香煙煙霧提取物誘導16HBE細胞MUC5AC上調的機制

田晨 劉志輝 孟繁榮 李華 何湘蓉 胡錦興

1廣州醫(yī)科大學研究生院（廣州 510120）；2廣州市胸科醫(yī)院肺研所（廣州 510120）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）又稱為慢阻肺，是目前全球三大死因之一，長期接觸有害氣體或顆粒導致患者小氣道發(fā)生氣道炎癥、氣道重塑及氣道黏液阻塞是促使COPD 患者逐漸氣流受限的主要因素［1-2］。吸煙導致患者黏液高分泌是致使COPD 黏液阻塞的主要發(fā)病機制之一，而治療黏液高分泌被認為可以改變患者預后。在COPD 患者中，離子-流體運輸及高分泌的病理性黏蛋白MUC5AC 導致黏液高度濃縮、黏液運輸失敗，小氣道中的黏液無法被咳嗽清除，形成氣道堵塞，促使氣流受限發(fā)生，但該過程發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不完全清楚［3-5］。本研究基于細胞水平，通過轉錄組測序技術篩選出香煙煙霧提取物（CSE）刺激人支氣管上皮細胞后差異表達基因（DEGs），并通過生物信息學分析方法進行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出可能參與該過程中MUC5AC 上調的信號通路并加以驗證，以期為COPD 黏液高分泌分子機制研究提供數(shù)據(jù)支持，并為尋找新的COPD 藥物作用靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮細胞16HBE（廣州呼吸健康研究所的饋贈），紅雙喜牌香煙（廣東中煙工業(yè)有限責任公司），高糖型DMEM 培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），雙抗溶液（Gibco），胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（Gibco），總RNA 提取試劑盒（ESscience），High Capacity cDNA 反轉錄試劑盒（Applied Biosystems），SYBR Green Pro Taq HS（AG），WNT 信號通路激活劑CT99021 monohydrochlo ride（Med-ChemExpress），Opti-MEM 培養(yǎng)基（Gibco），Lipofectamin 3000（Thermo Fisher Scientific）。超微量分光光度計（Thermo Scientific），VIIA7 實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 CSE 制備將4 支除去了濾嘴的紅雙喜牌香煙燃燒的煙霧以20 mL/min 速度抽吸入20 毫升PBS 溶液。利用4%NaOH 和10%HCl 溶液將pH 值調節(jié)至7.4，使用0.22 微米過濾器過濾和除菌，將收集的混合液定義為100%CSE。

1.2.2 細胞準備從液氮中取出16HBE 細胞進行復蘇并接種于培養(yǎng)瓶中，以含5%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。當細胞密度達到80% ～90%時去除培養(yǎng)基，加入消化酶進行消化，并按1∶3 的比例傳代。實驗取生長狀態(tài)良好的16HBE 細胞以5%CSE 刺激24 h。

1.2.3 轉錄組測序

1.2.3.1 提取總RNA 送檢測序收集三次實驗組（5%CSE 刺激16HBE 細胞24 h）與對照組（PBS 培養(yǎng)16HBE 細胞24 h）細提取其總RNA，使用超微量分光光度計檢測總RNA 濃度及質量，按送檢要求稀釋后交由北京六合華大基因科技有限公司完成質檢并進行轉錄組測序。

1.2.3.2 測序結果質控使用DNBSEQ 平臺測序，將測序所得的raw reads 通過SOAPnuke 軟件進行質控，去除包含接頭、未知堿基N 含量大于5%以及低質量的reads（質量值低于15 的堿基占該reads 總堿基數(shù)的比例大于20%）以得到Clean reads ，過濾后的Clean Reads 保存為FASTQ 格式，使用HISAT軟件將Clean reads 比對到參考序列并得到各基因的表達量，以FPKM 標準化表達量，參考序列來自NCBI 的Homo_sapiens（GCF_000001405.39_ GRCh38.p13）。比對后通過統(tǒng)計比對率等，進行第二次質控。

