高效液相色譜法測定蘆筍中甲基硫菌靈 殘留量方法研究

楊永華，劉 新

(1.寧德市農(nóng)業(yè)科學研究所，福建福安 355017；2.福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，福州 350000)

甲基硫菌靈是一種低毒、廣譜殺菌劑，具有內(nèi)吸、預防和治療作用[1]。它主要通過一系列生化反應，產(chǎn)生能夠干擾病菌菌絲分裂的物質(zhì)，使病菌孢子萌發(fā)長出的芽管細胞壁扭曲畸形，病菌無法正常生長而達到殺菌效果[2]。甲基硫菌靈可廣泛用于防治糧食、花卉、果樹和蔬菜等作物的多種病害，如蘆筍褐斑病、莖枯病等。蘆筍口味鮮美，營養(yǎng)價值高，深受國際市場歡迎，我國蘆筍種植面積廣，在全球蘆筍貿(mào)易中占有重要地位。但據(jù)報道，近年來我國有約65%蘆筍由于農(nóng)藥殘留超標出口受阻[3]。加強農(nóng)藥殘留檢測在應對國外嚴格的綠色貿(mào)易壁壘上具有重要作用。有關(guān)枸杞[4]、芒果[5]、獼猴桃[6]、馬鈴薯[7]中甲基硫菌靈的殘留分析已有文獻報道，但未見甲基硫菌靈在蘆筍中殘留分析研究，建立一種準確、可靠且操作簡便的蘆筍中甲基硫菌靈殘留量分析方法，具有重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；N-EVAP 112型氮吹儀(美國Organomation公司)；BP221S分析天平(德國賽多利斯股份公司)；HR1727攪拌器(飛利浦公司)；T25高速勻漿機(德國IKA公司)；冷凍離心機(德國Sigma公司)；MS 3 digital渦旋振蕩器(德國IKA公司)；移液槍、具塞量筒、燒杯、錐形瓶、0.45 μm濾膜等。

1.1.2 試劑與藥品

甲基硫菌靈標準品(日本曹達有限公司)；三乙胺、氯化鈉、磷酸(均為分析純，國藥集團試劑有限公司)；乙腈、甲醇、丙酮、癸烷磺酸鈉(均為色譜純，國藥集團試劑有限公司)；無水硫酸鎂(分析純，國藥集團試劑有限公司)；乙二胺基-N-丙基(PSA)(美國CNW公司)。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

甲基硫菌靈標準溶液：準確稱取0.01 g (精確至0.001 g)甲基硫菌靈標準品至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，充分振蕩混勻后定容，保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 離子對試劑配制

癸烷磺酸鈉溶液：準確稱取癸烷磺酸鈉固體1.0 g (精確至0.1 g)至1 000 mL容量瓶中，加200 mL超純水充分溶解后，再加入10 mL三乙胺和7 mL磷酸，充分混勻后用超純水定容，保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 樣品前處理

準確稱取25 g樣品于燒杯中，加入50 mL乙腈提取液后用高速勻漿機勻漿2 min，勻漿液過濾至裝有5 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，蓋上塞子，充分振蕩2 min后室溫靜止30 min，待乙腈相和水相完全分層后，準確吸取10 mL上層乙腈于離心管中氮吹至近干，用1 mL甲醇溶解，充分振蕩后加入45 mg PSA和180 mg無水硫酸鎂，5 000 r/min離心15 min，取0.5 mL上層離心液加入0.5 mL離子對試劑，充分振蕩，過0.45 μm濾膜后，待測。

1.2.4 高效液相色譜檢測條件

色譜柱：Waters XBridge C184.0 mm×250 mm；流動相：甲醇+離子對試劑(體積比50∶50)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：30 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

在0.1～20 mg/L范圍，配制不同濃度的甲基硫菌靈標準系列溶液，根據(jù)1.2.4節(jié)中的高效液相色譜檢測條件，進行3次平行測定，以測得的峰面積平均值為縱坐標，相對應的甲基硫菌靈標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖1)，其線性回歸方程為y=129 898x-51 214，R2=0.999 0。

2.2 前處理條件

2.2.1 提取溶劑確定

甲基硫菌靈溶于丙酮、甲醇、乙腈，微溶于己烷，幾乎不溶于水[8]。試驗選用丙酮、乙腈、甲醇3種溶劑為萃取溶劑，通過添加回收試驗，分析萃取效果。結(jié)果表明，丙酮為提取試劑時，其回收率明顯低于甲醇和乙腈；甲醇為提取試劑時，萃取過程分層現(xiàn)象不明顯，不易分辨；乙腈為提取試劑時，試驗效果最為理想，回收率高且樣品雜質(zhì)少。

2.2.2 樣品濃縮

對添加2 mg/kg甲基硫菌靈的蘆筍、蘆筍植株、土壤樣品，提取試驗后分別經(jīng)過濃縮(氮吹)與不濃縮處理，每個處理設計3個重復。結(jié)果表明(表1)，采用氮吹法對樣品進行濃縮處理，既可增高溶液濃度，避免儀器因溶液濃度過低而無法檢出，又可提高樣品回收率。

表1 甲基硫菌靈不同前處理對回收率的影響

2.2.3 無水硫酸鎂含量和PSA含量確定

為確定樣品在進行凈化操作時，無水硫酸鎂和乙二胺基-N-丙基(PSA)的最佳添加量，設置了不同梯度水平的添加試驗，每個梯度水平設計3個重復，以平均值計最終值(表2、表3)。

