河南新鄉(xiāng)某規(guī)?；i場豬口蹄疫抗體水平檢測分析

饒丹

（信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽 464000）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種接觸性傳染病，發(fā)病急、傳播迅速、范圍廣泛，主要感染豬、牛等偶蹄類動物，通過接觸傳播或空氣傳播，主要特點(diǎn)以口舌黏膜、皮膚、蹄部形成糜爛、潰瘍病灶為主[1]。該病是危害養(yǎng)豬業(yè)及其他畜牧行業(yè)的重要傳染病之一，通常不表現(xiàn)臨床癥狀的仔豬會突然死亡，病死率很高（嚴(yán)重時可達(dá)100%，尤其是14日齡以下的幼仔），也是現(xiàn)今危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病，給畜牧業(yè)造成了很大的損失。

口蹄疫病毒是單股正鏈RNA病毒，為正二十面體球形，包含一個開放閱讀框（ORF）翻譯成四種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和八種非結(jié)構(gòu)蛋白（Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3Cpro和3Dpol）。其中，結(jié)構(gòu)蛋白在宿主免疫調(diào)節(jié)中有著重要的作用，VP1高度可變，VP2和VP3相對保守，VP4高度保守。VP1和VP3的作用是抑制宿主產(chǎn)生干擾素以削弱宿主抗病毒的能力，VP2參與誘導(dǎo)自噬[2]。

本研究以新鄉(xiāng)某規(guī)?；B(yǎng)豬場不同階段豬只為研究對象，隨機(jī)采集妊娠前期、妊娠中期、妊娠后期、20日齡仔豬、50日齡保育豬、90日齡育肥豬和150日齡育肥豬血液樣本各30份，分離血清，用ELISA方法對不同階段豬的血清進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，了解該規(guī)?；i場不同豬只口蹄疫抗體水平，對免疫程序進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，為該規(guī)?；i場豬口蹄疫的防控提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

根據(jù)新鄉(xiāng)某規(guī)?；B(yǎng)豬場的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖方式，隨機(jī)采集妊娠前期、妊娠中期、妊娠后期、20日齡仔豬、50日齡保育豬、90日齡育肥豬和150日齡育肥豬血液樣本各30份，檢測口蹄疫的抗體水平。

1.1.2 試劑

豬口蹄疫O型抗體ELISA診斷試劑盒，豬口蹄疫A型抗體ELISA診斷試劑盒，均購自IDEXX公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫背景

新鄉(xiāng)某規(guī)?；i場（1 000頭母豬）豬口蹄疫的免疫程序如下：母豬分別在2月、6月和10月份各免疫1次，頸部肌肉注射2 mL。63日保育豬齡首免，91日齡育肥豬二免。

1.2.2 血液采集

豬站立保定方式采集血液。一般采集3～4 mL。取血后，將采血管在室溫下靜置2 min，待血凝后，將血樣及時帶回實(shí)驗(yàn)室提取血清備用（運(yùn)輸過程中避免血液過度晃動）。

1.2.3 分離豬血清

在試驗(yàn)過程中，要提前準(zhǔn)備相應(yīng)的移液槍和經(jīng)過高溫滅菌的槍頭。將接種過豬口蹄疫疫苗的豬血在常溫下混合均勻，并預(yù)先標(biāo)記出所需離心管和豬血樣的序號。使用移液槍將豬血注入離心管中，再放入微型離心機(jī)中，3 500～4 000 rpm離心5～10 min。取分離后的上清液，置于冰箱內(nèi)低溫保存?zhèn)溆?。在操作過程中應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.2.4 血清抗體檢測方法

按照試劑盒嚴(yán)格操作。具體步驟；①用去離子水將10倍濃縮的PBS-吐溫進(jìn)行稀釋；用ELISA稀釋緩存液將10倍濃縮的酶標(biāo)抗體進(jìn)行稀釋。②將2個孔中分別加入2個不同稀釋度的陽性對照血清(1/10、1/30)，然后進(jìn)行稀釋，在4個相對應(yīng)的孔中分別加入50 μL陰性對照，在2個相對應(yīng)孔中分別加入50 μL 1/10倍和1/30倍稀釋的陽性對照。反應(yīng)1 h。③每個孔內(nèi)均加入25 μL稀釋后的HRPA/O-結(jié)合物；反應(yīng)1 h。④每孔分別加入200 μL的洗滌液，在常溫靜置3 min，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)3次，最后一次靜置5 min；然后將塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。⑤在所有的孔中分別加入50 μL的底物/顯色液；常溫下避光靜置20 min，從加入第1孔時開始計(jì)時。⑥按照每孔加入底物溶液的順序，分別加入50 μL終止液。⑦用熒光酶標(biāo)儀在450 nm的波長下讀取每個孔的OD值，并計(jì)算阻斷率。