1.2.3.3 篩選差異基因進行分析將CSE 組與對照組基因差異表達倍數(shù)（FC）取以2 為底的對數(shù)值，定義log2（FC）＞1，校正后Q 值＜0.05 的基因為DEG，使用Dr.Tom 軟件進行基因定量分析、以篩選出差異表達基因（DEG），對DEG 進行聚類熱圖及火山圖分析總覽DEG分布情況、差異大小及差異顯著性等信息；對DEG 進行GO 功能注釋、KEGG pathway 功能注釋，根據(jù)注釋結果篩選出信號傳導相關的DEG 進行GO_Biological Process 及KEGG pathway富集分析，尋找可能與CSE誘導的MUC5AC上調相關的信號通路。將可能相關的信號通路DEGs 進行KDA 分析，篩選出KDA 基因及初始基因進行驗證。

1.2.4 激活經典WNT 信號通路分組及處理措施為：激動劑+CSE 組給與經典WNT 信號通路激活劑及5%CSE 刺激；激動劑組給予經典WNT 信號通路激活劑；CSE 組給予5%CSE 刺激；對照組給予PBS 緩沖液。

1.2.5 siRNA 干擾WNT 基因

1.2.5.1 實驗分組實驗分為6個組：siRNA+CSE組（分別轉染WNT4/WNT5B/WNT6/WNT9A/WNT10A siRNA，均給予5%CSE 刺激）；siRNA 組（分別轉染WNT4/WNT5B/WNT6/WNT9A/WNT10A siRNA）；陰性對照+CSE 組（轉染非特異性siRNA，給予5%CSE刺激）；陰性對照組（轉染非特異性siRNA，給與PBS 緩沖液）；CSE 組（給予5%CSE 刺激）；空白對照組（給予PBS 緩沖液）。

1.2.5.2 siRNA 轉染與CSE 刺激按每孔7.5 μL Lipofectamin 3000、75 pmol siRNA（由吉薩基因合成）及2×125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基比例混合轉染試劑，先分別以Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋Lipofectamin 3000 試劑及siRNA 試劑，然后將稀釋好的siRNA試劑緩慢滴加入稀釋好的Lipofectamin 3000 試劑中，將混合好的轉染試劑按實驗分組加入去除雙抗的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基，按實驗分組給予細胞5%CSE刺激24 h，WNT5B siRNA序列正義鏈：3'-CCAAGACUGGCAUCAAGGAAUTT-5'，反義鏈：3'-AUUCCUUGAUGCCAGUCUUGGTT-5'。

1.2.6 RT-qPCR 法檢測MUC5AC 及WNT 基因轉錄水平使用離心柱法提取細胞總RNA，稀釋至20 ng/μL 后逆轉錄成cDNA，使用熒光定量PCR試劑盒進行qPCR 實驗，反應引物如表1（由北京六合華大基因科技有限公司合成），反應體系：2 ×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，引物各1 μL，ROX reference Dye（20 μmol/L）0.04 μL，cDNA 模板5 μL，ddH2O 3 μL，總體系為20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃高溫變性5 s，58 ℃退火延伸30 s，高溫變性及退火延伸40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT算法計算并分析結果。

表1 引物列表Tab.1 Primers

1.2.7 統(tǒng)計學方法運用Graphpad prism9 軟件進行統(tǒng)計分析，每組數(shù)據(jù)至少來自3 次獨立重復實驗，計量資料以均數(shù)±標準差來表示。兩組相關樣本使用配對樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉錄組測序結果

2.1.1 送檢RNA 及測序數(shù)據(jù)質檢結果送檢總RNA 樣本完整性較高（RIN 均＞9，28S/18S 均＞2）且足量，達到建庫標準。過濾后Quality ＞20的Clean reads 比率均＞97%，對比成功的Clean Reads 比例均大于93%。

2.1.2 轉錄組測序結果本次測序共檢測出17 097個基因，其中429 個僅在Control 組表達，1 259 個僅在CSE 組表達（圖1），使用Dr.Tom 軟件共篩選出2 567 個差異基因（DEGs），其中上調基因1 027 個，下調基因1 540 個，DEGs 表達量聚類熱圖示生物學重復實驗組間相似度較高，對照組與實驗組有顯著差異，差異基因火山圖示差異基因表達倍數(shù)及差異程度（圖2）。