表2 無水硫酸鎂不同添加量對回收率的影響

表3 PSA不同添加量對回收率的影響

由表2可知，隨著無水硫酸鎂含量增加，蘆筍、蘆筍植株以及土壤樣品的回收率有提高趨勢。當無水硫酸鎂添加量為180 mg時，回收率最高，為80.9%～ 83.7%。但隨著無水硫酸鎂的持續(xù)增加，樣品回收率呈下降趨勢，分析其原因可能是由于加入的固體量已經(jīng)超出了使樣品達到最佳鹽析狀態(tài)含量，過多固體影響了振蕩、離心、移取等操作，最終導致回收率下降。由表3可知，樣品回收率隨著PSA含量增加而提高，當PSA添加量達到45 mg以上時，回收率較佳，為81.4%～83.6%，綜合試驗效果、價格等因素，確定凈化操作時，PSA加入量為45 mg。

2.3 檢測條件

2.3.1 檢測波長確定

通過PDA二極管陣列檢測器對甲基硫菌靈進行波長掃描，結(jié)果表明，當檢測波長為270 nm時，甲基硫菌靈有較好的吸收峰，且不受雜質(zhì)峰干擾，因此確定本方法的檢測波長為270 nm。

2.3.2 流動相配比選擇

甲基硫菌靈屬苯并咪唑類殺菌劑，檢測過程中如果不通過加入離子對試劑、調(diào)節(jié)pH等方法來優(yōu)化色譜條件，易出現(xiàn)保留時間過長、峰拖尾或變形等現(xiàn)象。本試驗使用甲醇和離子對試劑為流動相，設計了8種不同流動相配比，考察了分析效果(表4)。結(jié)果表明，流動相中甲醇含量過低時，出峰及峰分離效果差；當流動相中甲醇比例達70%以上時，出目標峰，但目標峰與雜質(zhì)峰分離效果不佳。綜合目標峰出峰情況、目標峰與雜質(zhì)峰分離效果等因素，選擇流動相甲醇與離子對試劑磷酸-癸烷磺酸鈉溶液配比為50∶50 (體積比)。

表4 甲醇和離子對試劑不同配比對目標峰的影響

續(xù)表4

2.3.3 柱溫和流速選擇

分別考察了4個梯度柱溫(25、30、35、40 ℃)和3個梯度流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)。試驗發(fā)現(xiàn)，當柱溫為25 ℃，流速為0.8 mL/min時，目標峰出峰時間為15.979 min；當柱溫升至40 ℃，流速為1.0 mL/min時，出峰時間提前但存在與雜質(zhì)峰交叉現(xiàn)象，且溫度過高也不利于儀器性能和使用壽命。試驗確定最佳柱溫為25 ℃，流動相流速為0.8 mL/min。

2.3.4 方法最低檢出濃度

通過3倍噪音計算可知本方法最低檢出量為7.5×10-9g，將相應樣本溶液進樣體積、樣本溶液定容體積等相關(guān)數(shù)據(jù)代入式(1)，求得本方法最低檢出濃度為0.01 mg/kg。

2.3.5 方法重復性

將100 mg/L甲基硫菌靈標準儲備液稀釋成5個不同濃度系列標準品溶液，根據(jù)1.2.4節(jié)高效液相色譜檢測條件進行檢測分析。由表5可知，甲基硫菌靈目標峰保留時間的相對標準偏差和峰面積的相對標準偏差分別為0.01%～0.04%和0.93%～3.00%，方法相對誤差較小、重復性好，符合農(nóng)藥殘留試驗要求。

表5 甲基硫菌靈不同濃度標準品出峰時間與對應峰面積

續(xù)表5

2.3.6 方法的準確度和精確度

在蘆筍、蘆筍植株及土壤空白樣品中添加0.5、1.0、2.0 mg/kg 3個不同濃度水平的甲基硫菌靈標準溶液，按本試驗樣品前處理方法和色譜檢測條件進行添加回收試驗。結(jié)果表明，添加濃度為0.5～2.0 mg/kg時，甲基硫菌靈在蘆筍中的平均回收率為73.12%～ 83.55%，相對標準偏差為2.68%～3.98%，在栽培土壤中的平均回收率為75.53%～85.68%，相對標準偏差為1.46%～3.75% (表6)。

表6 甲基硫菌靈在蘆筍、蘆筍植株和土壤中的添加 回收率及相對標準偏差

3 結(jié) 論

結(jié)合QuEchERS[10]方法，重點對樣品前處理中提取溶劑、凈化物質(zhì)的最佳添加量等進行了考察分析，對高效液相色譜檢測條件中檢測波長、色譜柱溫和流速以及流動相最佳配比等色譜條件進行了優(yōu)化，建立了蘆筍及其栽培土壤中甲基硫菌靈殘留分析方法，即PSA分散固相萃取和離子對高效液相色譜法。與氣相色譜法相比，該方法具有靈敏度高，分離效能好、檢測速度快等優(yōu)勢。添加回收試驗驗證了該方法的精確度和準確度均符合農(nóng)藥殘留分析與檢測技術(shù)要求，方法具有重復性好、樣品前處理操作簡單省時等特點，可用于檢測蘆筍及其栽培土壤中甲基硫菌靈的殘留量，為其田間殘留消解動態(tài)研究提供了指導。