適配體傳感器。當(dāng)蘋果和生姜樣品中存在啶蟲脒時(shí)，適配體可與啶蟲脒形成靶適配體復(fù)合物并與另一條鏈雜交形成富含AT 的dsDNA（AT-rich dsDNA）。當(dāng)AT-rich dsDNA 與Cu和抗壞血酸相互作用時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，該方法的檢出限低至2.37×10mol/L。值得一提的是，Zhu 等基于氧化石墨烯的信息計(jì)算、編碼、加密等系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)熒光適配體傳感器，用于檢測(cè)魚類病原體嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌。以氧化石墨烯作為鎖，靶標(biāo)病原體作為公共密鑰，適配體與病原菌結(jié)合作為加密密鑰，進(jìn)而對(duì)適配體進(jìn)行編碼或解碼，拓寬了分子水平上多功能器件或機(jī)器的發(fā)展。2021 年，Wang 等基于適配體與金屬有機(jī)框架制備了一種分子印跡傳感器，將病毒適配體修飾于識(shí)別載體表面，并通過(guò)硅酸四乙酯自聚合進(jìn)行表面印跡，檢測(cè)限低至1.8×10mol/L。該方法以雙重識(shí)別和比率熒光測(cè)定來(lái)降低環(huán)境干擾，提高傳感器的抗干擾能力，進(jìn)一步推動(dòng)了分子印跡技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用?；诩{米材料的熒光適配體傳感器與比色適配體傳感器在檢測(cè)特點(diǎn)上相似，雖能進(jìn)行快速、靈敏的測(cè)定，但易受檢測(cè)體系中共存物的干擾，影響測(cè)定結(jié)果的可靠性，因此降低環(huán)境對(duì)檢測(cè)的干擾，將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于生物傳感器以及將多功能器件或機(jī)器與基于納米材料熒光適配體傳感器結(jié)合應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

3.3 基于納米材料的電化學(xué)適配體傳感器

基于納米材料的電化學(xué)適配體傳感器具有易于操作、靈敏度高、易微型化等特點(diǎn)，目前也廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。Wang 等基于磁性納米顆粒對(duì)牛奶中大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)尿素酶使阻抗信號(hào)的放大并用印刷電路板金電極進(jìn)行測(cè)量，用適配體和尿素酶修飾AuNPs 并注入捕獲免疫多克隆抗體的毛細(xì)管中與大腸桿菌O157:H7進(jìn)行結(jié)合形成MNP-抗體-細(xì)菌-適體-GNP-脲酶復(fù)合物，催化毛細(xì)管中尿素水解，根據(jù)鍍金印刷電路板電極檢測(cè)大腸桿菌O157:H7。Roushani 等基于AgNPs/3-氨基甲基吡啶功能化氧化石墨烯/玻碳電極構(gòu)建了適配體分子印跡傳感膜，通過(guò)適配體與CAP 結(jié)合形成的氧化電流信號(hào)變化，對(duì)牛奶中的CAP 進(jìn)行檢測(cè)且檢出限達(dá)3×10mol/L。Xie 等開發(fā)了一種基于AuNPs/鉑納米顆粒-碳納米纖維/碳離子液體電極復(fù)合材料的電化學(xué)適配體傳感器，用于檢測(cè)飲用水中Hg的濃度，檢測(cè)限為3.33×10mol/L。YI 等基于三維納米多孔電極制備了一種新型無(wú)標(biāo)記電化學(xué)適配傳感器，用于檢測(cè)茶葉中啶蟲脒殘留，檢出限達(dá)71.2 fM。電化學(xué)適配體傳感器在完成檢測(cè)后，目標(biāo)分子容易使電極表面發(fā)生鈍化現(xiàn)象，影響二次使用。為了解決這一問題，F(xiàn)u 等基于疏水電極和磁性納米復(fù)合材料開發(fā)了一種可刷新電化學(xué)適配體傳感器，合成的氧化石墨烯-四氧化三鐵磁性納米復(fù)合材料與適配體結(jié)合可定性檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥。由聚二甲基硅氧烷修飾絲網(wǎng)印刷碳電極而制成的疏水電極可避免分子吸附于電極表面，實(shí)現(xiàn)電極的重復(fù)使用?；诩{米材料的電化學(xué)適配體傳感器可實(shí)現(xiàn)高靈敏度、強(qiáng)選擇性的檢測(cè)，但其穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步提高。

4.小結(jié)與展望

熒光適配體傳感器和比色適配體傳感器易受到檢測(cè)體系中共存物的干擾，電化學(xué)適配體傳感器也易受環(huán)境干擾。但由于適配體傳感器的應(yīng)用對(duì)我們的健康、環(huán)境、食品等領(lǐng)域帶來(lái)巨大保障，因此非熒光標(biāo)記適配體傳感器與芯片相結(jié)合的應(yīng)用以及降低環(huán)境對(duì)檢測(cè)干擾的方法將會(huì)成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。此外，基于模擬酶或各種酶催化顯色反應(yīng)的比色適配體傳感器與納米材料結(jié)合應(yīng)用，不僅可直接肉眼查看檢測(cè)結(jié)果，還能提高檢測(cè)的靈敏度。目前，基于納米材料的適配體傳感器研究較為廣泛，對(duì)檢測(cè)選擇性、靈敏度帶來(lái)一定提升，但仍存在檢測(cè)穩(wěn)定性不高、易受干擾等不足?；诩{米材料的適配體傳感器具有巨大潛力，是未來(lái)發(fā)展的重要方向。