圖1 各組基因表達數(shù)量韋恩圖Fig.1 The Wayne Chart of gene expression of each group

圖2 差異基因表達Fig.2 The expression of differential gene

2.1.3 GO、KEGG pathway 功能注釋注釋結果如圖3、4，注釋到信號通路相關的DEGs 共有1 000 個。

圖3 KEGG Pathway 分類注釋柱狀圖Fig.3 The analysis of KEGG pathway term

2.1.4 GO_BP 及KEGG Pathway 富集分析富集結果顯示信號傳導相關DEGs 主要富集到以下信號通路中，見圖5。

圖5 GO-BP 及KEGG pathway 富集分析Fig.5 GO-BP and KEGG pathway enrich ment analysis

2.1.5 WNT 信號通路相關DEGs 進行差異分析數(shù)據(jù)顯示富集到WNT 信號通路的相關DEGs 共57 個，其中23 個基因上調（表2），34 個基因下調（表3）；KDA 分析結果顯示10 個KDA 基因及22個初始基因，KDA 基因中的WNT 基因包括上調基因WNT9A，下調基因WNT4、WNT5B、WNT10A，初始基因中的WNT 基因包括下調基因WNT6（圖6）。

表3 下調的WNT 信號通路富集基因Tab.3 The down-regulated enrichment gene in WNT signalling pathway

圖6 KDA 分析Fig.6 KDA analysis

表2 上調的WNT 信號通路富集基因Tab.2 The up-regulated enrichment gene in WNT signalling pathway

2.2 CSE刺激16HBE后WNT基因轉錄水平CSE組較對照組WNT4、WNT5B、WNT6、WNT10A 轉錄水平均下調，CSE 組WNT9A 轉錄水平較對照組上調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。此結果與轉錄組測序結果一致（圖7）。

圖7 WNT 基因轉錄水平Fig.7 Transcription level of WNT gene

2.3 激活Wnt/β-Catenin 信號通路對16HBE 細胞MUC5AC 轉錄水平的影響在不給予CSE 刺激的情況下，WNT 信號通路激活組MUC5AC mRNA相對于對照組明顯上調，而在給予香煙煙霧刺激的情況下，激活經典WNT 信號通路較不激活MUC5AC mRNA，無顯著變化趨勢（圖8）。

圖8 MUC5AC 轉錄水平變化Fig.8 Changes of transcription level of MUC5AC

2.4 敲低WNT基因對16HBE細胞MUC5AC轉錄水平影響敲低WNT4、WNT6、WNT9A、WNT10A基因前后對MUC5AC 轉錄水平的影響無統(tǒng)計學意義。敲低WNT5B 基因能顯著提升16HBE 細胞MUC5AC 轉錄水平（圖9）。

圖9 MUC5AC 轉錄水平相對表達量Fig.9 Relative expression of MUC5AC transcript level

3 討論

一直以來，吸煙都被認為與慢性阻塞性肺病黏液高分泌有關，但其機制尚不清楚。為探索參與該機制的信號通路及相關基因，本研究通過以CSE 刺激16HBE 細胞，選取使MUC5AC 轉錄水平最大程度上調的刺激條件（5%CSE，24 h）來培養(yǎng)16HBE 細胞，并提取總mRNA 進行轉錄組測序，經生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CSE 主要引起16HBE 細胞血管生成及細胞內信號轉導、MAPK 信號通路、WNT信號通路、轉化生長因子β 受體負調控相關信號通路、PI3K-Akt 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、AMPK 信號通路、Rap1 信號通路等信號通路表達異常。其中TGF-β3（轉化生長因子β3）已被證明通過調節(jié)氣道上皮細胞自噬途徑促進MUC5AC高表達［6］。PI3K/AKT 信號通路被證明參與直腸癌黏蛋白MUC2 的過度分泌［7］。AREG（雙調蛋白）能通過激活HBECs 中EGFR-PI3Kα-AKT/ERK 通路來增強PM（顆粒物質）誘導的炎癥和黏液高分泌［8］。在LPS 誘導的哮喘模型中，激活AMPK/SOCS1 能抑制MUC5AC 的表達［9］，Rap1 可以成為非經典WNT信號通路下游信號［10］，但它是否與MUC5AC 分泌相關目前鮮有報道。MAPK 級聯(lián)反應及表皮生長因子受體（EGFR）基因的異常表達被大量實驗證明在香煙煙霧誘導的氣道黏液高分泌當中發(fā)揮重要作用，EGFR 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分別能通過激活氣道上皮細胞中的MAPK 級聯(lián)反應及NFκB 信號通路從而在MUC5AC 基因表達和產生中起到關鍵作用［11-14］。然而針對以上靶點所開發(fā)黏液分泌抑制藥物由于藥物副作用、易耐藥性等原因終止了臨床實驗［15］。進一步探索COPD 黏液高分泌分子機制，并尋找新的藥物作用靶點仍是所需努力的方向。