1.2.5 合格標(biāo)準(zhǔn)

阻斷率≥50%時為陽性；阻斷率＜50%時為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬A型口蹄疫抗體水平結(jié)果與分析

2.1.1 妊娠期母豬A型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果與分析

通過表1所示，母豬妊娠前期A型口蹄疫抗體的陽性率為93.3%，妊娠中期陽性率為96.6%，妊娠后期的陽性率為100%；妊娠前期離散度為15.46%，妊娠中期離散度為10.6%，妊娠后期離散度為13.34%。說明這批母豬A型口蹄疫抗體水平較高，個體之間抗體水平差異不大且相對穩(wěn)定。

表1 妊娠母豬A型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果

2.1.2 仔豬和保育豬A型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果與分析

由表2可知，20日齡仔豬A型口蹄疫抗體陽性率為86.6%，離散度為15.25%，表明整體A型口蹄疫抗體水平合格，個體間差異不大，能抵御A型口蹄疫野毒感染；50日齡保育豬A型口蹄疫抗體陽性率為50%，離散度為14.48%，表明50日齡保育豬群整體母源抗體水平在逐漸下降，目前母源抗體水平仍較高，不用進(jìn)行首免。

表2 仔豬和保育豬A型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果

2.1.3 育肥豬A型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果與分析

由表3可知，90日齡育肥豬A型口蹄疫抗體陽性率為86.6%，離散度為11.1%，150日齡育肥豬陽性率為90%，離散度為14.96%。說明這批育肥豬豬A型口蹄疫抗體水平較高，個體之間抗體水平差異不大且相對穩(wěn)定。

表3 育肥豬A型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果

2.2 豬O型口蹄疫抗體抗體水平結(jié)果與分析

2.2.1 妊娠母豬O型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果與分析

由表4可知，母豬妊娠前期、妊娠中期、妊娠后期O型口蹄疫抗體陽性率均為100%，妊娠前期離散度為4.8%，妊娠中期離散度為7.8%。妊娠中期離散度為6.98%。表明3個階段整體抗體水平較高，個體間差異不大。

表4 妊娠母豬O型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果

2.2.2 仔豬和保育豬O型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果與分析

由表5所示，20日齡仔豬O型口蹄疫抗體陽性率為100%，離散度為12.32%；表明抗體水平較高，能抵御野毒感染；50日齡保育豬陽性率為76.66%，離散度為24.41%，表明O型口蹄疫抗體水平逐漸下降，但抗體水平較高，說明50日齡保育豬不用進(jìn)行O型口蹄疫疫苗首免。

表5 仔豬和保育豬O型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果

2.2.3 育肥豬O型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果與分析

通過表6可看出，90日齡育肥豬O型口蹄疫抗體陽性率為100%，離散度為10.47%，150日齡育肥豬陽性率為100%，離散度為17.18%。說明這批育肥豬O型口蹄疫抗體水平較高，個體之間抗體水平差異不大且相對穩(wěn)定。

表6 育肥豬O型口蹄疫抗體水平檢測結(jié)果

3 討論

口蹄疫是一種傳染性極強(qiáng)的病毒性疾病，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失重大，目前防控口蹄疫仍以接種滅活疫苗為主。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的《國家動物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見（2022—2025年）》規(guī)定口蹄疫免疫抗體合格率需常年保持在70%以上[3]，表明通過檢測口蹄疫抗體水平評價養(yǎng)殖場動物免疫情況尤為重要。

