MiR-216a調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路抑制卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

吳新華 顧曉荔 胡濱

鄭州大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（鄭州 450000）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是致死率最高的婦科惡性腫瘤［1-2］。由于缺乏明顯臨床癥狀和診斷生物標志物，大多數(shù)卵巢癌患者在確診時就已處于疾病晚期，導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后不佳［3-4］。因此，鑒定新的生物標志物并闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制至關(guān)重要。微小RNA-216a（microRNA-216a，miR-216a）是一種與癌癥相關(guān)的miRNA，已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌［5］、胃癌［6］中下調(diào)，表明miR-216a具有腫瘤抑制作用。然而，有研究證實，miR-216a在卵巢癌組織和細胞中高表達，在卵巢癌中具有致癌作用［7］，與其他癌細胞中研究不同。因此，有必要對miR-216a 在卵巢癌中的具體生物學功能及其潛在的機制進行探究。據(jù)報道，Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在多種癌癥中發(fā)揮重要作用，該通路的激活可增加腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［8］。LIU 等［9］研究表明，抑制JAK2/STAT3 信號通路可抑制EMT 減弱卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。EMT 作為腫瘤進展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，參與腫瘤侵襲、擴散等過程［10］。然而，在卵巢癌中miR-216a 是否可通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 影響細胞的轉(zhuǎn)移和EMT 仍不明晰。本研究通過表達miR-216a，探索其對卵巢癌細胞的遷移和侵襲的影響以及潛在的作用機制，為卵巢癌的臨床治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人體組織樣本和細胞收集2019年1月至2021年1月期間來本院就診的20 例卵巢癌患者卵巢癌組織和癌旁正常組織（距離癌組織至少5 cm）樣本，術(shù)中采集組織后迅速于液氮中冷凍后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。所有患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究?jīng)本院倫理委員會批準。

人卵巢癌細胞系A(chǔ)2780（YS018C）、OVCAR3（YS3615C）、SKOV3（YS3110C）、3AO（YS908C）以及人卵巢上皮細胞HOSEpiC（YS1695C）均購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器DMEM 培養(yǎng)基、青/鏈霉素購自美國Gibco；TRIzol 試劑購自美國Invitrogen；TaqManTMmicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqManTMmicroRNA 檢測試劑盒購自美國Thermo；RIPA 裂解緩沖液、BCA 試劑盒購自江蘇Beyotime；一抗E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、JAK2、STAT3、Snalil、Twist、GAPDH 均購自英國Abcam；ECL 發(fā)光液購自北京BIOSIC；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技。

Varioskan LUX多功能酶標儀購自美國Thermo；LightCycler 480 熒光定量PCR 儀購自上海Roche；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad；EclipseTi-E 激光共聚焦熒光顯微鏡購自美國Nikon；CX43 顯微鏡購自美國OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組卵巢癌細胞系（A2780、OVCAR3、SKOV3、3AO）以及人卵巢上皮細胞HOSEpiC 在補充有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細胞維持在37 ℃、5%CO2的濕潤氣氛中，待細胞生長融合度至70%左右時進行傳代培養(yǎng)，取處于對數(shù)期且生長良好的第三代后的細胞進行后續(xù)研究。

取對數(shù)期生長的SKOV3 細胞，依次分為：正常對照（Control）組，miR-NC 對照（miR-NC）組、miR-216a 過表達（miR-216a）組、miR-216a 過表達和JAK2 過表達空載對照（miR-216a+EV）組、miR-216a 和JAK2 過表達（miR-216a+JAK2）組。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒方法轉(zhuǎn)染對應(yīng)的質(zhì)粒和寡核苷酸。miR-216a 模擬物（miR-216a）及其陰性對照miR-NC、JAK2 過表達（JAK2）及其空載對照（EV）均購自廣州Genecopoeia 設(shè)計合成。

