• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    核酸適配體在生物傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展

    2022-11-11 09:47:32林冬冬程?hào)|慶通信作者
    醫(yī)藥前沿 2022年10期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    林冬冬,程?hào)|慶(通信作者)

    (浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053)

    核酸適配體又稱適配體,在1990 年被首次提出,它是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選得到的一段DNA 或RNA 寡核苷酸單鏈,通過(guò)分子內(nèi)堿基配對(duì)、靜電作用、氫鍵、范德華力等作用折疊形成多種空間結(jié)構(gòu),能識(shí)別并結(jié)合重金屬離子、抗生素、小分子等靶分子,具有與抗原-抗體反應(yīng)相類似的高度親和性和特異性,被人們稱為“化學(xué)抗體”。與抗體相比,核酸適配體還具有分子量?。? ~15 KD)、靶標(biāo)范圍廣、免疫原性低、穩(wěn)定性好、可人工合成、易修飾、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。生物傳感器是一種以生物元件為基礎(chǔ)的分析裝置,能將定量或定性的生化反應(yīng)信息轉(zhuǎn)化為電信號(hào)或光學(xué)信號(hào),具有選擇性好、靈敏度高、可在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者以核酸適配體作為識(shí)別分子與多種傳感器相結(jié)合,開發(fā)了一系列適配體傳感器,包括熒光適配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器以及基于納米材料的各類傳統(tǒng)適配體傳感器,能夠?qū)⒏鞣N不同信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,從而達(dá)到檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的目的,這些適配體傳感器在農(nóng)藥、重金屬、病原微生物、抗生素檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前,適配體傳感器作為高效、快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)受到廣泛關(guān)注,其被認(rèn)為是極具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龉ぞ摺1疚木蜔晒膺m配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器以及基于納米材料的適配體傳感器在上述領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

    1.熒光適配體傳感器

    熒光適配體傳感器通過(guò)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合后熒光值的變化對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè),由于天然存在熒光的生物分子在自然界中較少見,通常需要對(duì)適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記,產(chǎn)生可測(cè)的熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)。熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì),它是指具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的化合物,當(dāng)受到光照射時(shí),可躍遷成為激發(fā)態(tài),而當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí),可釋放能量發(fā)出熒光。通過(guò)熒光標(biāo)記技術(shù)將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附到所研究分子的某個(gè)基團(tuán)上,利用熒光物質(zhì)的熒光特性從而對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。由于SYBR Green Ⅰ具有靈敏度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),是分子檢測(cè)中應(yīng)用最多的DNA 熒光嵌入染料。熒光適配體傳感器具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏性高、穩(wěn)定性好和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域中對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。Yang 等建立了一種適配體-SYBR Ⅰ熒光探針傳感體系用于檢測(cè)牛奶中的四環(huán)素,在最佳條件下,檢出限達(dá)1×10mg/mL。

