湖灣沉積物磷吸附特征與微生物群落的響應關系

武 濤，靳鄭海，凃成琪，張繼彪，黃 威,,*

(1.江蘇澳洋生態(tài)園林股份有限公司，江蘇蘇州 215600；2.東華大學環(huán)境科學與工程學院，上海 201620；3.復旦大學環(huán)境科學與工程系，上海 200433)

隨著人類活動在湖泊流域的大量增加，各類營養(yǎng)鹽等經(jīng)過不同途徑輸入到湖泊水庫等水體中，水體中營養(yǎng)鹽富集的問題成為全世界人們關注的熱點[1]。近年來，我國為緩解湖泊水體富營養(yǎng)狀況，采取了一系列生態(tài)化措施，部分湖泊富營養(yǎng)狀況得到改善。但是，如太湖這種大型淺水湖泊，其富營養(yǎng)問題并未得到根治，從而出現(xiàn)區(qū)域型富營養(yǎng)問題。通常根據(jù)夏季是否有沉水植物分布，劃分草型和藻型區(qū)域[2]。

湖泊沉積物在水體富營養(yǎng)狀態(tài)變化過程中扮演著重要角色，其磷的吸收釋放和微生物活動對上覆水體磷濃度有較大的影響[3]。部分研究[4]表明，微生物的生命活動會導致沉積物-水界面氧化還原位降低，并且細菌代謝產(chǎn)物會溶解沉積物中難溶解的磷酸鹽，從而促進磷的釋放；相關學者[5-6]指出，微生物一方面通過改變沉積物-水界面氧化還原條件來影響可交換態(tài)磷的遷移轉(zhuǎn)化，另一方面通過礦化作用來影響水生態(tài)系統(tǒng)磷的循環(huán)；此外，Schultz等[7]早期利用數(shù)學模型，研究了細菌動力學對沉積物磷釋放的影響，結果表明，細菌群落的多樣性促進了沉積物磷的釋放。沉水植物生長特點的不同，草型和藻型區(qū)域沉積物磷吸附和微生物群落之間也必然存在較大的差異。因此，草-藻區(qū)域沉積物磷吸附特征與微生物群落之間的響應關系亟待研究。

本研究根據(jù)夏季是否有沉水植物分布，劃分為草型和藻型區(qū)域。經(jīng)初期調(diào)研，發(fā)現(xiàn)太湖梅梁灣部分區(qū)域夏季存在大量沉水植物，同時選擇貢湖灣未發(fā)現(xiàn)沉水植物的位置，設置樣品采集點位。在分析兩個區(qū)域上覆水和沉積物總氮(TN)和總磷(TP)空間分布特征的基礎上，選擇典型點位，采用動力學和修正后的吸附等溫模型，研究沉積物磷吸附特征，解析區(qū)域沉積物“源-匯”特征；結合生物信息學方法，闡明沉積物磷吸附特征與微生物群落之間的相應關系，從微觀層面為抑制沉積物內(nèi)源磷釋放提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 點位布設及樣品采集

對貢湖灣的草型區(qū)域(M，15個樣品)和梅梁灣的藻型區(qū)域(A，12個樣品)的沉積物樣品進行了采集，采用網(wǎng)格布點法，點位基本覆蓋兩個區(qū)域，采集時間為2020年8月。采樣點具體位置如圖1所示。

圖1 采樣點位Fig.1 Sampling Points

本研究中采用柱狀有機玻璃采水器進行水樣采集，采用表層沉積物采泥器進行表層沉積物樣品的采集，所有沉積物和水質(zhì)樣品均在24 h內(nèi)帶回試驗室進行分析。其中，沉積物樣品采集表層20 cm以上樣品，每次采集樣品4～6 L，每個點位采集5次，設置平行樣。分析樣品采集的同時，同步采集處理微生物測序樣品，采用-80 ℃冰箱保存。

1.2 樣品基本指標測定

研究區(qū)域上覆水TP和TN均采用國標法《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)[8]測定；采用SMT法測定沉積物TP和TN含量[9]。