1.2.2 QRT-PCR 檢測組織和細胞中miR-216a 表達水平根據(jù)TRIzol 試劑制造商說明書提取組織和細胞總RNA。遵循逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法制備cDNA，使用microRNA檢測試劑盒對miR-216a進行PCR 擴增和定量。U6 作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔct計算miR-216a 的相對表達水平。

miR-216a 引物序列：5'-ACACACUUACCCGUA-GAGAUUCUA-3'，反向引物使用試劑盒中通用的引物。U6 引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 Transwell 實驗檢測各組SKOV3 細胞的遷移和侵襲能力在實驗前，先使用Matrigel 包被Transwell 小室底部膜的上室面，干燥備用。將按照上述方法培養(yǎng)的各組SKOV3 細胞使用無血清的培養(yǎng)基重懸，形成5 × 105個/mL 的細胞懸浮液，吸取200 mL 懸浮液于含Matrigel 的Transwell 小室上室中，下室中添加600 mL 正常培養(yǎng)基。按常規(guī)方法培養(yǎng)48 h 后，使用甲醇固定30 min 后，添加0.1%結(jié)晶紫染色20 min，同時使用棉簽輕輕拭去上層未遷移細胞，使用PBS 輕洗3 遍后在倒置顯微鏡中拍照記錄，隨機選擇五個視野，計數(shù)。

細胞遷移實驗需使用無Matrigel 包被Transwell 小室，其余步驟同上。

1.2.4 免疫印跡（Western blot）檢測各組SKOV3細胞中EMT 和JAK2/STAT3 通路相關(guān)的蛋白水平變化使用RIPA 裂解緩沖液裂解按上述方法培養(yǎng)的各組SKOV3 細胞以獲得總蛋白提取物，并使用BCA 試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。通過SDSPAGE 電泳分離總蛋白提取物（600 mg/泳道）后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，添加5%牛血清白蛋白封閉2 h，將蛋白質(zhì)與一抗（稀釋濃度1∶1 000）：E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、JAK2、STAT3、Slug、Twist 和GAPDH 在4 ℃下過夜孵育，隔天使用HRP 標記的二抗孵育2 h。使用增強型的ECL 發(fā)光液將蛋白可視化。并使用凝膠成像系統(tǒng)檢測信號并拍照記錄，通過Image J 軟件分析各組蛋白灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.2.5 免疫熒光檢測各組SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 表達水平將按照上述方法培養(yǎng)的各組SKOV3 細胞接種在細胞爬片上，待爬滿細胞后，使用PBS 浸洗3 次。在室溫下使用4%多聚甲醛固定后使用0.1% triton X-100 透化，添加山羊血清室溫封閉30 min，吸去封閉液后將細胞與一抗（稀釋比例1∶500）：E-cadherin、Ncadherin 和Vinmentin 在4 ℃下過夜孵育。后將爬片與FITC 熒光二抗在室溫下孵育1 h，細胞核在室溫下使用DAPI 染色10 min。使用激光掃描顯微鏡捕獲共聚焦熒光圖像。

1.2.6 雙熒光素酶檢測miR-216a 與JAK2 靶向關(guān)系經(jīng)TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測，miR-216a 與JAK2 3'-UTR 存在相互作用位點，將JAK2 3'-UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）連接到螢火蟲熒光素酶報告載體上，構(gòu)成JAK2 WT 或JAK2 MUT。將JAK2 WT 或JAK2 MUT 與miR-NC 或miR-216a 共同轉(zhuǎn)染至SKOV3 細胞，共同孵育48 h 后，經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法所有研究均進行3次獨立重復(fù)。使用SPSS 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，用平均值±標準差的方式來表示，采用t檢驗分析兩組差異，使用單因素方差分析多組間差異。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-216a 在卵巢癌組織和SKOV3 細胞中的表達情況圖1A 結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-216a 表達水平在卵巢癌組織中的表達降低（t=80.63，P＜0.05）。圖1B 結(jié)果顯示，與HOSEpiC細胞相比，卵巢癌細胞系中miR-216a 表達均明顯降低（F= 142.089，P＜0.05）；且在SKOV3 細胞中表達最低，故后續(xù)選擇SKOV3 細胞作為研究對象。