圖4 GO 分類注釋柱狀圖Fig.4 The analysis of GO term

本研究觀察到兩種富集均提示了WNT 信號通路，且其已在慢性呼吸道疾病中得到廣泛研究［16-18］。有研究表明多種WNT 及WNT 靶基因在健康吸煙者和患有COPD 的吸煙者中下調［19］，經典WNT 信號通路激動劑氯化鋰可減輕實驗性肺氣腫［20］。而FMCA 等［21］卻報道了相反的結果，他們的研究表明，與非吸煙者和吸煙對照組相比，COPD 患者WNT/β-Catenin 途徑在氣道上皮中上調。非經典信號通路中的WNT-5A 也被證明在COPD 患者中表達上調，且WNT-5A 干擾了經典信號通路介導的肺泡上皮細胞修復［22］，總之無論是經典或非經典WNT 信號通路均被證實在COPD 中存在異常表達，但其差異趨勢及其在COPD 中的作用機制存在爭議。

盡管WNT 信號通路在COPD 中被廣泛研究，但其是否參與COPD 中黏液高分泌的發(fā)生鮮有文獻報道。LIU 等曾報道敲低內源性經典WNT 信號通路效應蛋白β-catenin 能顯著下調高滲引起的16HBE 細胞MUC5AC 蛋白的表達水平［23］。而ZHANG 等的實驗表明在小鼠哮喘模型中，對Wnt信號通路負向調節(jié)因子進行抑制可明顯上調MUC5AC 的表達水平［24］，這些實驗提示WNT 信號通路參與調節(jié)MUC5AC 的表達，由此推測WNT 信號通路可能也參與COPD 中氣道黏液高分泌的發(fā)生過程。于是將轉錄組測序結果中WNT 信號通路相關差異基因進行KDA 分析，結果提示表達下調的非經典WNT4、WNT5B 基因、表達下調的經典WNT6、WNT10A及上調的經典WNT9A 為KDA基因或初始基因。隨后使用RT-qPCR 實驗驗證了這些基因的測序結果并進一步使用經典WNT信號通路激動劑及siRNA 干擾技術來驗證該通路及相關基因是否參與16HBE細胞MUC5AC的上調，結果顯示在無CSE刺激時，激動WNT信號通路能明顯上調MUC5AC 轉錄水平［（3.197±0.509 4）vs.（1±0），P= 0.031 3］，而在給予CSE 刺激時，這種上調消

失。這可能是源于CSE 降低了16HBE 細胞對WNT激動劑的敏感性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在敲低WNT5B基因后，WNT5B siRNA 組+CSE 組MUC5AC mRNA較陰性對照+CSE 組上調2.092 倍［（9.066±3.442）vs.（4.333±1.121），P=0.016 2］，這表明非經典信號通路中的WNT5B 參與CSE 誘導的16HBE 細胞MUC5AC 的上調。但HELINE 等及其前期的研究證明CSE 上調COPD 患者的原代細胞的WNT5B 蛋白及16HBE 細胞WNT5B 轉錄水平［25］。該研究結果與本研究相反，這種差異可能源自于使用了不同的實驗細胞，及不同的CSE 刺激條件，觀察到Eline 在實驗中使用的CSE 刺激條件為5%CSE 刺激16HBE 僅6 h。另外，筆者觀察到轉錄組測序數(shù)據(jù)結果中提示RAP1 信號通路相關基因轉錄水平顯著異常，推測WNT5B 可能通過非經典的WNT/RAP1 信號通路發(fā)生作用，進一步驗證有助于明確具體的非經典WNT 信號通路。

本研究證明了非經典WNT信號通路的WNT5B參與人支氣管上皮細胞中MUC5AC 的調節(jié)，為COPD 黏液高分泌分子機制研究提供了新的數(shù)據(jù)支持，并為尋找新的COPD 藥物作用靶點提供理論依據(jù)。