本研究利用Illumina MiSeq測序平臺對沉積物樣品進行微生物群落多樣性研究。樣品微生物多樣性指標參數(shù)和分布特征分別利用Mothur 1.33.3和生物信息學分析方法進行分析[10]。

1.3 沉積物磷吸附試驗設計

選取兩個區(qū)域典型點位(M1、M11和A4、A10)進行沉積物磷吸附特征研究。其中，動力學試驗將1 g沉積物樣品在室溫下在溫控振蕩器中加入一系列配備50 mL包含5 mg/L的磷酸鹽溶液的錐形瓶，攪拌速度為220 r/min，并且在適當?shù)臅r間間隔抽取上清液利用國標法測定磷酸鹽濃度。等溫吸附試驗是將1 g的沉積物加入到一系列磷質(zhì)量濃度梯度(0、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L)的50 mL錐形瓶中，然后在溫控振蕩器中以220 r/min的恒定速度攪拌。在480 min后，測定上清液的磷酸鹽濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單位質(zhì)量沉積物不同時間對磷的吸附量Qt計算如式(1)。

Qt=(C0-Ct)V/W

(1)

其中：C0——初始磷的質(zhì)量濃度，mg/L；

Ct——空白矯正后t時刻的磷質(zhì)量濃度，mg/L；

Qt——磷的吸附量，mg/g；

V——試樣體積，L；

W——樣品質(zhì)量，g。

本研究中沉積物磷的吸附動力學特征采用準一級動力學模型和準二級動力學模型[11]，采用修正后的吸附等溫模型來描述磷的吸附等溫特征。其中，吸附解吸磷濃度(EPC0)是指吸附試驗中所加入的初始可交換態(tài)磷從表觀上看在底泥表面上沒有吸附，同時也沒有磷從固體表面上解吸下來，即體系已經(jīng)處于動態(tài)平衡時溶液中磷的濃度。相應吸附參數(shù)的計算方法見文獻[12]。

根據(jù)指定的相似度(96%、97%或者98%，本研究中采用97%)，對所有序列進行OTU劃分并進行生物信息統(tǒng)計分析。使用軟件Mothur 1.33.3，主要步驟分為：(1)提取非重復序列，堿基完全一致序列為重復序列；(2)與Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de/)中的aligned(16 S/18 S, SSU)核糖體序列比對；(3)Chimeric序列檢測與去除；(4)距離計算與OTU聚類。采用Quantiy one、Canoco 4.5、Mothur等軟件分析試驗數(shù)據(jù)，開展基于高通量測序技術的硝化菌群落多樣性研究。

2 結果與討論

2.1 區(qū)域污染物空間分布特征

草-藻型特征型湖泊各采樣點上覆水和沉積物氮、磷營養(yǎng)鹽含量如圖2所示，草-藻型區(qū)域氮、磷指標存在較明顯的空間異質(zhì)性。就上覆水體而言，草型區(qū)域和藻型區(qū)域TP質(zhì)量濃度分別為(0.136±0.042)mg/L和(0.220±0.048)mg/L，分別以Ⅳ類水質(zhì)和Ⅴ類水質(zhì)為主；TN質(zhì)量濃度分別為(1.279±0.314) mg/L和(2.004±0.426) mg/L，分別以Ⅳ類水質(zhì)和劣Ⅴ類水質(zhì)為主。其中，草型區(qū)域TP質(zhì)量濃度變異系數(shù)為0.31，空間差異較明顯，區(qū)域表現(xiàn)為東部>西部，這是由于該區(qū)域靠近城鎮(zhèn)和工業(yè)區(qū)，承接了外源污水的匯入。藻型區(qū)域雖毗鄰貢湖水源保護地，但受人類活動及其地表徑流影響較大，近些年長期的外源污染與內(nèi)源釋放致使富營養(yǎng)程度加劇，同時也威脅了太湖流域飲用水的安全。草型區(qū)域周圍分布水生植物，導致總體營養(yǎng)水平低于藻型區(qū)域。氮磷比經(jīng)常用于預測氮或者磷是否會限制浮游植物和藻華的生長。草-藻型區(qū)域氮磷比均低于14，這主要是由于采樣時間處于藻華暴發(fā)期，沉積物磷素大量釋放，藻華養(yǎng)分限制由磷限制轉(zhuǎn)變?yōu)榈拗疲@亦由同期太湖研究[13]證實。