    雖然熒光適配體具有高效、快速、靈敏的檢測(cè)特點(diǎn),但是熒光背景和熒光壽命都會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性??紤]到熒光標(biāo)記適配體價(jià)格相對(duì)昂貴以及熒光團(tuán)標(biāo)記易影響適配體與靶物質(zhì)之間的親和力,國(guó)內(nèi)外學(xué)者就非熒光標(biāo)記適配體傳感器進(jìn)行了廣泛研究。Chen 等以G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)DNA 替換三聯(lián)體DNA 結(jié)構(gòu)構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記型熒光適配體傳感器,寡核苷酸通過(guò)與硫黃素T(Thioflavine T,ThT)結(jié)合形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針(Signal transduction probe,STP)。基于三螺旋分子開關(guān)(Triplehelix molecular switch, THMS),當(dāng)四環(huán)素存在于人血清中時(shí),四環(huán)素與適配體結(jié)合形成適配體-四環(huán)素復(fù)合物,具有分解THMS 并釋放STP 的功能。游離的STP 組成G-四聯(lián)體與ThT 結(jié)合,產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光,檢出限低至9.7×10mol/L。Chen 等基于DNA 四臂連接及SYBR Green Ⅰ染料,建立了一種新型的無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器用于牛奶和蜂蜜中氯霉素(chloroamphenicol, CAP)的檢測(cè)。在CAP 不存在時(shí),CAP 適配體與其互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交,形成雙鏈引物/適配體復(fù)合物。當(dāng)CAP 存在時(shí),適配體與CAP 進(jìn)行特異性識(shí)別、結(jié)合,從而生成DNA 四臂連接。由于SYBR Green Ⅰ存在于富含堿基對(duì)的DNA 四臂的連接處,因此熒光強(qiáng)度增加。在最佳條件下,CAP 的檢出限為7.2×10mg/mL。Wei 等以黃連素(berberine,Ber)作為熒光探針,通過(guò)Ag+與富含胞嘧啶的適配體特異性結(jié)合,建立了一種基于核酸外切酶輔助熒光背景還原的無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器,用于檢測(cè)自來(lái)水和人血清中的Ag,檢出限達(dá)4.4×10fM。該方法不僅減少了背景干擾并且加強(qiáng)了靶物質(zhì)的相對(duì)熒光強(qiáng)度。適配體芯片是一種新型生物芯片,能夠固定不同的基團(tuán),根據(jù)探針與靶基因堿基互補(bǔ)結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的高通量分析。通過(guò)將花青素-3(Cyanidin-3, Cy3)、花青素-5(Cyanidin-5,Cy5)等熒光基團(tuán)標(biāo)記在靶物質(zhì)上,熒光基團(tuán)標(biāo)記的靶物質(zhì)與適配體結(jié)合后形成復(fù)合物,熒光掃描儀發(fā)射光源激發(fā)熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)而檢測(cè)適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合情況,應(yīng)用熒光對(duì)適配體響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。然而熒光基團(tuán)會(huì)破壞靶物質(zhì)的構(gòu)象甚至掩蓋結(jié)果,因此,研究者們正在探索新的非熒光標(biāo)記的適配體傳感器。

    2.電化學(xué)適配體傳感器

    電化學(xué)生物傳感器由生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件組成,能夠?qū)⑸锓肿雍桶蟹肿拥慕Y(jié)合過(guò)程轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的電信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)分析。常用的生物識(shí)別元件包括抗體、酶和核酸探針,而核酸適配體以其易于修飾、易于保存、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn),已成為目前研究最廣的生物識(shí)別元件之一,并與電化學(xué)生物傳感器合用,形成電化學(xué)適配體傳感器。近年來(lái),電化學(xué)適配體傳感器是適配體傳感器中研究最廣、發(fā)展最快的一類。

    Nie 等開發(fā)了一種基于核酸酶信號(hào)循環(huán)放大的高親和力截短型電化學(xué)適配體傳感器,對(duì)牛奶和水樣中的妥布霉素進(jìn)行特異性檢測(cè),檢測(cè)限達(dá)5.13×10mol/L。2021 年,Taghdisi 等以雙標(biāo)記適配體作為檢測(cè)元件,亞甲藍(lán)為氧化還原劑,開發(fā)了一種新型電化學(xué)檢測(cè)方法,以亞甲藍(lán)電信號(hào)變化來(lái)檢測(cè)人血清、牛奶、自來(lái)水中環(huán)丙沙星的含量,在最佳測(cè)試條件下,環(huán)丙沙星的檢出限達(dá)1×10mol/L。此外,新型電化學(xué)檢測(cè)器件具有提高靈敏度的作用。Zhang 等基于微型集成電路芯片,開發(fā)了一種針對(duì)4 種高毒性有機(jī)磷農(nóng)藥(丙溴磷、水胺硫磷、氧樂果和甲拌磷)的廣譜適配傳感器,無(wú)需額外預(yù)處理即可測(cè)定水溶液中的目標(biāo)分子,且具有良好的特異性,檢測(cè)限達(dá)(0.24 ~1.67)fM。電化學(xué)適配體傳感器具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本較低、便于攜帶等特點(diǎn),是一個(gè)極具發(fā)展能力的分析工具,但其檢測(cè)結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)條件和周圍環(huán)境的干擾,對(duì)于標(biāo)本預(yù)處理十分必要。因此,如何更快更有效的降低電化學(xué)適配體傳感器所受干擾,將其應(yīng)用于更多領(lǐng)域,有待深入研究。