圖1 qRT-PCR 檢測miR-216a 在卵巢癌組織和細胞中的表達情況Fig.1 qRT-PCR detection of miR-216a expression in OC tissues and cells

2.2 miR-216a 過表達促進SKOV3 細胞遷移和侵襲5 組SKOV3 細胞中miR-216a 表達、遷移和侵襲細胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計學意義（F= 93.172、199.616、185.908，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中miR-216a 表達升高，遷移和侵襲數(shù)量減少（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細胞中表達變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而遷移和侵襲數(shù)量增多（P＜0.05）。見圖2。

圖2 miR-216a 過表達對SKOV3 細胞遷移和侵襲的影響Fig.2 Effects of miR-216a overexpression on migration and invasion of SKOV3 cells

2.3 miR-216a 過表達抑制SKOV3 細胞的EMT5 組SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平差異均有統(tǒng)計學意義（F=49.612、66.773、102.396，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中E-cadherin 蛋白水平增高，N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平降低（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組相比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細胞中E-cadherin 蛋白水平降低，N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平增高（P＜0.05）。免疫熒光進一步證實了以上各組SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平變化結(jié)果（圖3）。

圖3 miR-216a 過表達對SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 水平的影響Fig.3 Effects of miR-216a overexpression on the levels of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in SKOV3 cells

2.4 miR-216a 過表達抑制SKOV3 細胞中JAK2/STAT3通路激活5組SKOV3細胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平差異均有統(tǒng)計學意義（F=113.889、63.837、89.688、74.773，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平均降低（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平均增高（P＜0.05，圖4）。

圖4 miR-216a 過表達對JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平的影響Fig.4 Effects of miR-216a overexpression on the protein levels of JAK2，STAT3，Slug and Twist

2.5 雙熒光素酶實驗檢測SKOV3 細胞中miR-216a 與JAK2 靶向關(guān)系生物學預(yù)測，JAK2 3'-UTR 存在與miR-216a 相互作用的靶向結(jié)合位點（圖5A），經(jīng)雙熒光素酶實驗證實，與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中轉(zhuǎn)染JAK2 WT 可顯著降低熒光素酶活性（t= 16.333，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染JAK2 MUT 則對熒光素酶活性的影響差異無統(tǒng)計學意義（t=16.333，P=0.332，圖5B）。

圖5 miR-216a 與JAK2 靶向關(guān)系驗證Fig.5 Validation of the targeting relationship between miR-216a and JAK2