圖2 草-藻型區(qū)域上覆水和沉積物TP和TN濃度分布Fig.2 TP and TN Concentration Distribution of Overlying Water and Sediments in Macrophyte-Dominated and Algae-Dominated Areas

由圖2(c)可知，草型、藻型區(qū)域沉積物TP質(zhì)量分數(shù)為(440.29±53.34)、(586.37±147.36) mg/kg，與巢湖(419.13～1 134.76 mg/kg)[14]、白洋淀(0.7 mg/g)[15]、滇池(1 465.27～3 650.12 mg/kg)[16]等富營養(yǎng)湖泊相比較低。兩個區(qū)域TN質(zhì)量分數(shù)分別為(1 161.21±165.54)、(1 445.84±122.49) mg/kg。藻型區(qū)域沉積物氮、磷庫容均明顯高于草型區(qū)域，藻型區(qū)域受人類活動直接影響較大，工業(yè)廢水和生活污水的排放，致使污染物在沉積物不斷累積，同時藻型區(qū)域藻華生長茂盛，間接引起水生植物死亡的殘體在沉積物堆積，降低了氮、磷的埋藏與固定。采樣適逢夏季藻華易發(fā)期，一方面，高溫加快了內(nèi)源磷負荷的遷移速率[17]，另一方面，藻華通過改變水體酸堿度與氧化還原環(huán)境，促進了沉積物中磷的解吸[18]，導致了夏季沉積物磷負荷較低。

2.2 沉積物磷吸附特征研究

2.2.1 沉積物磷吸附動力學特征

圖3 草-藻區(qū)域典型點位磷吸附動力學曲線Fig.3 Adsorption Kinetics Curve of Phosphorus of Typical Sediments in Macrophyte-Dominated and Algae-Dominated Areas

2.2.2 沉積物磷吸附等溫曲線

修正后的Langmuir和Freundlich模型通常用于描述天然含磷沉積物上磷的等溫吸附行為。本研究兩個區(qū)域的沉積物對磷的吸附等溫線如圖4所示。修正后的Langmuir模型能夠更好地描述沉積物對磷的吸附行為，并且相關系數(shù)R2在0.779～0.923。顯然，在較低的磷濃度(含量為0)，沉積物中的磷參與泥水界面的交換發(fā)生解吸過程，這得益于沉積物的本底磷(NAP)含量。當初始濃度進一步提高，沉積物對磷的平衡吸附能力減弱并趨于平衡。

表1 草-藻區(qū)域典型點位磷吸附動力學參數(shù)Tab.1 Parameters for Adsorption Kinetics of Typical Sediments in Macrophyte-Dominated and Algae-Dominated Areas

圖4 草-藻區(qū)域典型點位磷吸附等溫曲線Fig.4 Phosphorus Adsorption Isotherms of Typical Sediments in Macrophyte-Dominated and Algae-Dominated Areas