    3.基于納米材料的適配體傳感器

    隨著納米技術(shù)的發(fā)展,基于納米材料的適配體傳感器也得到不斷發(fā)展。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍內(nèi)(1 ~100 nm)或其作為基本單元構(gòu)成的材料。由于納米材料結(jié)構(gòu)特殊、尺寸小,因而具有小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)、高反應(yīng)活性等。近年來(lái),量子點(diǎn)、碳點(diǎn)、金納米顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)、銀納米顆粒(silver nanoparticles, AgNPs)等納米材料被應(yīng)用到比色、熒光、電化學(xué)適配體傳感器中,基于納米材料的適配體傳感器極大提高了對(duì)目標(biāo)分子檢測(cè)的特異性、靈敏度以及準(zhǔn)確性。

    3.1 基于納米材料的比色適配體傳感器

    比色法具有可用肉眼直接觀察、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備和易于實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn),將比色法與適配體傳感器結(jié)合形成比色適配體傳感器。比色適配體傳感器是一種將目標(biāo)信號(hào)轉(zhuǎn)化為顏色變化,用于檢測(cè)靶物質(zhì)的適配體傳感器,具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于觀察、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前,常用的比色法主要是AuNPs、AgNPs 等納米材料聚集或分散引起的顏色變化來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀判定。Abnous 等將適體互補(bǔ)鏈和雙鏈脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu)組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)組裝在AuNPs 上,當(dāng)人血清樣品中存在馬拉硫磷時(shí),互補(bǔ)鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被釋放,顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色,最低檢出限為1×10mol/L?;贏uNPs 的比色法應(yīng)用較為普遍,但研究表明,AgNPs 的消光系數(shù)大于AuNPs,能夠檢測(cè)較低濃度的特定DNA 序列,具有更高的靈敏度和可見度。Bala 等使用適配體、陽(yáng)離子肽和AgNPs 對(duì)水和食品樣品中的馬拉硫磷進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)離子肽通過(guò)靜電相互作用將帶負(fù)電荷的AgNPs 聚集,顏色由黃色變?yōu)槌壬?。該方法具有?yōu)異的選擇性并且最低檢出限低至0.5×10mol/L??紤]到一種物質(zhì)上可能存在多種農(nóng)藥,Liu 等建立了基于廣譜適配體的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留比色檢測(cè)方法,對(duì)不同類型的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行初步篩查,并解決了高通量檢測(cè)農(nóng)藥殘留的問題。此外,Yang 等采用捕獲-選擇電極法(Capture-SELEX)篩選出與1-氯氟氰菊酯農(nóng)藥結(jié)合的適體LCT-1,l-氯氟氰菊酯可截短適體LCT-1 序列獲得LCT-1-39,該團(tuán)隊(duì)利用LCT-1 和LCT-1-39 作為識(shí)別分子,首次建立了檢測(cè)l-氯氟氰菊酯的比色適體傳感器,最低檢測(cè)限分別為0.019 7 mg/mL 和0.018 6 mg/mL。Sun 等以適體共軛磁性納米顆粒為探針,基于G-四聯(lián)體脫氧核酶建立了比色適配體傳感器。當(dāng)鮭魚樣本中存在副溶血弧菌時(shí),適配體與副溶血弧菌結(jié)合,其互補(bǔ)鏈與氯高鐵血紅素構(gòu)成G-四聯(lián)體,導(dǎo)致溶液中的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫被催化為藍(lán)色,進(jìn)而檢測(cè)副溶血弧菌含量。Tao Z 等將石墨烯/FeO-AuNPs 作為酶模擬物,Pb的適配體修飾于胺磁珠表面。當(dāng)自來(lái)水中存在Pb時(shí),通過(guò)磁分離將適配體-Pb復(fù)合物去除,適配體的互補(bǔ)鏈吸附于石墨烯/FeO-AuNPs 復(fù)合材料表面,抑制催化活性與顯色反應(yīng),Pb的濃度與溶液顏色成反比,最低檢出限達(dá)6.3×10mg/mL。2021 年,Liu 等將適配體嵌于亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾DNA 結(jié)構(gòu)中,當(dāng)卡那霉素存在時(shí),鉑納米顆粒催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺-HO產(chǎn)生比色反應(yīng),進(jìn)一步提高了比色法檢測(cè)的靈敏度,牛奶中卡那霉素的檢出限低至0.2×10mg/mL?;诩{米材料的比色適配體傳感器具有快速篩查的優(yōu)勢(shì),而基于模擬酶或各種酶催化顯色反應(yīng)的比色適配體傳感器,不僅可直接肉眼查看檢測(cè)結(jié)果還能提高檢測(cè)的靈敏度,因此將其與基于納米材料的比色適配體傳感器進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用是目前的研究方向。

