土霉素治療豬附紅細(xì)胞體病小鼠模型的初步建立和驗(yàn)證

王 洋 韓金成 于 天 梁喜植 薛書江

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133002）

0 引言

豬附紅細(xì)胞體是引起豬傳染性貧血的重要病原體之一，患病豬常表現(xiàn)出黃疸、貧血、發(fā)熱、生殖障礙等臨床癥狀。豬附紅細(xì)胞體對(duì)所有年齡段的豬都易感。急性感染的仔豬在臨床上常因溶血性貧血及低血糖發(fā)生急性死亡。在自然條件下，豬附紅細(xì)胞體的急性感染情況較少，多為慢性感染。慢性感染的豬存在輕度貧血、生長速度降低、生殖性能變差等癥狀，并對(duì)呼吸系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)的病原體有更高的易感性。另有研究表明，感染豬附紅細(xì)胞體會(huì)引起母豬生殖能力下降、發(fā)情期延長、乳汁分泌障礙等。豬附紅細(xì)胞體病多呈隱性感染，患病動(dòng)物表現(xiàn)出的臨床癥狀不明顯，因此，該病常常被忽視，從而繼發(fā)感染其他病原體。繼發(fā)感染其他病原體的患病動(dòng)物表現(xiàn)出復(fù)雜的臨床癥狀，給臨床診斷帶來挑戰(zhàn)，且預(yù)后效果不佳，易復(fù)發(fā)，直接影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，加強(qiáng)豬附紅細(xì)胞體病防治研究意義重大。

相關(guān)文獻(xiàn)資料表明，土霉素是治療豬附紅細(xì)胞體病比較理想的抗生素藥物。然而，養(yǎng)殖中濫用抗生素會(huì)帶來諸多危害，如使病原體產(chǎn)生耐藥性，引起動(dòng)物免疫機(jī)能下降，甚至畜產(chǎn)品藥物殘留會(huì)威脅人類健康，因此，深入研究豬附紅細(xì)胞體病治療機(jī)制，找到豬附紅細(xì)胞體病無抗療法替代抗生素治療有重要意義。鑒于此，該試驗(yàn)初步建立土霉素治療豬附紅細(xì)胞體病小鼠模型，為豬附紅細(xì)胞體病抗生素替代藥物篩選和治療機(jī)制的深入研究提供助力。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑和儀器

質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Mini Kit I）、血液DNA提取試劑盒（Gel Extraction Kit）和菌體DNA全基因提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。豬外周血淋巴細(xì)胞分離液購自索萊寶公司。肝素鋰抗凝管、血液生化試劑盤購自吉林省博愛樂康商貿(mào)有限公司。胰蛋白胨、酵母淀粉、NaCl、瓊脂粉、枸櫞酸鈉、檸檬酸和葡萄糖等均購自寶生物工程（大連）有限公司。鹽酸土霉素購自上海生工生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與病原

清潔級(jí)4周齡昆明種小白鼠45只，體質(zhì)量在（23±1）g，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；豬附紅細(xì)胞體陽性血液采自延邊州某豬場；豬附紅細(xì)胞體分離和純化參照華修國采用的方法。弗格森埃希菌JL菌株由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定及 保存。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

對(duì)小鼠進(jìn)行尾尖采血，提取血液DNA，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。將PCR檢測(cè)鑒定無豬附紅細(xì)胞體感染的昆明種小白鼠平均分為3組，每組15只。A組為空白對(duì)照組，腹腔注射100 μL生理鹽水；B組為陰性對(duì)照組，腹腔注射100 μL濃度為1×10個(gè)/μL的豬附紅細(xì)胞體；C組為治療模型組，腹腔注射100 μL濃度為1×10個(gè)/μL的豬附紅細(xì)胞體，經(jīng)PCR檢測(cè)確認(rèn)感染，在接種豬附紅細(xì)胞體第4天肌內(nèi)注射土霉素，連續(xù)注射3 d（時(shí)間分別為接種豬附紅細(xì)胞體第4天、第5天、第6天），注射劑量為0.016 65 mg/g。

1.4 小鼠一般性臨床癥狀觀察

從接種第1天開始計(jì)，觀察整個(gè)試驗(yàn)周期（30 d）內(nèi)昆明種小白鼠的精神狀態(tài)及臨床癥狀。利用電子天平在接種第1天、第5天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天測(cè)量昆明種小白鼠的體質(zhì)量，記錄并計(jì)算每5 d昆明種小白鼠的平均日增質(zhì)量。利用電子體溫計(jì)在接種第1天、第4天、第7天、第10天、第13天、第16天、第19天、第21天、第24天、第27天、第30天測(cè)量昆明種小白鼠耳內(nèi)溫度，記錄整個(gè)試驗(yàn)周期昆明種小白鼠體溫變化情況。對(duì)平均日增質(zhì)量和體溫變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 小鼠血液樣本的PCR檢測(cè)

對(duì)各組昆明種小白鼠在接種后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天、第28天、第30天進(jìn)行尾尖采血。根據(jù)血液DNA提取試劑盒說明書提取DNA。采用于嘯洋建立的豬附紅細(xì)胞體PCR診斷方法對(duì)血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定各組小鼠的豬附紅細(xì)胞體感染情況。