對兩個曲線擬合的模型參數(shù)如表2所示，可以預見草型區(qū)域的Qmax較高，M11的Qmax最高，為(0.799±0.212) mg/g，并且M11的K值高于其余位點，為(0.916±0.166) L/mg。之前研究也表明有機質(zhì)含量、礦物組成、Fe/Al氧化物含量等都會影響磷在溶液與沉積物之間的傳質(zhì)過程，造成了沉積物磷平衡吸附能力和吸附容量的差異。先前研究[21]表明，梅梁灣的細粒徑含量占比較高，這有利于磷在沉積物中的吸附與保留，因此，草型區(qū)域磷吸附能力較強，導致M11的K值較高。M11和A10的Qmax較高一方面是由于其Fe/Al氧化物含量豐富，分別為19.59%和20.42%，另一方面是由于其較高的有機質(zhì)含量，分別為3.96%和4.31%。研究[22]表明，有機質(zhì)中的腐殖質(zhì)可通過釋H+改變酸堿環(huán)境和絡合鐵鋁金屬離子，這有助于顆粒相與溶解相的磷交換。此外，沉積物磷吸附取決于顆粒的表面積和顆粒表面的有機物質(zhì)和礦物的電荷平衡官能團，其中配體交換反應被認為是解釋磷吸附到含有Fe/Al氫氧化物的土壤和沉積物中的最重要機制[23]。

EPC0是沉積物對磷的吸附-解吸平衡的平衡濃度，可作為判斷沉積物是作為磷的“源”“匯”的角色的依據(jù)，同時也指示著對上覆水水環(huán)境的最大緩沖能力，防止磷釋放于水柱中，對水生態(tài)起到關鍵作用。經(jīng)計算可得，草型區(qū)域M1、M11的EPC0分別為0.116、0.182 mg/g，經(jīng)與上覆水可溶性正磷酸鹽對比可得，M1沉積物充當磷“匯”，M11沉積物充當磷“源”，可見，M11有較強的內(nèi)源磷釋放風險。藻型區(qū)域A4、A10的EPC0為0.094、0.233 mg/L，相比之下，A4沉積物充當磷“匯”，A10充當磷“源”。

表2 草-藻區(qū)域典型點位磷吸附等溫參數(shù)Tab.2 Parameters for Phosphorus Adsorption Isotherms of Typical Sediments in Macrophyte-Dominated and Algae-Dominated Areas

2.3 沉積物中微生物群落結構差異分析

2.3.1 草-藻區(qū)域沉積物微生物群落多樣性分析

本研究收集來自藻型區(qū)域和草型區(qū)域12個和15個沉積物樣品。測序試驗結果(圖5)表明，藻型區(qū)域大部分沉積物OTU數(shù)目高于草型區(qū)域，其中，經(jīng)過藻型區(qū)域大部分沉積物樣品中OTU數(shù)目在1 700～2 100，草型區(qū)域則為1 250～1 600。對比兩個區(qū)域的多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)呈現(xiàn)與OTU數(shù)目相似的規(guī)律。藻型區(qū)域沉積物細菌群落多樣性變化較大，Chao指數(shù)在1 600～4 000，草型區(qū)域則在1 700～3 000，ACE指數(shù)呈現(xiàn)相似的趨勢。從OTU和Shannon指數(shù)的數(shù)值可知，藻型區(qū)域沉積物細菌群落多樣性高于草型區(qū)域，兩個區(qū)域指標之間呈現(xiàn)顯著的差異性(p<0.05)。這可能是藻型區(qū)域沉積物中微生物活動頻繁，加之在采集樣品階段，大量水體藍藻暴發(fā)，死亡后沉積于沉積物表面，從而導致表層沉積物微生物多樣性豐富。在草型區(qū)域，大部分采樣點位經(jīng)過清淤，導致該區(qū)域沉積物較為清潔，沉積物表層微生物活動不頻繁，生物多樣性較低[24-25]。

圖5 沉積物細菌多樣性指數(shù)及OTU數(shù)量分析 (p<0.05)Fig.5 Diversity Indices and OTU of 16S rRNA Gene Libraries with Significant Differences (p<0.05)