    3.2 基于納米材料的熒光適配體傳感器

    近年來(lái),基于納米材料的熒光適配體傳感器得到了快速發(fā)展。YI 等建立了適配體-納米金-SYBR GreenⅠ熒光探針體系,基于熒光嵌入劑SYBR Green Ⅰ對(duì)的自來(lái)水、河水和人工尿液中氧氟沙星(ofloxacin, OFL)的殘留進(jìn)行檢測(cè),SYBR Green Ⅰ是一種選擇性嵌入染料,能與DNA 結(jié)合并增強(qiáng)熒光值。如果OFL 存在時(shí),OFL 將與其適體結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物,導(dǎo)致OFL 適體結(jié)構(gòu)改變,SYBR Green Ⅰ從OFL 適體釋放到溶液中,進(jìn)而使SYBR Green Ⅰ的熒光值下降。熒光強(qiáng)度在1.1 ~200.0 nm 的氧氟沙星濃度范圍內(nèi)呈線性下降,檢出限達(dá)0.34 nmol/L。Saberi 等以西曲溴銨為原料,通過(guò)水熱法合成具有藍(lán)色熒光的陽(yáng)離子碳點(diǎn)。當(dāng)(加標(biāo))廢水、自來(lái)水和番茄中存在啶蟲脒時(shí),適配體由于靜電吸附于碳點(diǎn)表面并與啶蟲脒結(jié)合,熒光強(qiáng)度隨啶蟲脒濃度成比例增加。該傳感器具有較高的靈敏度,檢出限達(dá)0.3×10mol/L。隨著我國(guó)的環(huán)保意識(shí)不斷加強(qiáng),非標(biāo)記型熒光適配體傳感器也在不斷發(fā)展。Fan 等以富含AT 的雙鏈DNA 模板與銅納米顆粒結(jié)合作為熒光探針,建立了一種用于啶蟲脒檢測(cè)的無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶熒光適配體傳感器。當(dāng)蘋果和生姜樣品中存在啶蟲脒時(shí),適配體可與啶蟲脒形成靶適配體復(fù)合物并與另一條鏈雜交形成富含AT 的dsDNA(AT-rich dsDNA)。當(dāng)AT-rich dsDNA 與Cu和抗壞血酸相互作用時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光,該方法的檢出限低至2.37×10mol/L。值得一提的是,Zhu 等基于氧化石墨烯的信息計(jì)算、編碼、加密等系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)熒光適配體傳感器,用于檢測(cè)魚類病原體嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌。以氧化石墨烯作為鎖,靶標(biāo)病原體作為公共密鑰,適配體與病原菌結(jié)合作為加密密鑰,進(jìn)而對(duì)適配體進(jìn)行編碼或解碼,拓寬了分子水平上多功能器件或機(jī)器的發(fā)展。2021 年,Wang 等基于適配體與金屬有機(jī)框架制備了一種分子印跡傳感器,將病毒適配體修飾于識(shí)別載體表面,并通過(guò)硅酸四乙酯自聚合進(jìn)行表面印跡,檢測(cè)限低至1.8×10mol/L。該方法以雙重識(shí)別和比率熒光測(cè)定來(lái)降低環(huán)境干擾,提高傳感器的抗干擾能力,進(jìn)一步推動(dòng)了分子印跡技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用?;诩{米材料的熒光適配體傳感器與比色適配體傳感器在檢測(cè)特點(diǎn)上相似,雖能進(jìn)行快速、靈敏的測(cè)定,但易受檢測(cè)體系中共存物的干擾,影響測(cè)定結(jié)果的可靠性,因此降低環(huán)境對(duì)檢測(cè)的干擾,將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于生物傳感器以及將多功能器件或機(jī)器與基于納米材料熒光適配體傳感器結(jié)合應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