3 討論

miRNAs 是一組長度為20-22 個核苷酸的非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達，并在調(diào)節(jié)組織特異性蛋白表達方面發(fā)揮著重要作用［11］。越來越多的研究證實，異常miRNA 表達通過充當致癌基因或腫瘤抑制因子而與人類癌癥的發(fā)展和進展直接相關(guān)。此外，miRNAs 已被公認為是最有潛力的生物標志物和包括卵巢癌在內(nèi)的人類癌癥的治療靶點［12-13］。miR-216a 已被發(fā)現(xiàn)是人類惡性腫瘤的積極參與者［14-15］。本研究結(jié)果顯示，miR-216a 在卵巢癌組織和細胞中顯著低表達，且在SKOV3 細胞中表達最低，表明miR-216a 在卵巢癌中具有抑癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a 的表達在胃癌組織和細胞系中受到抑制，低表達的miR-216a 與胃癌患者的惡性臨床特征和不良預(yù)后相關(guān)，且miR-216a 可能通過抑制JAK2/STAT3 通路的激活來抑制胃癌細胞的遷移、侵襲和EMT 過程［16］。然而，在肝細胞癌中，A1BG-AS1 通過直接吸附競爭性內(nèi)源性miR-216a 表達抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，而過表達miR-216a 可逆轉(zhuǎn)A1BG-AS1 對癌細胞的影響，說明miR-216a 在肝細胞癌中具有致癌作用［17］。本結(jié)果與之相一致。為了進一步明確miR-216a在卵巢癌細胞中的具體生物學功能，進一步實驗證實過表達miR-216a 抑制遷移、侵襲，且表現(xiàn)出高E-cadherin 蛋白水平，低N-cadherin 和Vinmentin蛋白水平。有研究表明，EMT 是上皮細胞獲得間充質(zhì)特征從而獲得轉(zhuǎn)移能力的過程，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及治療抵抗有關(guān)［18］。以往研究發(fā)現(xiàn)，EMT過程發(fā)生的標志是高N-cadherin 和Vinmentin 水平，低E-cadherin 水平［19-20］。結(jié)合本研究結(jié)果表明miR-216a 過表達抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲和EMT 過程，暗示miR-216a 很有可能作為治療卵巢癌的潛在生物標志物。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)的miR-216a 在卵巢癌中的功能與現(xiàn)有研究結(jié)果并不相同［7］，推測其可能有多方面原因，其一：選用的卵巢癌患者組織具有差異，循環(huán)中的miRNA 水平不僅與腫瘤類型有關(guān)，還可能受到慢性疾病、炎癥等的影響；其二，單個miRNA 可以靶向調(diào)控上百個mRNA，根據(jù)不同靶基因的能力其表達趨勢可能不同；其三，miRNA 即使靶向相同的基因，在不同的轉(zhuǎn)移階段也會具有不同的結(jié)果。綜上，有必要對miR-216a 在卵巢癌中的作用機制進行深入探究。

本研究經(jīng)生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)，JAK2 可能是miR-216a 的靶標基因。經(jīng)雙熒光素酶結(jié)果證實，miR-216a 與JAK2 存在相互作用。另外，上調(diào)miR-216a 可顯著降低JAK2 蛋白水平，表明miR-216a 對JAK2 具有負向調(diào)控作用。據(jù)報道，JAK2 是蛋白酪氨酸激酶JAK 家族的成員之一，在腫瘤細胞中發(fā)揮著多種功能［21］。先前的研究表明，JAK2 在各種類型的癌癥中通過調(diào)節(jié)STAT3 發(fā)揮致癌基因的作用［22］。有研究表明，在結(jié)直腸癌細胞中，JAK2/STAT3 信號被激活后，癌細胞的增殖能力提高［23］；在食管鱗狀癌細胞中阻斷JAK2/STAT3 信號，可明顯抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲［24］。此外，已有研究證實，JAK2/STAT3 通路在卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移和EMT中起著關(guān)鍵作用［25］。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-216a表達可抑制JAK2、STAT3 蛋白水平及其下游靶標Slug 和Twist 蛋白表達。研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Slug和Twist 是人類卵巢癌中EMT 過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［26］。因此，筆者假設(shè)miR-216a 通過抑制JAK2 表達抑制JAK2/STAT3 通路激活進而抑制卵巢癌細胞的EMT 過程和轉(zhuǎn)移。進一步研究表明，JAK2 過表達部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-216a 對卵巢癌細胞的抗轉(zhuǎn)移作用，具有增強遷移、侵襲和EMT 進展的作用，這些數(shù)據(jù)有利地支持了上述假設(shè)。

綜上，本研究證明了miR-216a 的表達在卵巢癌組織中下調(diào)，miR-216a 可能通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲和EMT。這些發(fā)現(xiàn)為卵巢癌的靶向治療提供了新的觀點。但本研究未在其他卵巢癌細胞系和動物模型中進行同步驗證，后續(xù)仍需更全面的探究以完善miR-216a 在卵巢癌中的作用機制，以期為卵巢癌的治療提供新的思路。