2.3.2 沉積物微生物群落在不同分類級別上的分布

圖6(a)顯示了在沉積物中微生物在門分類級別上的分布，與大部分湖泊沉積物相同[26-28]。變形菌門(Proteobacteria)依舊是兩個不同類型區(qū)域的主要微生物群落，所占比例為45.6%～68.9%。綠彎菌門(Chloroflexi，5.8%～20.5%)、酸桿菌門(Acido-bacteria，5.5%～23.0%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，1.4%～17.9%)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae，1.9%～12.1%)在沉積物細菌群落中所占比例也較大。此外，厚壁菌門(Firmicutes)、綠菌門(Chlo-robi)、黏膠球形菌門(Latescibacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)在沉積物細菌群落中也有相對較高的豐富度。兩個區(qū)域相比，Bacteroidetes群落豐度相差較大，差異分析顯示，兩個區(qū)域Bacteroidetes群落豐度存在顯著的差異性(p<0.05)，草型區(qū)域的Bacteroidetes群落豐度明顯大于藻型區(qū)域。這可能是草型區(qū)域水生植物種類較多，而Bacteroidetes主要對纖維素降解功能較強，因此Bacteroidetes在草型區(qū)域的豐度較大。此外，藻型區(qū)域的Nitrospirae群落豐度也明顯高于草型區(qū)域，這主要是在藻型區(qū)域Nitrospirae群落參與沉積物和水體中氮的循環(huán)和遷移轉(zhuǎn)化，因此，該區(qū)域Nitrospirae群落豐度較高，水華現(xiàn)象較為嚴重。

圖6(b)顯示了不同綱分類級別上細菌群落分布的情況。結果表明，β-變形菌綱(Betaproteoba-cteria)、δ-變形菌綱(Proteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、γ-變形菌綱(Gammaproteo-bacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)是兩個區(qū)域沉積物細菌群落在綱級別上的主要分類。其中，藻型區(qū)域中的硝化螺旋菌門所衍生的綱分類級別上的硝化螺旋菌屬(Nitrospira)群落豐度(5.1%～12.1%)遠大于草型區(qū)域(1.9%～3.6%)，與上文結論相符，藻型區(qū)域Nitrospira高群落豐度導致了該區(qū)域氮的遷移轉(zhuǎn)化以及水體中氮濃度的上升，有利于促進藍藻的生長。草型區(qū)域的擬桿菌綱(Bacteroidia)群落豐度(5.0%～7.8%)高于藻型區(qū)域(0.03%～1.1%)，這也主要是草型區(qū)域水生植物豐度廣泛所導致[29-30]。

注：數(shù)據(jù)來自27個沉積物樣(藻型區(qū)域共12個，草型區(qū)域共15個)圖6 不同(a)門和(b)綱分類級別上的群落分布Fig.6 Abundances of Different (a) Phyla and (b) Classes in 27 Sediment Samples Based on Pyrosequencing

將指定種屬水平上的分類信息(本研究繪圖是根據(jù)genus水平上OTU size位于前50的信息進行繪制)分別按照樣品和分類進行聚類后作出Heatmap圖，能夠反映出所有樣品在各分類水平上表現(xiàn)的相似性或者差異性[31]。如圖7所示，熱圖上部分屬級別上種類，硫桿菌屬(Thiobacillus)、擬衣藻屬(Dechlormonas)，硫化菌屬(Sulfuritalea)、瘤胃桿菌屬(Ruminofilibacter)等菌屬在草型區(qū)域沉積物中的相對豐度均大于藻型區(qū)域。此外，Nitrospira、代爾夫特菌屬(Delftia)、脫硫弧菌屬(Desulfobacca)等菌屬在藻型區(qū)域沉積物中的相對豐度均大于草型區(qū)域。上文中提到藻型區(qū)域的Nitrospira群落豐度明顯高于草型區(qū)域，這可能由于Nitrospira引起。