    3.3 基于納米材料的電化學(xué)適配體傳感器

    基于納米材料的電化學(xué)適配體傳感器具有易于操作、靈敏度高、易微型化等特點(diǎn),目前也廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。Wang 等基于磁性納米顆粒對(duì)牛奶中大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)尿素酶使阻抗信號(hào)的放大并用印刷電路板金電極進(jìn)行測(cè)量,用適配體和尿素酶修飾AuNPs 并注入捕獲免疫多克隆抗體的毛細(xì)管中與大腸桿菌O157:H7進(jìn)行結(jié)合形成MNP-抗體-細(xì)菌-適體-GNP-脲酶復(fù)合物,催化毛細(xì)管中尿素水解,根據(jù)鍍金印刷電路板電極檢測(cè)大腸桿菌O157:H7。Roushani 等基于AgNPs/3-氨基甲基吡啶功能化氧化石墨烯/玻碳電極構(gòu)建了適配體分子印跡傳感膜,通過(guò)適配體與CAP 結(jié)合形成的氧化電流信號(hào)變化,對(duì)牛奶中的CAP 進(jìn)行檢測(cè)且檢出限達(dá)3×10mol/L。Xie 等開發(fā)了一種基于AuNPs/鉑納米顆粒-碳納米纖維/碳離子液體電極復(fù)合材料的電化學(xué)適配體傳感器,用于檢測(cè)飲用水中Hg的濃度,檢測(cè)限為3.33×10mol/L。YI 等基于三維納米多孔電極制備了一種新型無(wú)標(biāo)記電化學(xué)適配傳感器,用于檢測(cè)茶葉中啶蟲脒殘留,檢出限達(dá)71.2 fM。電化學(xué)適配體傳感器在完成檢測(cè)后,目標(biāo)分子容易使電極表面發(fā)生鈍化現(xiàn)象,影響二次使用。為了解決這一問題,F(xiàn)u 等基于疏水電極和磁性納米復(fù)合材料開發(fā)了一種可刷新電化學(xué)適配體傳感器,合成的氧化石墨烯-四氧化三鐵磁性納米復(fù)合材料與適配體結(jié)合可定性檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥。由聚二甲基硅氧烷修飾絲網(wǎng)印刷碳電極而制成的疏水電極可避免分子吸附于電極表面,實(shí)現(xiàn)電極的重復(fù)使用?;诩{米材料的電化學(xué)適配體傳感器可實(shí)現(xiàn)高靈敏度、強(qiáng)選擇性的檢測(cè),但其穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步提高。

    4.小結(jié)與展望

    熒光適配體傳感器和比色適配體傳感器易受到檢測(cè)體系中共存物的干擾,電化學(xué)適配體傳感器也易受環(huán)境干擾。但由于適配體傳感器的應(yīng)用對(duì)我們的健康、環(huán)境、食品等領(lǐng)域帶來(lái)巨大保障,因此非熒光標(biāo)記適配體傳感器與芯片相結(jié)合的應(yīng)用以及降低環(huán)境對(duì)檢測(cè)干擾的方法將會(huì)成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。此外,基于模擬酶或各種酶催化顯色反應(yīng)的比色適配體傳感器與納米材料結(jié)合應(yīng)用,不僅可直接肉眼查看檢測(cè)結(jié)果,還能提高檢測(cè)的靈敏度。目前,基于納米材料的適配體傳感器研究較為廣泛,對(duì)檢測(cè)選擇性、靈敏度帶來(lái)一定提升,但仍存在檢測(cè)穩(wěn)定性不高、易受干擾等不足?;诩{米材料的適配體傳感器具有巨大潛力,是未來(lái)發(fā)展的重要方向。