本研究針對新鄉(xiāng)某規(guī)?；i場進(jìn)行了豬口蹄疫抗體水平監(jiān)測，為了從總體上了解該養(yǎng)殖場豬口蹄疫抗體水平，本試驗(yàn)采用常規(guī)的ELISA方法對該規(guī)?；i場不同階段豬群采血，分離血清，檢測血清中抗體水平，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果得知；A型、O型口蹄疫抗體檢測中妊娠期陽性率都在90%以上，離散度低于30%，說明妊娠階段母豬口蹄疫抗體水平達(dá)到國家要求標(biāo)準(zhǔn)（70%以上），表明免疫情況良好。王慧等[4]研究表明，豬胎盤是上皮絨毛膜類型，豬在胎兒時期不能從母體獲得母源抗體，新生仔豬通過吮吸初乳經(jīng)消化道吸收獲得母源抗體。母源抗體可以保護(hù)初生仔豬免受病原侵襲，在提高仔豬抗病力和成活率方面發(fā)揮著重要作用。在O型口蹄疫和A型口蹄疫抗體檢測中20日齡仔豬吮吸母乳獲得母源抗體，且抗體水平較高，A型86.6%，O型100%，說明仔豬能抵御野毒感染。呂立新等[5]研究表明，仔豬30日齡后母源抗體平均效價逐步下降，到60日齡已進(jìn)入敏感區(qū)，此時需要根據(jù)豬只抗體水平及時接種疫苗。本研究顯示，A型口蹄疫母源抗體陽性率由20日齡的86.6%下降至50日齡的50%，O型口蹄疫母源抗體陽性率由20日齡的100%下降至50日齡的76.6%，抗體陽性率雖持續(xù)下降，但仍處于安全保護(hù)期內(nèi)。故該豬場在保育豬63日齡進(jìn)行首免合理。A型口蹄疫檢測中90日齡育肥豬陽性率為86.6%，150日齡育肥豬陽性率為90%；O型口蹄疫檢測90日齡和150日齡育肥豬陽性率均為100%，說明二免前和二免后豬只抗體水平較好，豬只能夠抵御野毒感染的風(fēng)險。故該豬場91日齡進(jìn)行二免合理。本研究顯示O型口蹄疫疫苗免疫抗體水平高于A型，該結(jié)果和陳一峰[6]的研究結(jié)果一致。說明以后防控中需留意A型口蹄疫的抗體水平，及時監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)問題及時調(diào)整。

接種滅活疫苗雖然是最有效的控制策略，但是FMDV對酸和熱的敏感性較高，導(dǎo)致在豬的運(yùn)輸過程中存在一定感染風(fēng)險。隨著我國社會發(fā)展，科學(xué)家們通過高溫傳代、擴(kuò)增、純化獲得了一種熱穩(wěn)定的FMDV突變體（VP1第13位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸）可以穩(wěn)定口蹄疫病毒衣殼，F(xiàn)MDV突變體在中和抗體滴度方面表現(xiàn)出更高的免疫原性[7]，確保了疫苗接種保護(hù)率的同時在運(yùn)輸過程中提升了疫苗的穩(wěn)定性，降低了運(yùn)輸成本。

疫苗的接種效果受佐劑和接種部位的影響，現(xiàn)在市面上口蹄疫疫苗的佐劑都是油佐劑，對豬免疫后有較大的副反應(yīng)，造成局部炎癥、肉芽腫的形成。研究表明，AEAR（免疫調(diào)節(jié)多糖）作為FMDV滅活疫苗的佐劑，在小鼠的動物實(shí)驗(yàn)中取得了突破進(jìn)展，AEAR顯著誘導(dǎo)FMDV特異性抗體滴度和淋巴細(xì)胞活化。中劑量AEAR通過CD4+T細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ刺激Th1/Th2型應(yīng)答。AEAR顯著升高有效T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。重要的是，AEAR顯著激發(fā)了高效的CTL反應(yīng)。誘導(dǎo)FMDV特異性抗體滴度和淋巴細(xì)胞活化[8]，作為新一代口蹄疫滅活疫苗的中藥佐劑，在未來的發(fā)展中有著重要的作用。此外，疫苗的皮內(nèi)（ID）接種被認(rèn)為是一種有效且高效的牲畜疫苗接種方式，ID疫苗接種有可能節(jié)省FMD疫苗的生產(chǎn)成本，與肌內(nèi)（IM）途徑相比，較低的抗原含量可有效地在豬和牛中產(chǎn)生保護(hù)性免疫，與使用注射針相比，使用無針遞送系統(tǒng)進(jìn)行ID疫苗接種可以更有效、更安全、更快速地對更多動物進(jìn)行疫苗接種，在無針I(yè)D疫苗接種可以排除肌肉中肉芽腫的形成。減少生產(chǎn)成本提高豬肉利用率[9]。

盡管DNA疫苗的免疫原性不理想，與傳統(tǒng)疫苗相比，存在免疫原性不足的問題，但它們?nèi)员徽J(rèn)為是常規(guī)疫苗的潛在替代候選疫苗。因?yàn)樗胁淮嬖跍缁畹膯栴}，有更高的安全性，更長的保質(zhì)期。同時，DNA疫苗可以攜帶針對不同血清型或新出現(xiàn)毒株的多種保護(hù)性抗原表位，導(dǎo)致交叉保護(hù)性免疫增強(qiáng)。各種DNA遞送系統(tǒng)，包括納米顆粒，已被廣泛探索和驗(yàn)證，以進(jìn)一步增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。DNA疫苗被認(rèn)為是替代疫苗候選者，研究表明，PLGA納米粒子會促進(jìn)與細(xì)胞膜的靜電相互作用隨后往細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)抗原表達(dá)。與普通的FMD滅活疫苗相比引發(fā)更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。