2.3.3 草-藻型區(qū)域沉積物微生物群落與磷吸附特征響應關系分析

如圖8(a)所示，PCoA分析基于Bray-Curtis距離原則把27個沉積物樣品主要分成兩個類型，這也與兩個區(qū)域的類型完全相符，多變量相似性分析也表明來自兩個區(qū)域的沉積物樣品的細菌群落之間存在著顯著差異(p<0.05)。兩條PCoA軸共解釋了52.3%的細菌群落結構變化。藻型區(qū)域沉積物樣品在PCoA分析水平軸解釋的群落上也存在一定的差異性，其中A10和M11點位與研究區(qū)域的其他沉積物細菌群落之間存在極顯著的差異性(p<0.01)。通過分析OTU分類級別的數(shù)據(jù)能夠較好地解析沉積物細菌群落之間的差異性，如圖8(b)所示。藻型區(qū)域和草型區(qū)域沉積物細菌群落之間的差異性明顯，各區(qū)域沉積物細菌群落的相似度分別為0.61和0.35，呈現(xiàn)的趨勢與PCoA的分析結果一致。總體來看，通過OTU分類級別上的分析，不同樣品在同一地區(qū)的相似性較好，兩個區(qū)域之間樣品沉積物細菌群落存在著顯著差異性，這可能是草型區(qū)域水生植被較多，藻型區(qū)域水華頻繁暴發(fā)所造成。

注：PCo1、PCo2表示兩軸群落變化的細菌占比百分數(shù)圖8 基于Bray-Curtis距離矩陣的分析Fig.8 Analysis Based on Bray-Curtis Distance Matrix

兩個區(qū)域?qū)Ρ?，藻型區(qū)域沉積物的Proteobac-teria相對豐度大于休眠期，這主要是由于藻型區(qū)域沉積物-水界面處，部分藍藻生物活躍，使得大多數(shù)細菌群落處于營兼性或?qū)Ｐ詤捬跫爱愷B(yǎng)生活狀態(tài)，從而直接導致了該地區(qū)的沉積物Proteobacteria的所占比例升高[32-33]。聚類分析結果顯示，點位A10和M11與其他細菌群落之間存在極顯著的差異性，這也表明，充當“源”角色沉積物可能在微生物群落演替過程中，給具有解磷功能的微生物提供能量，從而加劇沉積物磷的釋放。同時，兩個“源”點位沉積物中，具有解磷功能的微生物相對豐度較高，這些微生物活動一方面導致了沉積物-水界面溶解氧降低，同時將不可利用態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可利用態(tài)磷，從而促使沉積物-水界面內(nèi)源磷的釋放。另一方面，兩個點位酸酐門和擬桿菌門衍生屬分類級別(Actinobacteriota、Bacterroidetes)上的細菌群落相對豐度較高，該類微生物具有一定的解磷功能，在沉積物對磷的吸附過程中，促使沉積物對磷吸附能力增強，也進一步說明在微生物介導下沉積物有較強的磷釋放風險。

3 結論

(1)梅梁灣草型區(qū)域和貢湖灣藻型區(qū)域水質(zhì)TP分別以Ⅳ類和Ⅴ類為主，TN質(zhì)量濃度以Ⅳ類水質(zhì)和劣Ⅴ類水質(zhì)為主；藻型區(qū)域沉積物TN和TP含量明顯高于草型區(qū)域，最高值分別達1 445.84、586.37 mg/kg。

(2)準二級動力學模型和修正后的Langmuir模型能夠分別較好地描述沉積物對磷的動力學和等溫吸附行為，草型區(qū)域沉積物理論最大磷吸附量Qmax較高，最高可達0.799 mg/g，且對磷的吸附反應速度快，準二級動力學常數(shù)最大值達1.997 g/(mg·min)。

(3)藻型區(qū)域沉積物細菌群落多樣性高于草型區(qū)域，Proteobacteria是兩個區(qū)域門分類級別上豐富度最高的門，Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Anaerolineae等也是兩個區(qū)域豐富度較高的種類。在藻型區(qū)域，Nitrospirae的群落豐度影響該區(qū)域氮的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，從而影響水體中氮濃度和藻類的生長。草型區(qū)域由于大量沉水植物的生長，導致該區(qū)域如Bacteroidetes等群落豐度較高。

(4)具有解磷功能微生物在兩個充當“源”角色的點位具有較高的相對豐度，且沉積物具有較大的磷吸附量，從而導致了區(qū)域性的領釋放風險，也進一步說明在微生物介導下，草型和藻型區(qū)域沉積物均有較強的磷釋放風險。