1.6 小鼠的血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

在接種第7天，分別在A、B、C組隨機(jī)選取5只昆明種小白鼠進(jìn)行眼球采血。小鼠血液用肝素鋰抗凝，使用普朗醫(yī)療血液常規(guī)分析儀檢測(cè)小鼠血常規(guī)。用移液器吸取100 mL EDTA抗凝全血加入生化試劑盤中，將試劑盤放入斯馬特全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)各組小鼠血液生化指標(biāo)。

1.7 小鼠繼發(fā)感染弗格森埃希菌試驗(yàn)

根據(jù)相思宇對(duì)弗格森埃希菌LD的測(cè)定結(jié)果，在接種豬附紅細(xì)胞體第7天，分別在A、B、C組隨機(jī)選取5只昆明種小白鼠注射LD劑量的（2.944×10CFU）弗格森埃希菌，記錄各組動(dòng)物數(shù)、死亡數(shù)，計(jì)算死亡率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2010與SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，當(dāng)0.01＜＜0.05時(shí)，表示差異顯著；當(dāng)＜0.01時(shí)，表示差異極顯著；當(dāng)＞0.05時(shí)，表示差異不顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般性臨床癥狀觀察

在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，A組（空白對(duì)照組）小鼠無臨床癥狀；B組（陰性對(duì)照組）小鼠出現(xiàn)精神萎靡、扎堆、被毛逆立等臨床癥狀；C組（治療模型組）經(jīng)土霉素治療后小鼠臨床癥狀消失，恢復(fù)正常。

如表1所示，接種后5～10 d，與A組相比，B組小鼠平均日增質(zhì)量減少，差異極顯著（＜0.01）；C組與A組相比平均日增質(zhì)量差異不顯著（＞0.05）。其他時(shí)間，各組平均日增質(zhì)量均差異不顯著。結(jié)果表明，經(jīng)土霉素治療后，C組小鼠日增質(zhì)量減少有顯著改善。

表1 各組小鼠平均日增質(zhì)量測(cè)定結(jié)果 g/d

如表2所示，與A組相比，B組在接種后第4天體溫降低，第7～19天體溫升高，差異顯著 （＜0.05）；C組與A組相比體溫變化均差異不顯著。結(jié)果表明，經(jīng)土霉素治療后，C組小鼠體溫變化有顯著改善。

表2 各組小鼠體溫測(cè)定結(jié)果 ℃

2.2 小鼠血液樣本的PCR檢測(cè)

以模型小鼠血液DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，A組在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)并未檢測(cè)到特異性條帶，B組出現(xiàn)特異性條帶，C組治療前出現(xiàn)特異性條帶，治療后條帶消失，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 小鼠的血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)各組昆明種小白鼠進(jìn)行眼球采血，并進(jìn)行血常規(guī)及血液生化指標(biāo)檢測(cè)。如表3所示，與A組小鼠相比，B組小鼠白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板含量降低，差異極顯著 （＜0.01）；淋巴細(xì)胞百分比、血小板壓積減小，差異顯著（＜0.05）；血小板分布寬度增大，差異顯著 （＜0.05）。與B組小鼠相比，C組小鼠血紅蛋白含量和血小板含量顯著升高（＜0.01）。與A組小鼠比較，C組小鼠白細(xì)胞數(shù)量降低，差異極顯著 （＜0.01）；淋巴細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)降低，差異顯著 （＜0.05）。結(jié)果表明，豬附紅細(xì)胞體感染會(huì)引起小鼠白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板含量降低，淋巴細(xì)胞百分比、血小板壓積減小，血小板分布寬度增大，經(jīng)土霉素治療，淋巴細(xì)胞百分比、血紅蛋白含量、血小板含量、血小板壓積等指標(biāo)恢復(fù)正常，但白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)均未恢復(fù)正常。

表3 各組小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

如表4所示，與A組小鼠相比，B組小鼠球蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶含量顯著升高（＜0.05），白球比顯著降低（＜0.05）；與B組相比，C組小鼠球蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶含量降低，差異顯著（＜0.05）。結(jié)果表明，豬附紅細(xì)胞體感染會(huì)引起球蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶含量降低，白球比升高，可能對(duì)昆明種小白鼠肝臟造成損傷，從而引起機(jī)體黃疸，而土霉素針對(duì)豬附紅細(xì)胞體感染引起的癥狀能起到良好的治療作用。

表4 各組小鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.4 各組小鼠繼發(fā)感染弗格森埃希菌試驗(yàn)

如圖1所示，在感染高峰（豬附紅細(xì)胞體接種后第7天），與A組、C組相比，B組小鼠死亡率顯著升高（＜0.01）。結(jié)果表明，豬附紅細(xì)胞體感染后繼發(fā)感染弗格森埃希菌會(huì)提高昆明種小白鼠的死亡率，而經(jīng)土霉素治療后死亡率顯著降低。