    猜你喜歡
    檢測(cè)
    QC 檢測(cè)
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測(cè)題
    “有理數(shù)”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    亚洲成a人片在线一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 日韩三级视频一区二区三区| 久久久久精品人妻al黑| av视频免费观看在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品久久久精品久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 动漫黄色视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品国产高清国产av | 亚洲五月婷婷丁香| 欧美精品一区二区大全| 男女边摸边吃奶| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 日本wwww免费看| 国产麻豆69| 99热国产这里只有精品6| 高清av免费在线| 日韩大片免费观看网站| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 免费不卡黄色视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品欧美一区二区三区在线| 2018国产大陆天天弄谢| 成人18禁在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲专区字幕在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 97在线人人人人妻| 精品一区二区三卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产在线一区二区三区精| 亚洲国产看品久久| 亚洲精品美女久久av网站| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 精品第一国产精品| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲国产欧美网| 久久精品国产综合久久久| 最新美女视频免费是黄的| av国产精品久久久久影院| 午夜福利视频精品| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 丰满少妇做爰视频| 一级毛片精品| 香蕉久久夜色| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 激情在线观看视频在线高清 | 日本黄色视频三级网站网址 | 两个人免费观看高清视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| av超薄肉色丝袜交足视频| 一进一出抽搐动态| 高清av免费在线| 国产精品电影一区二区三区 | 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品二区激情视频| 一夜夜www| 成人黄色视频免费在线看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 无遮挡黄片免费观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久影院123| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 妹子高潮喷水视频| 三上悠亚av全集在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品91无色码中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 精品国产国语对白av| 久久热在线av| 午夜激情久久久久久久| 久久热在线av| 欧美乱码精品一区二区三区| 99香蕉大伊视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 大片免费播放器 马上看| 18在线观看网站| 欧美在线黄色| 热re99久久国产66热| 亚洲av国产av综合av卡| 免费看a级黄色片| 怎么达到女性高潮| 久久亚洲真实| 午夜免费成人在线视频| 我的亚洲天堂| av超薄肉色丝袜交足视频| 色在线成人网| 一级毛片女人18水好多| 电影成人av| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品91无色码中文字幕| 在线观看人妻少妇| 脱女人内裤的视频| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 一二三四在线观看免费中文在| 十分钟在线观看高清视频www| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 大码成人一级视频| 90打野战视频偷拍视频| 另类精品久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 曰老女人黄片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 在线观看舔阴道视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费高清在线观看日韩| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 青草久久国产| 1024香蕉在线观看| 国产精品免费视频内射| 久久久国产一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜福利视频在线观看免费| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产免费av片在线观看野外av| a级片在线免费高清观看视频| 成人免费观看视频高清| 99在线人妻在线中文字幕 | av欧美777| 日韩视频在线欧美| 另类亚洲欧美激情| 女同久久另类99精品国产91| 欧美大码av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲第一青青草原| 久久久精品区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品亚洲av国产电影网| 免费在线观看完整版高清| 国产精品免费视频内射| 久久久精品94久久精品| a级毛片在线看网站| 国产高清激情床上av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲avbb在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 日本欧美视频一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲综合色网址| 国产免费av片在线观看野外av| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 另类精品久久| 国产主播在线观看一区二区| 男人舔女人的私密视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲人成电影免费在线| 女人久久www免费人成看片| 国产深夜福利视频在线观看| 热re99久久国产66热| 免费不卡黄色视频| 51午夜福利影视在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 9热在线视频观看99| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品自拍成人| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 91精品国产国语对白视频| 中文字幕av电影在线播放| 一区二区三区国产精品乱码| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 两个人看的免费小视频| 国产成人av教育| 天堂中文最新版在线下载| 久久久精品免费免费高清| 精品国产亚洲在线| 精品高清国产在线一区| 欧美成人免费av一区二区三区 | 999精品在线视频| 亚洲成人手机| 精品欧美一区二区三区在线| 美女福利国产在线| 午夜福利影视在线免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 老熟女久久久| 久久久国产欧美日韩av| 日本欧美视频一区| 热99久久久久精品小说推荐| 免费在线观看完整版高清| 国产三级黄色录像| h视频一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| 99九九在线精品视频| 黄色丝袜av网址大全| 人人妻人人澡人人看| 国产成人精品久久二区二区91| 久久av网站| 97在线人人人人妻| 久热爱精品视频在线9| 国产99久久九九免费精品| 国产成人欧美在线观看 | 五月开心婷婷网| 一个人免费看片子| 亚洲欧美激情在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 日韩有码中文字幕| 香蕉丝袜av| 蜜桃在线观看..| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产av一区二区精品久久| 免费在线观看影片大全网站| 国产在视频线精品| 国产精品免费大片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美精品高潮呻吟av久久| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲专区字幕在线| 国产成人av激情在线播放| 十分钟在线观看高清视频www| 嫁个100分男人电影在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线播放国产精品三级| 日日爽夜夜爽网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美激情 高清一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 99国产精品一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 亚洲avbb在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久久国内视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品av麻豆狂野| 水蜜桃什么品种好| 18禁国产床啪视频网站| 国产色视频综合| 天堂8中文在线网| 日韩中文字幕欧美一区二区| 乱人伦中国视频| kizo精华| 国产精品av久久久久免费| 黄片大片在线免费观看| 极品人妻少妇av视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜久久久在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 后天国语完整版免费观看| 国产精品电影一区二区三区 | 动漫黄色视频在线观看| 国产精品久久久久成人av| 国产1区2区3区精品| 黄色a级毛片大全视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成年女人毛片免费观看观看9 | 男女午夜视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 麻豆成人av在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产一区二区在线观看av| 91成年电影在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲精品一二三| 午夜福利乱码中文字幕| 国产在线观看jvid| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 18禁观看日本| 成人精品一区二区免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产片内射在线| www.熟女人妻精品国产| 国产精品久久电影中文字幕 | 两个人免费观看高清视频| 美女午夜性视频免费| 波多野结衣av一区二区av| 午夜免费成人在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 中文字幕制服av| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精品国产区一区二| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧美激情在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产免费av片在线观看野外av| 最近最新免费中文字幕在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费日韩欧美在线观看| 国产在线一区二区三区精| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 国产福利在线免费观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品 国内视频| 18在线观看网站| 中文欧美无线码| 99香蕉大伊视频| 亚洲国产av新网站| 国产一区二区在线观看av| 操美女的视频在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产单亲对白刺激| 国产精品久久电影中文字幕 | 国产欧美日韩一区二区精品| 成人影院久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产在线免费精品| 国产av又大| av天堂久久9| 曰老女人黄片| 免费少妇av软件| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 日韩视频一区二区在线观看| 91av网站免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产色视频综合| 一区二区av电影网| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜老司机福利片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品免费大片| 国产精品一区二区免费欧美| 国精品久久久久久国模美| 丰满少妇做爰视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线观看免费视频日本深夜| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日本五十路高清| 欧美黑人精品巨大| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品一区二区在线观看99| 久久人妻熟女aⅴ| 免费看十八禁软件| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品免费大片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品国产国语对白av| 成年版毛片免费区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 丁香六月天网| 人妻 亚洲 视频| 在线天堂中文资源库| 丝袜美腿诱惑在线| 麻豆av在线久日| bbb黄色大片| 2018国产大陆天天弄谢| 黄色怎么调成土黄色| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人国产一区最新在线观看| 久久狼人影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久热在线av| 飞空精品影院首页| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久久久久免费视频了| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美日韩视频精品一区| 久久 成人 亚洲| 老熟女久久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一区二区三区精品91| 国产精品亚洲av一区麻豆| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩视频在线欧美| 女人久久www免费人成看片| 电影成人av| 操美女的视频在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| a级毛片黄视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 另类亚洲欧美激情| 99国产综合亚洲精品| 香蕉国产在线看| 丰满少妇做爰视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久欧美国产精品| 男女边摸边吃奶| 国产成人av激情在线播放| 自线自在国产av| 精品免费久久久久久久清纯 | 十分钟在线观看高清视频www| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| aaaaa片日本免费| 精品少妇久久久久久888优播| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日本黄色日本黄色录像| 午夜福利在线观看吧| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 窝窝影院91人妻| 亚洲中文字幕日韩| av在线播放免费不卡| 丝袜美腿诱惑在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜激情av网站| 天天影视国产精品| 免费高清在线观看日韩| 最黄视频免费看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品久久久久久久毛片微露脸| 麻豆国产av国片精品| 国产一区二区 视频在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本av免费视频播放| 777米奇影视久久| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 波多野结衣一区麻豆| 91大片在线观看| 9热在线视频观看99| 国产又爽黄色视频| 免费观看人在逋| 成年女人毛片免费观看观看9 | 9色porny在线观看| 免费看a级黄色片| 最新的欧美精品一区二区| a级毛片黄视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 热re99久久国产66热| 两个人免费观看高清视频| 日韩有码中文字幕| 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩人妻精品一区2区三区| 多毛熟女@视频| 亚洲色图av天堂| 成年动漫av网址| 国产野战对白在线观看| 日韩免费av在线播放| 两个人免费观看高清视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日韩欧美免费精品| av网站在线播放免费| 在线观看免费视频日本深夜| 色94色欧美一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲欧美激情在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人系列免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 国产av国产精品国产| 国产不卡一卡二| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 夫妻午夜视频| 免费看a级黄色片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 中文字幕高清在线视频| h视频一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 一二三四在线观看免费中文在| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品欧美一区二区三区在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| a在线观看视频网站| 在线观看www视频免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产单亲对白刺激| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美激情高清一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日韩视频一区二区在线观看| 欧美大码av| 一个人免费看片子| 国产av又大| 精品国产亚洲在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一本大道久久a久久精品| 精品乱码久久久久久99久播| 狂野欧美激情性xxxx| 超碰97精品在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | av国产精品久久久久影院| 国产在线视频一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 乱人伦中国视频| 国产黄频视频在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美精品av麻豆av| 免费少妇av软件| 精品国产一区二区久久| 久久久久久人人人人人| 精品国产乱码久久久久久小说| 一区二区三区激情视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 99久久99久久久精品蜜桃| 深夜精品福利| av天堂久久9| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| aaaaa片日本免费| 一个人免费看片子| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 自线自在国产av| 两性夫妻黄色片| 黄色成人免费大全| 亚洲av日韩在线播放| 99九九在线精品视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产高清videossex| 午夜福利欧美成人| 国产激情久久老熟女| 男女无遮挡免费网站观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 久热爱精品视频在线9| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 下体分泌物呈黄色| 黄频高清免费视频| 午夜激情av网站| 人成视频在线观看免费观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费高清在线观看日韩| 美女福利国产在线| 黄色视频不卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 视频区欧美日本亚洲| 超碰成人久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| a级毛片黄视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产日韩欧美视频二区| 国产不卡av网站在线观看| 人妻久久中文字幕网| 天天影视国产精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| videos熟女内射| 亚洲国产欧美在线一区| 国产成人系列免费观看| 91麻豆av在线| 精品一区二区三卡| 精品欧美一区二区三区在线| h视频一区二区三区| 高清在线国产一区| 久久天堂一区二区三区四区| av天堂久久9| 十八禁网站免费在线| 精品少妇久久久久久888优播| 天堂动漫精品| 一级毛片精品| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产欧美网| 黄色视频,在线免费观看| 咕卡用的链子| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看舔阴道视频| 国产有黄有色有爽视频| 又黄又粗又硬又大视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩精品网址| 久久久久国内视频| 麻豆乱淫一区二区| 久久性视频一级片| 美女视频免费永久观看网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美 日韩 精品 国产| 人人妻人人澡人人看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品欧美一区二区三区在线| 成年动漫av网址|