圖1 豬附紅細(xì)胞體感染第7天繼發(fā)感染弗格森埃希菌 對(duì)昆明種小白鼠死亡率的影響

3 討論

該試驗(yàn)采用分離純化的豬附紅細(xì)胞體感染未切脾的昆明種小白鼠，豬附紅細(xì)胞體感染劑量為1×10個(gè)/只。對(duì)整個(gè)試驗(yàn)周期的昆明種小白鼠進(jìn)行精神狀態(tài)、體質(zhì)量及體溫監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，昆明種小白鼠感染豬附紅細(xì)胞體后出現(xiàn)精神萎靡、扎堆、被毛逆立等臨床癥狀；B組在豬附紅細(xì)胞體感染后5～10 d平均日增質(zhì)量顯著低于其他組，表明豬附紅細(xì)胞體感染導(dǎo)致昆明種小白鼠的日增質(zhì)量下降，與Messick等的研究結(jié)果一致；體溫監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，豬附紅細(xì)胞體感染能夠使昆明種小白鼠體溫異常，與前人研究一致。另外，Hoelzle等認(rèn)為傳統(tǒng)的抗生素和衛(wèi)生管控方法不能將豬附紅細(xì)胞體從感染豬體內(nèi)完全清除，雖然其臨床癥狀消失，但仍是豬附紅細(xì)胞體的隱性攜帶者。該試驗(yàn)感染豬附紅細(xì)胞體的昆明種小白鼠經(jīng)土霉素治療后，PCR檢測(cè)未出現(xiàn)特異性條帶。

血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，昆明種小白鼠感染豬附紅細(xì)胞體后，白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板含量降低，其余指標(biāo)無顯著性變化，治療模型組治療后白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)和粒細(xì)胞數(shù)并未恢復(fù)，其余指標(biāo)恢復(fù)正常。與王洋等研究不同的是，該試驗(yàn)B組小鼠血常規(guī)檢測(cè)中白細(xì)胞數(shù)量減少。豬附紅細(xì)胞體本身屬于血液系統(tǒng)疾病，主要侵害紅細(xì)胞，可使患病動(dòng)物免疫力下降，且該試驗(yàn)使用分離純化的豬附紅細(xì)胞體為感染源對(duì)昆明種小白鼠進(jìn)行急性感染，白細(xì)胞數(shù)量減少常出現(xiàn)于血液系統(tǒng)疾病和自身免疫系統(tǒng)疾病中，一些急性感染也可導(dǎo)致白細(xì)胞數(shù)量減少。因此，該試驗(yàn)檢測(cè)到的B組小鼠白細(xì)胞數(shù)量減少可能是由上述原因造成的。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果表明，豬附紅細(xì)胞體主要侵害骨髓和紅細(xì)胞，導(dǎo)致造血功能低下，出現(xiàn)貧血，這與Hoelzle等研究結(jié)果一致。以往研究并未對(duì)豬附紅細(xì)胞體感染小鼠的血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，多進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，該試驗(yàn)對(duì)各組小鼠進(jìn)行貧血和黃疸相關(guān)血液生化指標(biāo)檢測(cè)，以便更加全面地驗(yàn)證土霉素治療豬附紅細(xì)胞體病小鼠模型。B組小鼠的堿性磷酸酶（ALP）顯著升高，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)B組小鼠皮下輕微黃染，C組和A組小鼠無黃染現(xiàn)象，證明豬附紅細(xì)胞體能夠?qū)е聞?dòng)物體出現(xiàn)黃疸的臨床癥狀，經(jīng)土霉素治療后指標(biāo)恢復(fù)正常。這也進(jìn)一步說明該研究初步建立的土霉素治療豬附紅細(xì)胞體病小鼠模型是成功的。

豬附紅細(xì)胞體多呈隱性感染，容易繼發(fā)感染其他病原體，繼發(fā)感染其他病原體的患病動(dòng)物表現(xiàn)出復(fù)雜的臨床癥狀，為該病的診療帶來極大的困難。為了模擬現(xiàn)實(shí)中的繼發(fā)感染，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)了小鼠繼發(fā)感染試驗(yàn)。由于弗格森埃希菌具有致病力弱、環(huán)境常在、人畜共患、條件致病等特點(diǎn)，更能凸顯出治療豬附紅細(xì)胞體病對(duì)小鼠的影響，且更接近現(xiàn)實(shí)環(huán)境，因而選擇弗格森埃希菌作為再次感染病原。結(jié)果表明，經(jīng)土霉素治療后，感染豬附紅細(xì)胞體的小鼠死亡率與未感染豬附紅細(xì)胞體的小鼠死亡率差異不顯著。這也進(jìn)一步驗(yàn)證該研究初步建立的治療模型是成功的。

綜上，該研究初步建立了土霉素治療豬附紅細(xì)胞體病小鼠模型，并在一般指標(biāo)、臨床癥狀、血液學(xué)指標(biāo)和繼發(fā)感染等方面驗(yàn)證了土霉素治療豬附紅細(xì)胞體病小鼠模型的成功。該模型可為豬附紅細(xì)胞體病治療藥物的篩選和該病治療機(jī)制的研究提供參考數(shù)據(jù)。